Proyección de imagen del tejido retiniano puede proporcionar información de unicelulares que no se desprende de los métodos bioquímicos tradicionales. Este protocolo describe la preparación de rodajas de retinales de pez cebra para la proyección de imagen confocal. Fluorescentes genéticamente codifican sensores o indicador tintes permiten visualización de numerosos procesos biológicos en los tipos de células retinianas distintas.
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Artículo de método
Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos
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Resumen
Resumen
La retina es un tejido complejo que inicia e integra de los primeros pasos de la visión. Disfunción de células de la retina es una de muchas enfermedades cegadoras y terapias futuras dependen de entendimientos fundamentales sobre cómo diferentes de la retina las células funcionan normalmente. Obtener esa información con métodos bioquímicos ha demostrado ser difícil porque las contribuciones de los tipos de la célula particular se disminuyen en el ambiente de células retinianas. En proyección de imagen retiniana puede proporcionar una vista de los numerosos procesos biológicos a nivel subcelular, gracias a un número creciente de biosensores fluorescentes genéticamente codificados. Sin embargo, esta técnica hasta el momento se ha limitado a los renacuajos y larvas de pez cebra, las capas más externas de la retinales de retinas aisladas, o proyección de imagen de resolución baja de retinas en animales vivos. Aquí presentamos un método para generar vivo ex vivo rebanadas de retina de pez cebra adulto vivo imagen mediante microscopía confocal. Esta preparación rinde rebanadas transversales con todas las capas retinianas y más tipos de células visibles para realizar experimentos de proyección de imagen confocales mediante perfusión. Pez cebra transgénico expresando proteínas fluorescentes o biosensores en tipos de células retinianas específicas u organelos se utilizan para extraer información de unicelular de una retina intacta. Además, rebanadas de retinales se pueden cargar con indicador fluorescente tintes, añadiendo a la versatilidad del método. Este protocolo fue desarrollado para la proyección de imagen Ca2 + en fotorreceptores del cono de pez cebra, pero con los marcadores adecuados podría adaptarse para medir Ca2 + o metabolitos en células de Müller, células bipolares y horizontales, microglia, células amacrinas o retina células del ganglio. El epitelio retiniano del pigmento se retira de rebanadas por lo que este método no es adecuado para el estudio de ese tipo de célula. Con la práctica, es posible generar seriales rebanadas de un animal para experimentos múltiples. Esta técnica adaptable proporciona una poderosa herramienta para responder a muchas preguntas sobre biología celular retiniana, Ca2 +y homeostasis de la energía.
Introducción
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en ampliamente utilizado en investigación científica básica y médica1, debido a su tamaño pequeño, rápido desarrollo y sistemas de órganos vertebrados. La transparencia natural de larvas de pez cebra combinado con métodos establecidos para transgénesis han permitido la visualización detallada de los procesos celulares en un animal vivo. Una serie de biosensores fluorescentes genéticamente codificados ha sido blanco específico de pez cebra células para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrógeno3, activación de apoptosis4 y ATP5.
En vivo la proyección de imagen de larvas de pez cebra ha llevado a avances en el campo de las neurociencias, incluida la asignación de cerebro los circuitos6 y7trastornos del desarrollo de medicamentos para el sistema nervioso central. Pez cebra son muy adecuadas para la investigación de visión porque sus retinas la estructura laminar y tipos de neuronas de vertebrados superiores, y muestran comportamientos visual robusto8,9. Varios tipos de degeneraciones retinianas análogas a la enfermedad en humanos han sido modelados con éxito y estudió en el pez cebra10,11, incluyendo proyección de imagen viva de los fotorreceptores individuales degeneren en una retina de2, 12.
Mientras que en vivo imágenes de larvas de pez cebra es una valiosa herramienta, se convierte en más difícil como peces crecen y desarrollan la pigmentación, y algunos tratamientos farmacológicos pueden impregnar un animal entero. Además, ciertos procesos celulares cambian con desarrollo y edad, haciendo más adelante momentos críticos para la función de la comprensión y la progresión de la enfermedad en animales adultos. Métodos bioquímicos como inmunoblot, quantitiative PCR, el consumo de O2 y análisis metabolómicos pueden proporcionar pistas importantes sobre la biología de la retina en su totalidad, pero es difícil distinguir las contribuciones individuales de tipos de células afectadas por de la enfermedad. Imagen tejido retiniano aislado ex vivo pasa por alto estas cuestiones y mientras que la proyección de imagen plana montados retinas ofrece una vista de la retina externa13, características retinianos internos más profundo se oculta. Rebanadas de retina transversal, tales como los presentados en análisis immunohistochemical, permiten una visión clara de todas las capas y tipos de la célula pero nadamas una sola instantánea de los procesos dinámicos implicados en la enfermedad y la función normal.
Aquí, presentamos un método para generar ex vivo transversal rebanadas de retina de pez cebra adulto para la proyección de imagen. Es similar a los métodos para la preparación de rodajas de retina de anfibios y peces cebra para estudios electrofisiológicos y morfológicos14,15, con modificaciones importantes para lapso de tiempo de imagen ex vivo con confocal microscopia. Respuestas de fluorescencia de biosensores o tintes en rodajas son monitoreadas en tiempo real con un microscopio confocal mientras que entregan los agentes farmacológicos mediante perfusión. Mientras que el método fue desarrollado por fotorreceptores la proyección de imagen, puede ser factible utilizar para visualizar las células de Müller, células bipolares, células horizontales, células amacrinas o las células ganglionares de la retina con marcadores fluorescentes apropiados. Además, se pueden cargar rebanadas con tintes fluorescentes permeable a la célula a la viabilidad celular de informe, transporte vesicular, función mitocondrial o estado redox. Esta preparación permite la visualización de una amplia gama de procesos subcelulares a lo largo de la retina, incluyendo dinámicas de Ca2 + , transduction de la señal y estado metabólico.
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Protocolo
Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Washington institucional Animal Care y Comité de uso.
1. preparación de animales y equipos
Nota: El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es una hoja oscura de tejido que rodea el exterior de la retina cuya pigmentación puede ocultar características retinianas y daño del tejido cuando confocal ex vivola proyección de imagen. En la oscuridad, el RPE del pez cebra se retrae de la retina; oscuro se adaptan pescado para facilitar la extracción futura del RPE de la retina antes de corte y proyección de imagen.
- Transferencia de peces a un tanque de desove llenado con agua de pescado y luego Envuelva el tanque de desove con la tela oscura o colocarlo en un gabinete oscuro.
- Oscuro se adaptan pez cebra durante al menos 1 h antes de la eutanasia para permitir cerca de separación completa del RPE de la retina. adaptación de la oscuridad de 30 min es suficiente para eliminar la mayoría RPE, aunque pedazos de él pueden quedar intercalados entre fotorreceptores.
- Derretir ~ 15 mL de petróleo gelatina en un vaso de precipitados de 50 mL en una placa caliente y dibuje 3 mL del líquido en una jeringa de punta slip de 3 mL. Invertir la jeringa, colocar en un bastidor de tubo de ensayo y permitir a jalea de petróleo para enfriar.
- Hacer una cámara reutilizable de corte en un portaobjetos de microscopio simple de 7 X 2,5 cm.
- Usar esmalte de uñas claro, las líneas estrechas de la pintura para crear un rectángulo de 3 cm X 2,5 cm en el centro de la diapositiva, deje que se seque y luego agregar otra capa de esmalte de uñas a las líneas.
- Preparar imágenes escaleras en cubreobjetos para sostener rodajas durante proyección de imagen. Las rebanadas forman los "peldaños" de la escalera.
- Para la proyección de imagen estática o experimentos de inyección con flujo de la solución mínima, hacen escaleras de vaselina que consiste en dos tiras de plano ancho paralelas de vaselina sobre cubreobjetos de cristal cuadrado de 18 mm. Utilice la jeringa para aplicar dos aplanada ~ 1 cm largo los borrones de transferencia de vaselina por 0,5 cm de separación en la hoja de cubierta.
- Listo la máquina de cortar tejido.
- Limpiar una hoja de afeitar de doble filo con etanol y déjelo al aire seco. Córtela en cuartos con las tijeras, primero longitudinalmente en dos mitades y luego en cada hoja.
- Coloque la cámara de corte en el escenario de la máquina de cortar tejido, centro horizontalmente en el escenario y marcan un canto largo con marcador permanente para la alineación.
- Cargar una sección de la hoja en el brazo de la máquina de cortar de tejido, asegúrese que la cuchilla se encuentra plano y centrado en el portaobjetos sin tocar el esmalte de uñas, luego apriete suavemente el aparato de la hoja. Baje el brazo de la cuchilla mediante el ajuste de la perilla ¼ vuelta, entonces lugar un trozo de papel de filtro en el centro de la proyección de imagen de la cámara y prueba de corte. Si el papel no se corta a través, volver a montar la cuchilla.
- Usando la jeringa, colocar un punto pequeño de vaselina refrescado en un plato de Petri de 10 cm ~ 1,5 cm a la derecha del centro. Pulse una imagen escalera en ella con pinzas con la jalea de petróleo hacia arriba. Hacer otra pequeña vaselina punto ~ 1 cm desde el borde de entrada de la cámara de proyección de imagen.
- Montar la jeringa de vaselina con una aguja de 20g y lo destape. Mantenga la aguja sobre la jeringa y se usa para hacer dos tiras paralelas largo y fino de 1 cm de vaselina a lo largo en el centro de la cámara de corte. Espacio de las tiras de ~ 1 cm de separación.
- Hacer una herramienta de lazo de ojo de cable reutilizable envolviendo el centro de un ~ segmento de 4 cm de alambre de tungsteno de 30 g alrededor de un par de pinzas cerrada una vez. Ajustar el diámetro del lazo deslizando el cable hacia arriba o hacia abajo de las pinzas hasta que esté ligeramente más grande que un ojo de pez cebra, típicamente ~ 2-3 mm. retuerza los extremos del alambre y asegurar al final de un palo de madera de 6 cm con cinta de laboratorio.
- Preparar solución de Ringer.
- Descongelar 50 X suplemento solución (tabla 1) y añadir fresco a solución de Ringer tamponada con HEPES, no bicarbonato (tabla 2) la mañana del experimento; Diluya 200 μL de solución stock de suplemento en cada 10 mL de solución de Ringer en un tubo de centrífuga cónico o una botella de vidrio estéril. Para los experimentos de imagen estática, preparar por lo menos 30 mL de solución de Ringer por experimento. El volumen de solución de Ringer para experimentos de perfusión dependerá de la velocidad de flujo y tiempo total del experimento.
- Compruebe que el pH de la solución suplementado es usando una sonda de pH digital o papel de pH de 7.4 y ajustar en consecuencia a diluir NaOH o HCl.
- Oxigenar la solución de Ringer suplementado en hielo por burbujas de gas de oxígeno 100% durante al menos 5 minutos utilizando un regulador con una manguera y tanque de oxígeno médico estándar, o el colector de burbujeador de gas opcional para perfusión. Almacene la solución de Ringer oxigenada en el hielo en un tubo de centrífuga cónico sellada o en frasco estéril cerca del microscopio de disección; Utilice esta solución para la disección, la proyección de imagen y para diluir los tintes o agentes farmacológicos.
- Si se utilizan otras soluciones en el experimento, como Na+-libre de solución de Ringer (tabla 3), repita los pasos 1.9.1.-1.9.3.
- Recoger platos de Petri, pinzas, micro tijeras y otras herramientas cerca del microscopio de disección y preparar un baño de hielo de agua de peces para la eutanasia de peces cebra.
2. preparar rodajas retinianas (véase figura 1)
- Trabajar bajo luz ambiente para minimizar la adaptación a la luz (que puede hacer el palillo del RPE más firmemente a la retina), eutanasia pez cebra por inmersión en el baño de hielo hasta que se pierde la respuesta táctil, normalmente 1-2 min transferir el pescado a un plato de Petri y utilizar un bisturí para dislocarse cervical pero no descabezar el pescado.
- Utilice el bucle de alambre para aflojar el tejido conectivo alrededor de un ojo y luego tire hacia adelante el ojo suavemente con el lazo en una mano. Utilizando micro tijeras en la otra mano, corte del nervio óptico blanco debajo del ojo, teniendo cuidado de no para cortar la parte posterior del ojo.
- Transferir el ojo con unas pinzas a un plato de Petri, solución de Ringer frío en hielo y repita para el segundo ojo. Mantener los ojos en la oscuridad o bajo luz roja hasta que el RPE se retira de la retina.
- Diseccionar las ojeras bajo un microscopio de disección de bajo poder en una gota de solución de Ringer frío sobre un portaobjetos de vidrio llano en una placa Petri.
- Perforar la córnea con unas pinzas finas, a continuación, retire suavemente los trozos del claro, quebradizo y esclera plateada con pinzas o tijeras. Retire y deseche el objetivo y la mayor parte de la esclerótica (véase figura 1A) y el ocular aislado como mínimo.
- Pedazos de grasa, trocitos de esclera y negro RPE pueden permanecer Unidos a la ojera y quitado más adelante de la retina. Si la retina se separa del RPE en paso 2.4.1, proceder con los mismos pasos con precaución para no dañar la delicada retina aislada.
- Coloque el lado abierto de la ojera hacia abajo (RPE para arriba) en la diapositiva y cortar en tercios o cuartos con una cuchilla de filo único fresco en un solo movimiento (ver figura 1B). Descartar piezas de tejido que son muy curvas.
- Montaje plano de retina en papel de filtro.
- Moje un pedazo de papel de filtro con solución de Ringer y colocar en la diapositiva junto a las piezas del cilindro. Use pinzas planas al manipular el papel de filtro húmedo intacto para evitar pincharlo. Añadir solución de Ringer frío para cubrir el papel filtro y el tejido.
- Cuidadosamente usando pinzas en cada mano, arrastre el papel de filtro debajo de cada pieza ocular con el EPR y fotorreceptores hacia arriba, es decir, con la parte posterior del ojo hacia arriba. Coloque las piezas del ocular en una sola línea a lo largo del centro del papel filtro (ver figura 1). Manejar las piezas ocular suavemente con unas pinzas finas sólo cerca de un borde o esquina.
- Para ayudar a retinas se adhieren al papel de filtro, colocar el papel filtro húmedo en una toalla de papel seca para 3 s absorberá humedad hacia abajo, pero no deja que el tejido sea seco. Repita hasta que las piezas del cilindro se encuentran en el papel de filtro. Aplicando una succión suave en la parte inferior del papel filtro ayuda a aplanar la retina, pero este paso no es esencial.
- Si negro hojas de RPE se quedan en las piezas del cilindro, utilice pinzas finas pelar suavemente lejos a partir de una esquina (ver figura 1) mientras que el tejido está sentado en una gota de solución de Ringer. Debe la retina levantar el papel de filtro, repito el paso mecha en 2.5.3. La retina puede aparecer rosada por los pigmentos visuales sin blanquear.
- Repita la disección de la retina y planos de montaje medidas en 2.4-2.6 para el segundo ojo, si lo desea, manteniendo la primera retina plana montada inmersa en solución de Ringer frío. Para agilizar el procedimiento de corte, piezas de ambas retinas se pueden colocar en un papel de filtro. Una vez que se ha eliminado el RPE, el protocolo puede realizarse bajo la luz de la habitación normal a menos que experimentos requieren oscuridad.
- Coloca el papel filtro sobre un portaobjetos y recortar en un rectángulo con un solo filo, dejando ~ 0,5 cm de papel de filtro a cada lado de la línea de retinas. Hacia el papel de filtro de la cámara preparada de corte, empuje los bordes de papel de filtro largo de las líneas fina de vaselina con unas pinzas y sumerja las retinas en 3-4 gotas de solución de Ringer frío.
Nota: Algunos colorantes, tales como colorantes lipofílicos, se cargan mejor en montajes planos en esta etapa antes de rebanar. Estos pueden ser cargados, malvados lejos con un pañuelo y lava en la cámara de corte. Por ejemplo, C12 558/568 BODIPY manchas intensamente retiniana de la célula membranas y segmentos externos del fotorreceptor (ver Figura 4A) cuando carga en ~ 5 μg/mL durante 15 min a temperatura ambiente (típicamente 23-27 ° C), seguido de un lavado en solución de Ringer exceso . - Transferencia de la cámara de corte para la etapa de cortar tejido, coloque el borde largo a lo largo de la línea marcada y fije los extremos de la cámara al escenario con la cinta de laboratorio. A partir de un extremo, corte la retina y el papel de filtro, ejerciendo una presión firme y suave en el brazo de corte. Compruebe que el primer segmento fue cortado completamente, entonces use el micrómetro para cortar ~ 400 μm rebanadas.
- Ensamble la escalera por imágenes.
- Lugar la cámara de corte con secciones retinianas en rodajas en el plato de Petri del paso 1.7 adyacente a la proyección de imagen de escalera (ver Figura 1E). Llene el plato con solución de Ringer frío para sumergir su contenido.
- Con unas pinzas y mantener sectores sumergidos, transferir suavemente las tiras de papel de filtro y de la retina a la escalera deslizando la caja Petri de izquierda a derecha. Tenga cuidado de no para tocar la retina directamente. Gire las rebanadas de 90° y enterrar los bordes del papel de filtro en vaselina.
- Finalmente coloque rebanadas retinianas en la escalera con pinzas para que capas retinianas son claramente visibles bajo el microscopio de disección (ver figura 1). Para rebanadas en cada extremo de la escala, asegúrese de que el tejido quede hacia adentro hacia las otras rebanadas para minimizar el movimiento del tejido durante la inyección o flujo. Deseche cualquier retinales sectores que no están bien adheridos al papel de filtro (ver figura 2A).
- Si lo desea, carga colorantes en rodajas retinianas en esta etapa y lavar en solución de Ringer exceso antes de la proyección de imagen.
Nota: Yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33342 robusta mancha de núcleos de muertos y todas las células, respectivamente (ver figura 2B), cuando se incuban con rebanadas de retinales a 5 μg/mL durante 20 min a temperatura ambiente. Tetramethylrhodamine (TMRM) se acumula en las mitocondrias respiran activamente a lo largo de la retina cuando se incuban en 1 nM durante 30 min a temperatura ambiente. - Mientras que las rebanadas están manchando, preparar el aparato de inyección y cámara de proyección de imagen. Utilice la jeringa para lavar el tubo con solución de Ringer purgar burbujas, conecte el extremo abierto de la tubería a la entrada de cámara imagen y cerrar la llave de paso. Retire la jeringa y llenar con reagent(s) para la inyección, después lo vuelva a colocar a la tubería.
- Use pinzas para transferir el cubreobjetos con las rebanadas de la retinales a la cámara de proyección de imagen, presiona el cubreobjetos en el punto de jalea de petróleo cerca del borde de entrada de la cámara de proyección de imagen (ver figura 1 H). Llene la cámara de proyección de imagen con solución de Ringer para cubrir las rebanadas.
3. la proyección de imagen retinianas rebanadas
- Coloque la cámara llenada de imágenes con el aparato de inyección conectado en el escenario de un microscopio confocal vertical equipado con un 20 o 40 X lente de inmersión. Asegure la cámara de proyección de imagen con los clips de la etapa.
- Baje el lente de inmersión sobre la escalera y centrarse en un segmento en un extremo de la escala bajo la tenue luz trans iluminado. Examinar cada rebanada de orientación transversal, presencia de segmentos externos del fotorreceptor y la adherencia segura para el papel de filtro.
- Seleccione el mejor segmento para obtener imágenes de lapso de tiempo y configurar el software del microscopio para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Tabla 4 describe la configuración de imagen típicos para varios marcadores fluorescentes y tintes.
Nota: La tasa de adquisición de la imagen variará dependiendo el proceso biológico en estudio, microscopio y marcador fluorescente. Por ejemplo, utilizar resolución de 800 x 800 píxeles, velocidad de exploración de 2 μs/pixel y una velocidad de fotogramas de 10-s para la proyección de imagen dinámica del calcio en fotorreceptores con GCaMP3 y un colorante rojo.- Si está disponible, utilice el software para rastrear señales físicas en la rebanada (segmentos externos del fotorreceptor, cuerpos celulares, núcleos) a la ayuda potencial reorientación durante el lapso de tiempo. También configurar el software para controlar fluorescencia en tiempo real a través de la rebanada.
- Comienza la proyección de imagen y monitor de referencia fluorescencia. Cuando la fluorescencia a través de la rebanada se estabiliza (normalmente dentro de 2-5 min), continuar con el experimento. Para la inyección, abrir la llave de paso de la jeringa, luego lentamente Presione y tire hacia atrás del émbolo dos veces para facilitar la mezcla.
Nota: por ejemplo, abolir la función mitocondrial mediante la inyección de una solución concentrada de protonophore CCCP para alcanzar una concentración final de 1 μm en la sala de proyección de imagen. Esto induce robusto Ca2 + en citosol de fotorreceptor reportado por GCaMP y luego una disminución constante de potencial de membrana mitocondrial por TMRM. - Estrechamente monitorizar segmentos de deriva durante el experimento y utilizar el software para micro-ajustar según hitos físicos. Por lo general deriva en la dirección Z durante la inyección o perfusión es < 5 μm.
4. la proyección de imagen retinianas rebanadas durante experimentos de perfusión que cambió o fluía continuamente soluciones
Nota: Proyección de imagen retiniana rebanadas durante experimentos de perfusión donde las soluciones cambian o fluía continuamente es similar a la configuración para los experimentos de imágenes o inyección estática, con las siguientes modificaciones.
- En vez de vaselina se describe en el paso 1.4 escaleras de mano, use resistentes escaleras de cera para sostener rodajas retinianas constante durante el flujo de la solución.
- Colocar dos pequeños cilindros paralelos de cera dental de ~ 0,5 cm de separación en un cubreobjetos. Sobre una superficie plana, use un dedo para presionar cada cilindro hacia abajo y hacia fuera hacia el borde paralelo del cubreobjetos. Puntuación de ambos cilindros aplanados horizontalmente con un cubreobjetos de #1 entonces (véase la Figura 1E, lado derecho) Untar una capa delgada de vaselina entre las tiras de cera con una espátula.
- Al montar la imagen escalera paso 2.10.2, presione los bordes del papel de filtro en rodajas en las puntuaciones de la cera con unas pinzas finas (figura 1).
- Para configurar para perfusión en paso 2.12, jeringa embalses se llenan de soluciones preoxygenated, o utilice el colector de gas opcional para oxigenar las soluciones en cada depósito. Lave todos los tubos con solución de Ringer, asegurar que todas las líneas de fluyen cuando abre y purga grandes burbujas.
- Antes de llenar la cámara de proyección de imagen en el paso 2.13, utilice la jeringa para colocar otro punto de jalea de petróleo sobre cada esquina expuesta del cubreobjetos para evitar que se deslice lateralmente durante el flujo.
- Cuando la cámara de proyección de imagen se llena y se monta en la platina del microscopio, encienda el aspirador y conecte el tubo del aspirador. Prueba el flujo de solución de Ringer y el micropositioner para situar el tubo de aspirador sobre la cámara de salida para que pequeñas cantidades de líquido se extraen antes de que la cámara se desborda (típicamente ~ 1 mm por encima de la superficie de la solución para un caudal de 2 mL/min). Mantener la solución de Ringer, que fluye al seleccionar sectores en el paso 3.4.
- Para realizar el experimento en el paso 3.4 para perfusión, interruptor de flujo de soluciones cerrando la llave de paso de la primera solución de apertura de la segunda solución.
- Por ejemplo, para agotar el Na extracelular+ de la cámara de proyección de imagen, utilice dos embalses de jeringa llenados con solución de Ringer Na+-libre de solución (cuadro 3). Flujo de solución de Ringer para establecer línea de base, luego cambiar a Na+-libre de solución. Esto resulta en grandes citosólica Ca2 + aumenta en los segmentos externos del fotorreceptor y cuerpos de la célula (ver figura 4).
- Para sistemas de gravedad de la perfusión, controlar el nivel de solución en cada presa para que el flujo es constante durante la proyección de imagen. Superior de embalses según sea necesario con soluciones oxigenadas o mantener oxígeno continuo burbujeo con el colector de gas.
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Resultados
Colocación estable y orientación transversal de rebanadas son clave para la proyección de imagen exitosa con inyección o perfusión de agentes farmacológicos. Cuidadosamente examine y colocar rebanadas antes de la proyección de imagen confocal según sea necesario para asegurar que todas las capas retinianas son visibles (figura 2A, sector ii). Si se hace girar un trozo ligeramente hacia adelante (figura 2A, sector iii), paquetes d...
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Discusión
Ex vivo la proyección de imagen de pez cebra frescas rebanadas retiniana ha demostrado para ser una herramienta versátil para el estudio de fotorreceptor biología20,21,22y es el única que permite el análisis de células individuales en una madura totalmente diferenciados retina. Con la práctica, es posible realizar múltiples experimentos con el tejido de un solo pez, incluso usando rebanadas seriales de la misma parte de...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Agradecemos a Ralph Nelson y Daniel Possin orientación reflexiva en el desarrollo de este protocolo y Eva Ma, Ashley George y Gail Stanton para la generación de líneas de pez cebra transgénico estable. El trabajo fue apoyado por NSF GRFP 2013158531 a M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. y M.G. y EY026020 a J.H. y S.B.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pez cebra | Universidad de Washington South Lake Union Las existencias de las instalaciones | se mantienen internamente como líneas transgénicas estables | |
| vaselina | Fisher Scientific | 19-090-843 | para vaselina jeringa |
| 3 | mL Fisher Scientific | 14-823-436 | para vaselina jeringa |
| 20g 3,8 cm aguja de punta deslizante | Fisher Scientific | 14-826-5B | para vaselina jeringa |
| lisa 7 cm X 2,5 cm portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-550-A3 | para disección de oculares, cámara de corte |
| Seche Vite esmalte de uñas transparente | Amazon | B00150LT40 | para cámara de corte |
| 18 mm X 18 mm #1 cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-542A | para escaleras de imagen |
| cera dental sin sabor | Amazon | B01K8WNL5A | para escaleras de imagen hojas |
| de afeitar de doble filo | Stoelting | 51427 | para el corte de tejidos |
| cortadora de tejidos con micrómetro digital | Stoelting | 51415 | para el corte de tejidos |
| papel de filtro - celulosa mixta cuadriculada blanca, 13 mm de diámetro, 0,45 y micro; m tamaño de poro | EMD Millipore | HAWG01300 | papel de filtro para el montaje de retinas placa de |
| Petri de 10 cm | Fisher Scientific | FB0875712 | para peces de eutanasia, disección, montaje de escalera de imagen |
| varilla aplicadora de madera de punta lisa de 15 cm | Fisher Scientific | 23-400-112 | para alambre herramienta de bucle de |
| ojo de 30 g (0,25 mm de diámetro) alambre de tungsteno | Fisher Scientific | AA10408G6 | para herramienta de bucle ocular |
| de alambre D-glucosa | Sigma Aldrich | G8270 | componente de la solución madre del suplemento |
| L-lactato de sodio | Sigma Aldrich | L7022 | componente de la solución madre del suplemento |
| piruvato de sodio | Sigma Aldrich | P2256 | componente de la solución madre del suplemento |
| L-glutamina | Sigma Aldrich | G3126 | componente de la solución madre del suplemento |
| L-glutatión reducido | Sigma Aldrich | G4251 | componente de la solución madre del suplemento |
| Ácido L-ascórbico | Sigma Aldrich | A5960 | componente de la solución madre del suplemento |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | componente de la solución de Ringer |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | componente de la solución |
| de RingerCaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | componente de la solución de Ringer |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | componente de la solución de Ringer |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | componente de la solución de Ringer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | componente de la solución de Ringer |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | componente de Na+-free Solución de Ringer |
| 6 N HCl Fisher | Scientific | 02-003-063 | componente de Na+-free Solución de Ringer |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | componente de Na+ sin solución de Ringer |
| centrífuga cónico de 50 ml | Contenedor Denville Scientific | C1062-P | para solución de Ringer |
| Tijeras Vannas - 8 cm, hojas angulares de 5 mm | World Precision Instruments | 501790 | microtijeras para la disección de oculares Pinzas suizas |
| - #5, 11 cm, rectas, puntas de 0,06 X 0,07 mm | World Precision Instruments | 504510 | Pinzas finas para la disección de oculares y manipulación |
| de cortes cuchillas de afeitar de un solo filo | Fisher Scientific | 12-640 | para disección y recorte de oculares Papel de filtro |
| EMD Pinzas de filtro Millipore Pinzas | Fisher Scientific | XX6200006P | para manipular papel de filtro húmedo |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | tiñe núcleos de células vivas; incubar 5 µ g/mL durante 15 min a temperatura ambiente |
| yoduro de propidio (PI) | Fisher Scientific | P3566 | tiñe núcleos de células muertas; incubar 5 µ g/mL durante 20 min a temperatura ambiente |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | tiñe núcleos de células vivas; incubar 5 µ g/mL durante 20 min a temperatura ambiente |
| Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | tiñe mitocondrias funcionales cargadas negativamente; incubar 1 nM durante 30 min a temperatura ambiente |
| cámara de perfusión tisular | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | cámara de imagen para inyección o perfusión |
| 2-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2-Desoxiglucosa (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | análogo de glucosa fluorescente administrado por vía oral a pez cebra 30 minutos antes de la eutanasia |
| Microscopio confocal de barrido láser Olympus | Olympus | FV1000 | para visualizar la fluorescencia de cortes a resolución de una sola célula |
| Cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | reactivo experimental que ablaciona la respiración mitocondrial; Trate las rodajas hasta una concentración final de 1 µ |
| M posicionador de aspirador en miniatura | Cell MicroControls | FL-1 | para perfusión |
| colector de perfusión, colector de burbujeo de gas, válvula de flujo, soporte de jeringa de 60 cc | Warner Instruments | varios | para perfusión |
Referencias
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007(2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394(2014).
- George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from: http://hdl.handle.net/1773/33102 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
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