Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Resumen

En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.

Resumen

Baculovirus se ha utilizado tradicionalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas. Sin embargo, más recientemente, baculovirus se perfila como un prometedor vector para el uso de la terapia génica. Aquí, el baculovirus es producido por transitorios de la transfección del plásmido baculovirus ADN (bacmid) en una cultura adherente de células Sf9. Baculovirus se amplía posteriormente en células Sf9 en una cultura de suspensión libre de suero hasta obtener el volumen deseado. Luego se purifica de la cultura de sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sobrenadante el virus es cargado en la columna de heparina que se une partículas de baculovirus en el sobrenadante debido a la afinidad de la heparina por baculovirus envuelven glicoproteína. La columna se lava con un buffer para eliminar los contaminantes y baculovirus es eluida de la columna con un amortiguador de sal. El eluido se diluye a una concentración isotónica de sal y baculovirus partículas están más concentrados mediante ultracentrifugación. Usando este método, baculovirus puede ser concentrado hasta 500-fold con una recuperación del 25% de partículas infecciosas. Aunque el protocolo descrito aquí muestra la producción y purificación de los baculovirus de culturas hasta 1 L, el método puede ser escalado-para arriba en una cultura de suspensión de sistema cerrado para producir un vector de tipo clínico para uso de la terapia génica.

Introducción

Baculovirus se utiliza principalmente para la producción de proteínas recombinantes y vacunas en lepidópteros Spodoptera fugiperda (Sf) 9 células de los insectos mediante el uso de recombinante virus de poliedrosis nuclear multicapsid de Autographa californica (AcMNPV) ^{1 , 2 , 3 , 4}. más recientemente, se perfila como un prometedor vector gene terapia aplicación⁵. Es conocido por tener un amplio tropismo tejido y host, infecta las células quiescentes y proliferación, es no patógena y no integrar en e....

Protocolo

Vea la figura 1 para una ilustración que resume el protocolo.

1. purificación de ADN de plásmido de Baculovirus

1. Crece cultivo bacteriano que contiene baculovirales plásmido ADN (bacmid)¹⁴ en 200 mL de LB caldo con antibióticos; kanamicina (50 μg/mL), tetraciclina (10 μg/mL) y gentamicina (7 μg/mL), de 16 h a 37 ° C en un entorno de Agitador orbital a 300 rpm.
2. Purificar el bacmid ADN de la cultura bacteriana con lisis alcalina estándar protocolo¹⁵y disolver el bacmid en solución tampón TE.

2. producción de Baculov....

Resultados

El protocolo presentado es en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen los transitorios de la transfección de células Sf9 con bacmid ADN para producir baculovirus en cultura adherente en una placa, la amplificación posterior en cultura de suspensión libre de suero, nucleasa tratamiento y clarificación por centrifugación y filtración, y la purificación mediante la cromatografía de afinidad de heparina seguida por concentración con ultracentrifugació.......

Discusión

El protocolo que presentamos describe la producción de baculovirus en células Sf9 en cultura de suspensión y purificación de baculovirus mediante una cromatografía de afinidad de heparina. Los parámetros utilizados en el presente Protocolo maximizan el rendimiento y minimizan la inactivación de baculovirus infecciosas. El protocolo que aquí se muestra que una recuperación significativamente mayor de partículas de baculovirus en comparación con recuperaciones alcanzada por otros⁹.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Akta Avant 150	GE Healthcare	28976337	sistema de cromatografía
POROS Heparina 50 µ m Columna	ThermoFisher Scientific	4333414	Columna de heparina
Ultracentrífuga	Beckman-Coulter	Artículo no catalogado	Concentra virus a alta velocidad
Polialómero Tubo ultracentrífugo	Beckman-Coulter 326823		Concentra virus a alta velocidad
Incubadora agitadora orbital MaxQ 8000	ThermoFisher Scientific	Artículo no catalogado	Agitador para cultivo en suspensión
Matraces Erlenmeyer de 250 mL	Matraz ThermoFisher Scientific	238071	para cultivo en suspensión
Matraces Erlenmeyer de 1 L	Matraces ThermoFisher Scientific	238072	para cultivo en suspensión
Microscopio (Olympus CKX41)	Olympus	Artículo no catalogado	Monitorización y recuento de células
centrífuga de sobremesa	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Para la clarificación del sobrenadante de Baculovirus
50 ml Tubo cónico	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	Para la recogida de sobrenadante de Baculovirus
Placa de 6 pocillos	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Placa
de tejidos Placa de 10 cm	ThermoFisher Scientific	08-772E	Placa tratada para cultivo de tejidos
Stericup-HV, 0,45  y micro; m, PVDF	EMD-Millipore	SCHVU05RE	unidad de filtración
Kanamicina	ThermoFisher Scientific	15160-054
Tetraciclina	Sigma-Aldrich	T7660
Gentamicina	ThermoFisher Scientific	15750-060
Kit de vectores Bac-to-Bac	ThermoFisher Scientific	10360-014 Sistema de expresión de	baculovirus
DH10B-T1R  Célula competente	ThermoFisher Scientific	12331-013	Célula competente para tampón bacmid
TE	Interno	Artículo fuera de catálogo	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
Kit de Maxiprep de plásmido	ThermoFisher Scientific	K2100-06	Para la purificación de bacmid
Células Sf9	ThermoFisher Scientific	11496-015	Células de insectos
Grace' s Medio de cultivo de células de insectos	ThermoFisher Scientific	11605-094	Medio de transfección
PBS	ThermoFisher Scientific		20012227 Lavado de células, muestras de dilución
HyClone SFX-Medios de células de insectos	GE Healthcare SH30278.02		Medio de crecimiento de células de insectos sin suero
Benzonasa Nucleasa Sigma-Aldrich		E1014	Enzima para degradar ADN y ARN
Plásmido de baculovirus (bacmid) ADN	interno	Artículo no catalogado	Bacmid para la producción de baculovirus
Cellfectin II	ThermoFisher Scientific	10362	Reactivo de transfección para células de insectos
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4737	Estabiliza el Baculovirus
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	Para el almacenamiento de la línea celular de Baculovirus
HT1080	ATCC	CCL-121	Línea celular de fibroblastos
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Crecimiento Medios para líneas celulares
Tampón	de	Interno Artículo no de catálogo	20 mmol/l Tampón de fosfato que contiene 150 mmol/l de cloruro de sodio
Tampón de elución		Interno Artículo interno Fuera de catálogo	Tampón de fosfato de 20 mmol/l que contiene cloruro de sodio de 1,5 mol/l Tampón de
limpieza de columnas	Interno Artículo no de catálogo	Tampón de fosfato de 20 mmol/l que contiene cloruro de
sodio de 2,0 mol/lAgua estéril	Interno	Artículo no catalogado	Para la limpieza Akta Avant
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	1.09137	Para la limpieza Akta Avant
Etanol	Sigma-Aldrich	E7073	Para la limpieza Akta Avant

tratada para cultivo lavado