En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.
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Artículo de método
Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Fuga vascular y extravasación de plasma, tiene un número de causas y puede ser una grave consecuencia o síntoma de una respuesta inflamatoria. Este estudio en última instancia puede conducir a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. Es importante que los investigadores tienen las herramientas adecuadas, incluyendo los mejores métodos disponibles para el estudio de la extravasación de plasma. En este artículo, se describe un protocolo, utilizando el método de colorante azul de Evans, para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN. Este protocolo es intencionadamente simple, a tan grande un grado de lo posible, pero proporciona datos de alta calidad. Colorante azul de Evans ha sido elegido principalmente porque es fácil para el laboratorio de media utilizar. Hemos utilizado este protocolo para proporcionar evidencia y apoyo a la hipótesis de que la neprilysin de enzima puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma. Sin embargo, este protocolo puede usar experimentalmente y fácilmente adaptado para el uso en otras cepas de ratones o en otras especies, en muchos diversos órganos o tejidos para estudios que pueden involucrar otros factores que son importantes para entender, prevenir o tratar la extravasación de plasma. Este protocolo ha sido ampliamente optimizado y modificado de los protocolos existentes y combina fiabilidad, facilidad de uso, economía y disponibilidad general de materiales y equipos, hacer superior para el laboratorio de media utilizar en el presente Protocolo cuantificación de la extravasación de plasma de órganos.
Introducción
Fuga vascular en los órganos se refiere a extravasación o salida de plasma sanguíneo a través de brechas en el endotelio de post vénulas capilares en los órganos. Esta extravasación de plasma o el aumento de la permeabilidad vascular, que puede surgir de algún tipo de respuesta inflamatoria, puede tener graves consecuencias. Por lo tanto, es importante que este fenómeno, sus causas, moduladores y consecuencias, están estudiadas y entendidas, y además, que los investigadores tienen buenas herramientas y protocolos con los que estudiar. Las brechas endoteliales pueden ser producidas a través de una serie de estímulos, pero generalmente se producen por la acción de neurotransmisores péptido o taquicininas en el endothelia. Uno de los principales mediadores naturales de este proceso, que resulta en extravasación de plasma mayor, es el undecapeptide taquiquinina neuropéptido sustancia P1.
Métodos para investigar y medir la permeabilidad vascular o extravasación de plasma, que utilizan la propiedad de unión a albúmina del colorante azul de Evans, se han desarrollado y generalmente son conocidos por su precisión, sencillez, economía, seguridad y capacidad de permitir que el determinación de la extravasación de plasma de varios tejidos a la vez, si es así deseado2,3,4,5,6,7,8,9 . Este protocolo de azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN utiliza todos estos, pero añade algunas modificaciones importantes que lo hacen generalmente útil y adaptable para estudios futuros, el laboratorio promedio lleva a cabo o que llevar a cabo importantes estudios de factores asociados a la extravasación de plasma o en la permeabilidad vascular. En este protocolo, sustancia P es introducida a los ratones a 1 nmol/kg, lo que aumenta la extravasación de plasma por 1.5. Esto aumenta la sensibilidad del Protocolo, dando por resultado más fácilmente observables y obtener resultados. Otros factores que afectan a la permeabilidad, como varios otros péptidos, productos químicos o algunas formas de lesión tóxica, pueden ser utilizados o estudiados por otros laboratorios, como se desee. En este protocolo para introducir el azul de Evans y sustancia P sistémica, que requiere cirugía terminal se utilizan inyecciones de vena yugular. Sin embargo, las inyecciones de vena yugular5,7,10, incluso después de la consideración de las necesarias técnicas quirúrgicas terminal, son fáciles de dominar y conducir a la producción de resultados más consistentes que otra las inyecciones venosas, incluyendo cola vena inyecciones4,9. Aunque es posible de azul de Evans ser entregados por las inyecciones del seno venoso orbital retro, no hay referencias en la literatura han encontrado que utilizar este método de entrega de azul de Evans. Sin embargo, en cuanto a las inyecciones de vena de la cola, el alto grado de conocimientos y práctica reproducible dominar esta técnica muy limita su uso para inyección de azul de Evans exitosa. En contraste, el método de inyección de la vena yugular alternativos como se describe en nuestro protocolo, ofrece una solución técnicamente obtenible. Un procedimiento crucial para la perfusión de las venas del ratón, realizado justo después del sacrificio del ratón de perfusión de azul de Evans, elimina el exceso de tinte de azul de Evans y se ha estandarizado en el presente Protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusión han sido cuidadosamente examinados y modificado para conocer el presente procedimiento. Otras modificaciones que se describen aquí son todo optimizado, simple y de bajo costo.
Existen algunas limitaciones importantes del método de colorante azul de Evans. Por ejemplo, baja sensibilidad a veces asociado con este método puede prevenir algunos adicional examen macroscópico patológico e histológico de los tejidos de los animales de inyección de azul de Evans. Sin embargo, estas y otras limitaciones han llevado al desarrollo de métodos alternativos y modelos que, sin embargo, todavía utilizan el azul de Evans. La medición de azul de Evans por fluorescencia (en lugar de alcance visual) espectroscopia puede aumentar la sensibilidad del método. Además, microscopía de fluorescencia de los tejidos teñidos de azul de Evans fue desarrollado para permitir la observación de fuga vascular en más distintas ubicaciones11. Además, todo el cuerpo la proyección de imagen y escaneo de un animal vivo previamente inyectaron con Evans azul12 permite la investigación de las concentraciones de azul de Evans en una manera continua, en lugar de en uno elegido tiempo punto específico del experimento. Sin embargo, este método requiere la disponibilidad de instalaciones adecuadas de imagen y puede ser muy costoso. Modificaciones que Evans blue y realizada en un tipo de in vitro del modelo, como en una celda de cultura o chick corioalantoideas modelo13 (CAM) también se han descrito. Estos modelos son monitoreados por fluorescencia y microscopia intravital14 y permiten la cuantificación de cambios en la permeabilidad vascular con el tiempo, pero pueden plantear preguntas sobre modelado preciso de condiciones en vivo y también puede caro.
Ha habido otros métodos desarrollados para determinar y cuantificar fuga vascular o permeabilidad, que implica la administración de azul de Evans. Estos métodos pueden emplear una adecuada molécula fluorescente (como la albúmina o fluoresceína) o una molécula etiquetada isotópicamente etiquetada o no, a los animales vivos (o para la célula cultura o corioalantoideas (CAM) modelos13, seguido de no invasivo proyección de imagen (PET-TAC, resonancia magnética, microscopía intravital, escaneo de cuerpo entero) o por proyección de imagen invasivas (microscopia fluorescente)3,12,15. Aunque estas técnicas pueden ofrecer a una serie de ventajas sobre otros Evans métodos azul, también tienen desventajas, que pueden incluir su considerable complejidad, conocimientos necesarios, recursos y altos costos monetarios.
Neprilysin16 (la peptidasa enzima NEP, también conocido como CD10, MME o Enkephalinase) se ha sugerido para ser implicados en la inhibición de extravasación de plasma, al menos en parte, a través del metabolismo enzimático y la inactivación de sustancias endógenas Así, en los tejidos en que ocurre la peptidasa superficie celular NEP, puede haber una atenuación del efecto de la sustancia P, probablemente por la actividad de la peptidasa de NEP.
Al principio, probamos para la extravasación de plasma inducido por la sustancia P utilizando este protocolo modificado de Evans blue, con FVBN tipo salvaje (WT) y ratones knockout (KO) de NEP. Participación de la NEP en extravasación de plasma aumentada de sustancia P fue sospechada de estos estudios iniciales, y describimos a estos y otros experimentos papel de NEP participación en extravasación de plasma. Sin embargo, el foco de este manuscrito no es NEP o su papel en la extravasación de plasma, pero más bien la extravasación de plasma experimentos ellos mismos. Los resultados de la NEP son representante de la clase de resultados que pueden obtenerse mediante el uso de este protocolo modificado. El método de azul de Evans para medir la extravasación de plasma ha sido optimizado y modificado, como se describe en detalle a continuación para los ratones FVBN.
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Protocolo
Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el uso y cuidado de animales (ratones) en los experimentos descritos en este manuscrito.
Este método utiliza ratones adultos FVBN, edad 16-20 semanas, encontrado para ser óptimo para los fines de este estudio. Día 1 incluye pasos 1-5 y el día 2 incluye los pasos 6-7 (figura 1).
1. preparación de equipo
- Garantizar un suministro adecuado de jeringas estériles, desechables y agujas, si ketamina/xilacina se utiliza como anestésico (como se recomienda). Si isoflurano se utiliza como anestésico, verifique el tanque de oxígeno y el nivel de líquido de isoflurano para asegurarse de que hay un suministro adecuado para el experimento antes de comenzar. Además, montar la nariz respiración circuitos y fije a la caja de la inducción; Coloque latas de carbón nuevo a los circuitos de respiración. Preparar el cuadro de inducción activando el oxígeno y comprobar que la segunda etapa Lee aproximadamente 50 psi.
- Encienda el cojín de calentamiento a 37 ° C.
- Preparar la sonda de temperatura rectal para la cirugía.
2. ratón preparación
Este paso incluye anestesia, depilación y posicionamiento (adultos FVBN ratones-edad 16-20 semanas).
- Pesan los ratones y registrar los pesos.
- Anestesiar los ratones.
- Administrar ketamina y xilacina IP (80-100 mg/kg y 7.5-16 mg/kg, respectivamente). Sin embargo, se recomienda comenzar con dosis bajas de ketamina y xilacina (alrededor de 30 mg/kg y 6 mg/kg, respectivamente).
- Mantener la anestesia con aproximadamente 0,1 - 0,25 veces inicial de dosis de ketamina/xilacina a lo largo de la cirugía. Ketamina y xilacina eran el agente anestésico de elección en este estudio en particular, como se observaron más reproducibilidad y capacidad de supervivencia. El agente anestésico de elección en otros estudios se puede encontrar a ser diferente. Si se utiliza isoflurano, ponga el ratón en una cámara de inducción y encienda isoflurano al 5% hasta que el ratón pierde el sentido completo. Luego use una nariz nasal de isoflurane 1.5-2.5% en el resto del procedimiento.
- Controlar los ratones cada 2-3 min por pellizco del dedo del pie para verificar la adecuada profundidad de la anestesia.
- Afeite la zona ventral del cuello del ratón.
- Coloque el ratón en una posición supina en la almohadilla de precalentado. Asegure las patas y los pies del ratón a la superficie quirúrgica con cinta.
- Coloque el ungüento de lágrima artificial en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.
3. quirúrgicos detalles
- Realice una incisión de 1 cm en el cuello ventral derecho sobre la vena yugular.
- Aplicar una o dos gotas de lidocaína (1-2%) en el área de incisión para el tratamiento del dolor y promover la vasodilatación. Esperar 2 minutos para lidocaína surta efecto.
- Denunciar y aislar la vena yugular interna derecha por disección Roma. Atar la vena con la sutura 4-0 y retraer con suavidad el extremo rostral de la nave con una pinza hemostática. Orificio, con unas tijeras finas, unos 3 mm inferior o caudal a la corbata, aproximadamente a la mitad el diámetro de la vena.
- Un catéter de polivinilo PV-1 1,5 cm desde el extremo de la marca introduzca en la vena yugular a través del orificio usando un dilatador de vasos y el catéter hacia el extremo caudal de la nave, aproximadamente 1,5 cm del hilo de rosca.
- Atar el catéter firmemente dentro de la parte caudal de la embarcación (por debajo de la cut), con seda 4-0. Ate la parte rostral de la embarcación hacia el exterior de la sonda con los extremos sueltos de la sutura que se utiliza para atar la vena yugular rostral, en el paso 3.3.
- Virada la piel libremente de nuevo juntos alrededor del catéter con seda 4-0 para ayudar a prevenir pérdida de calor corporal y la desecación de los tejidos.
- Conectar el catéter a una jeringa con solución salina heparinizada (10 U/mL) y enjuague el catéter.
4. inyecciones
- Inyecte la solución de azul de Evans (50 μL de una solución de 30 mg/mL en solución salina normal, unheparinized 0.9%, o aproximadamente 50 mg/kg) en el catéter de la vena yugular, seguido de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea.
- 2 minutos más tarde, inyectar sustancia P (100 μL de una solución 0,3 μM en 0,9% solución salina normal, unheparinized o 1 nmol/kg), seguida de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea. Sustancia P aumenta la extravasación de proteínas plasmáticas a través de la capa endotelial; en este protocolo, habitualmente induce un aumento de los valores de extravasación de plasma de aproximadamente 1.5-fold, cual plasma extravasación más fácil de medir.
- Esperar 18 minutos después de inyectar la sustancia P. Durante este tiempo, el tinte de azul de Evans se equilibre y circular.
- Terminar el experimento 18 minutos después de la inyección de sustancia P (20 min después de la inyección de azul de Evans) sacrificando el ratón con la dislocación cervical. Es probable que el ratón puede ser directamente cervical dislocada, sin primero dar una sobredosis de anestésico, como el ratón es probablemente todavía bien anestesiado de la cirugía. Sin embargo, si es necesario, una sobredosis de anestésicos ketamina/xilacina, isoflurano o pentobarbital puede ser dado, seguido por dislocación cervical.
5. aislamiento de órganos
- Abrir la cavidad torácica del ratón y gravedad-perfusión (desde una altura de unos 51 cm o 20") el corazón y los vasos sanguíneos con 50 mL de citrato de sodio 50 mM, pH 3.5. pH 3,5 probablemente conserva a encuadernación azul de Evans a la albúmina.
- Suprimir los órganos relevantes 1-5 (tejidos) con un bisturí de disección (e.g. vejiga urinaria, riñón, estómago, hígado, páncreas, proximal o distal colon, íleon, duodeno, piel del flanco, orejas, cola, corazón y/o los pulmones) y quitar cualquier contenido residual, si presente.
- Enjuague los órganos en temperatura ambiente (RT) con tampón fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8.0 g de NaCl y 0,20 g de KCl en 1 L, pH 7,4).
- Seque los órganos con tejido, corte cada órgano por la mitad y pesan cada mitad (mojado pesos, en g).
- Seque uno mitad del tejido en un horno de secado a 150 ° C, en florete, durante 48 h.
- Coloque los otros tejidos del tubo la mitad en un volumen constante (200 μL) de formamida en una microcentrífuga durante 48 h (y hasta 72 h) para extraer el azul de Evans.
6. medición del tejido OD
- Saque 50 μl de formamida infundido de azul de Evans (después de la incubación de 48-72 h RT) el tubo de microcentrífuga y el lugar en un pozo de una placa de poliestireno de 96 pocillos. Tenga cuidado de no transferir piezas de tejido junto con la formamida.
- Depositar 50 μl de formamida nueva, pura en cada uno de los dos pozos vacíos de la placa de 96 pocillos para los espacios en blanco.
- Mida y registre la OD620 de cada pocillo de la placa de 96 pocillos en un lector de absorbancia. 620 nm es la absorbancia máxima de azul de Evans.
7. cálculo de la extravasación de Plasma
- Pesa el tejido seco mitad que ha estado en el horno durante 48 h.
- Calcular la proporción de peso seco/peso húmedo para el órgano específico de interés de cada ratón individual, comenzando con el peso húmedo de este tejido medio (obtenido en paso 5.4), dividido por el peso seco de este mismo tejido medio (obtenido en paso 7.1).
- Calcular el peso seco (en gramos) de tejido medio en formamida al dividir el peso mojado del tejido antes de que la mitad se colocó en formamida (obtenido en el paso 5.4) por la humedad: proporción de peso seco para el órgano específico de interés (calculado en el paso 7.2).
- Calcular los valores corregidos de620 OD. A partir de la OD620 valor de cada bien experimental de la placa de 96 pocillos (contiene formamida infundido de azul de Evans de cada tejido, obtenido en el paso 6.3), reste el espacio en blanco bien OD620 valor (la media OD620 de los dos pozos que contienen formamida puro, preparado en el paso 6.2, OD a620 los valores obtenidos en el paso 6.3) de cada valor experimental.
- Calcular el valor de extravasación de plasma por la corregida OD620 (calculado en paso 7.4) dividiendo el peso seco del tejido mitad en formamida (calculado en paso 7.3). Las unidades de la extravasación de plasma será OD620/g peso seco.
- Analizar los datos y expresar como la media ± SEM. estadísticamente comparar grupos por prueba t o análisis unidireccional de varianza y prueba de comparación múltiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), según corresponda.
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Resultados
En la figura 1, se muestra un esquema del procedimiento, que se ha encontrado en los valores más confiable y consistente de extravasación de plasma inducido por la sustancia P de órganos de los ratones FVBN. Este procedimiento toma generalmente dos días de trabajo, separados por al menos 48 h de tiempo de espera. Es posible extender aún más, si esto se hace sistemáticamente para que todos los experimentos comparar. Por ejemplo, después de que los órganos está...
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Discusión
Como hemos comentado anteriormente, el estudio de la extravasación de plasma en última instancia puede llevar a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. El uso acertado del Protocolo de extravasación de plasma (arriba), utilizando medio de contraste azul de Evans, se ha demostrado en el manuscrito actual. Aunque los datos se muestra de nuevo la hipótesis de que la NEP puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma, este es un objetivo secun...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Andy Poczobutt y Dr. Jori Leszczynski por su valiosa ayuda y ediciones a este manuscrito. Apoyado por subvenciones recibidas desde el corazón nacional, pulmón y Blood Institute (NHLBI to1 HL078929, PPG HL014985 y HL095439 RO3) y el Departamento de Veterans Affairs (de mérito).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Vet One | 200-070 | ketamina anestésica inhalada |
| Vet One | 200-055 | xilacina anestésico inyectable | |
| Lloyd Laboratories | 139-236 | anestésicas inyectables | |
| (10,3 y 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| agujas (20G1,23G1 y 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| cámara de inducción de isoflurano | VetEquip | 941443 | 1 litro |
| circuitos respiratorios de nariz | VetEquip | RC2 | Controlador de circuito para roedores 2 |
| tanque de oxígeno | Airgas | UN 1072 | 100% médica |
| CWE Inc. | TC-1000 controlador de | temperatura | |
| sonda de temperatura rectal | CWE Inc. | 10-09012 | |
| balanza de ratón (para roedores) | Ohaus | CS 2000 | |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Tijeras de resorte de 3 mm hoja recta (recipientes de corte) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Science tools | 11151-10 | Pinzas extrafinas Graefe (aislantes de vasos de ratón) |
| herramientas quirúrgicas-hemostáticas | Fine Science tools | 13009-12 | Hemostáticos de Halstead-mosquitos (disección roma, sujetar tejido)herramientas quirúrgicas-controladores |
| sutura | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar conductores de sutura (sutura) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Herramientas de ciencia | 11627-12 | Adson-Brown pinza de cocodrilo (sutura de agarre de tejido, rata) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de ciencia fina | 14110-15 | Tijeras de corte duro Mayo 15 cm (cirugía, disección, huesos, rata) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de ciencia fina | 18025-10 | pinzas de atado de suturas (utilizadas para el cateterismo Millar) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de ciencia fina | 14078-10 | Lexer Tijeras para bebés rectas (cirugía, ratón) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de Fine Science | 11254-20 | Pinzas de punta fina Dumont #5 (vasos de ratas, disección) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de Fine Science | 14082-09 | Tijeras de disector 12 mm (cirugía, ratón de rata)herramientas quirúrgicas-pinzas |
| Herramientas de Fine Science | 11051-10 | Pinzas de Graefe de 10 cm (agarre de tejidos, ratón de rata) | |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Science tools | 11251-35 | Pinzas Dumont 5/45 (introductor para vasos) |
| herramientas quirúrgicas-retractores | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractores 2/3 dientes (quirúrgicos para ratas) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Science tools | 11294-00 | Pinzas Dumont #4 (ratas de aislamiento de vasos, ratones) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Herramientas | de ciencia 11297-00 | Pinzas Dumont #7 (agarre de tejidos, disección) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de ciencia fina | 14058-11 | tijeras de iris de corte duro (disección de ratón, huesos) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de ciencia fina | 11009-13 | dentado, curvado Pinzas de Semken (agarre de tejidos, rata de ratón) |
| herramientas quirúrgicas-hemostáticos Herramientas de | ciencia fina | 13003-10 | Hemostáticos curvos Hartman (disección roma, sujetar tejido) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de ciencia fina | 11006-12 | Pinzas dentadas Adson (agarre de tejidos) |
| tijeras | Cinta | Oster A5 | |
| Fisherbrand | 159015G | ||
| ungüento de lágrimas artificiales | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaína | Hospira | 0409-4277-01 | |
| Catéteres de polivinilo | Tygon | PV-1 | |
| Evans azul | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Sustancia P | Bachem | H-1890 | |
| heparina | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| solución salina | Hospira | 0409-7138-09 | cloruro de sodio al 0,9% |
| fenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| citrato de sodio | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Toallitas Kimwipes para secante | Fisher Scientific | 06-666A formamida | |
| Sigma Aldrich | 47670 | ||
| microbalanza | Denver Instrument | APX-60 | |
| tubos de microfuga | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| poliestireno placa de 96 pocillos | Becton Dickenson | 351172 | |
| placa de absorbancia lector | BioTek | Synergy 2 | |
| geles de poliacrilamida | Bio-Rad | 3450014 | |
| patrón de peso molecular de proteínas | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran soportado nitrocelulosa | Amersham (GE) | 10600015 | |
| caja de gel | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| cloruro de sodio | Fisher Anticuerpo | NEP Scientific S271-1 | |
| R & D Systems | AF1182 | ||
| doxiciclina chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ ratones de tipo salvaje | Jackson | 001800 | |
| anticuerpo secundario (cabra anti-conejo) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solución-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| película | Pierce | 34091 |
Referencias
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