En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.
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Artículo de método
Un optimizado Evans azul protocolo para evaluar la fuga Vascular en el ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Fuga vascular y extravasación de plasma, tiene un número de causas y puede ser una grave consecuencia o síntoma de una respuesta inflamatoria. Este estudio en última instancia puede conducir a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. Es importante que los investigadores tienen las herramientas adecuadas, incluyendo los mejores métodos disponibles para el estudio de la extravasación de plasma. En este artículo, se describe un protocolo, utilizando el método de colorante azul de Evans, para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN. Este protocolo es intencionadamente simple, a tan grande un grado de lo posible, pero proporciona datos de alta calidad. Colorante azul de Evans ha sido elegido principalmente porque es fácil para el laboratorio de media utilizar. Hemos utilizado este protocolo para proporcionar evidencia y apoyo a la hipótesis de que la neprilysin de enzima puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma. Sin embargo, este protocolo puede usar experimentalmente y fácilmente adaptado para el uso en otras cepas de ratones o en otras especies, en muchos diversos órganos o tejidos para estudios que pueden involucrar otros factores que son importantes para entender, prevenir o tratar la extravasación de plasma. Este protocolo ha sido ampliamente optimizado y modificado de los protocolos existentes y combina fiabilidad, facilidad de uso, economía y disponibilidad general de materiales y equipos, hacer superior para el laboratorio de media utilizar en el presente Protocolo cuantificación de la extravasación de plasma de órganos.
Introducción
Fuga vascular en los órganos se refiere a extravasación o salida de plasma sanguíneo a través de brechas en el endotelio de post vénulas capilares en los órganos. Esta extravasación de plasma o el aumento de la permeabilidad vascular, que puede surgir de algún tipo de respuesta inflamatoria, puede tener graves consecuencias. Por lo tanto, es importante que este fenómeno, sus causas, moduladores y consecuencias, están estudiadas y entendidas, y además, que los investigadores tienen buenas herramientas y protocolos con los que estudiar. Las brechas endoteliales pueden ser producidas a través de una serie de estímulos, pero generalmente se producen por la acción de neuro....
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Protocolo
Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el uso y cuidado de animales (ratones) en los experimentos descritos en este manuscrito.
Este método utiliza ratones adultos FVBN, edad 16-20 semanas, encontrado para ser óptimo para los fines de este estudio. Día 1 incluye pasos 1-5 y el día 2 incluye los pasos 6-7 (figura 1).
1. preparación de equipo
- Garantizar un suministro adecuado de jeringas estériles, desechables y agujas, si ketamina/xilacina se utiliza como anestésico (como se recomienda). Si isoflurano se utiliza como ....
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Resultados
En la figura 1, se muestra un esquema del procedimiento, que se ha encontrado en los valores más confiable y consistente de extravasación de plasma inducido por la sustancia P de órganos de los ratones FVBN. Este procedimiento toma generalmente dos días de trabajo, separados por al menos 48 h de tiempo de espera. Es posible extender aún más, si esto se hace sistemáticamente para que todos los experimentos comparar. Por ejemplo, después de que los órganos está.......
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Discusión
Como hemos comentado anteriormente, el estudio de la extravasación de plasma en última instancia puede llevar a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. El uso acertado del Protocolo de extravasación de plasma (arriba), utilizando medio de contraste azul de Evans, se ha demostrado en el manuscrito actual. Aunque los datos se muestra de nuevo la hipótesis de que la NEP puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma, este es un objetivo secun.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Andy Poczobutt y Dr. Jori Leszczynski por su valiosa ayuda y ediciones a este manuscrito. Apoyado por subvenciones recibidas desde el corazón nacional, pulmón y Blood Institute (NHLBI to1 HL078929, PPG HL014985 y HL095439 RO3) y el Departamento de Veterans Affairs (de mérito).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Vet One | 200-070 | ketamina anestésica inhalada |
| Vet One | 200-055 | xilacina anestésico inyectable | |
| Lloyd Laboratories | 139-236 | anestésicas inyectables | |
| (10,3 y 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| agujas (20G1,23G1 y 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| cámara de inducción de isoflurano | VetEquip | 941443 | 1 litro |
| circuitos respiratorios de nariz | VetEquip | RC2 | Controlador de circuito para roedores 2 |
| tanque de oxígeno | Airgas | UN 1072 | 100% médica |
| CWE Inc. | TC-1000 controlador de | temperatura | |
| sonda de temperatura rectal | CWE Inc. | 10-09012 | |
| balanza de ratón (para roedores) | Ohaus | CS 2000 | |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Tijeras de resorte de 3 mm hoja recta (recipientes de corte) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Science tools | 11151-10 | Pinzas extrafinas Graefe (aislantes de vasos de ratón) |
| herramientas quirúrgicas-hemostáticas | Fine Science tools | 13009-12 | Hemostáticos de Halstead-mosquitos (disección roma, sujetar tejido)herramientas quirúrgicas-controladores |
| sutura | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar conductores de sutura (sutura) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Herramientas de ciencia | 11627-12 | Adson-Brown pinza de cocodrilo (sutura de agarre de tejido, rata) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de ciencia fina | 14110-15 | Tijeras de corte duro Mayo 15 cm (cirugía, disección, huesos, rata) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de ciencia fina | 18025-10 | pinzas de atado de suturas (utilizadas para el cateterismo Millar) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de ciencia fina | 14078-10 | Lexer Tijeras para bebés rectas (cirugía, ratón) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de Fine Science | 11254-20 | Pinzas de punta fina Dumont #5 (vasos de ratas, disección) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de Fine Science | 14082-09 | Tijeras de disector 12 mm (cirugía, ratón de rata)herramientas quirúrgicas-pinzas |
| Herramientas de Fine Science | 11051-10 | Pinzas de Graefe de 10 cm (agarre de tejidos, ratón de rata) | |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Science tools | 11251-35 | Pinzas Dumont 5/45 (introductor para vasos) |
| herramientas quirúrgicas-retractores | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractores 2/3 dientes (quirúrgicos para ratas) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Science tools | 11294-00 | Pinzas Dumont #4 (ratas de aislamiento de vasos, ratones) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Fine Herramientas | de ciencia 11297-00 | Pinzas Dumont #7 (agarre de tejidos, disección) |
| herramientas quirúrgicas-tijeras | Herramientas de ciencia fina | 14058-11 | tijeras de iris de corte duro (disección de ratón, huesos) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de ciencia fina | 11009-13 | dentado, curvado Pinzas de Semken (agarre de tejidos, rata de ratón) |
| herramientas quirúrgicas-hemostáticos Herramientas de | ciencia fina | 13003-10 | Hemostáticos curvos Hartman (disección roma, sujetar tejido) |
| herramientas quirúrgicas-pinzas | Herramientas de ciencia fina | 11006-12 | Pinzas dentadas Adson (agarre de tejidos) |
| tijeras | Cinta | Oster A5 | |
| Fisherbrand | 159015G | ||
| ungüento de lágrimas artificiales | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaína | Hospira | 0409-4277-01 | |
| Catéteres de polivinilo | Tygon | PV-1 | |
| Evans azul | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Sustancia P | Bachem | H-1890 | |
| heparina | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| solución salina | Hospira | 0409-7138-09 | cloruro de sodio al 0,9% |
| fenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| citrato de sodio | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Toallitas Kimwipes para secante | Fisher Scientific | 06-666A formamida | |
| Sigma Aldrich | 47670 | ||
| microbalanza | Denver Instrument | APX-60 | |
| tubos de microfuga | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| poliestireno placa de 96 pocillos | Becton Dickenson | 351172 | |
| placa de absorbancia lector | BioTek | Synergy 2 | |
| geles de poliacrilamida | Bio-Rad | 3450014 | |
| patrón de peso molecular de proteínas | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran soportado nitrocelulosa | Amersham (GE) | 10600015 | |
| caja de gel | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| cloruro de sodio | Fisher Anticuerpo | NEP Scientific S271-1 | |
| R & D Systems | AF1182 | ||
| doxiciclina chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ ratones de tipo salvaje | Jackson | 001800 | |
| anticuerpo secundario (cabra anti-conejo) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solución-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| película | Pierce | 34091 |
Referencias
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig s....
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Reimpresiones y permisos
