Summary
Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.
Abstract
Microglia, as células imunes residentes no cérebro, são as socorristas a inflamação ou lesão no sistema nervoso central. Recente pesquisa revelou microglia ser dinâmico, capaz de assumir fenótipos pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Tanto (pró-inflamatórias) M1 e M2 peça de fenótipos (pro-reparativa) um papel importante em condições de MPTP, tais como lesão cerebral perinatal e exposição de diferentes funções em resposta a certos estímulos ambientais. A modulação da ativação microglial tem sido observada para conferem neuroproteção sugerindo microglia pode ter potencial terapêutico em lesão cerebral. No entanto, mais pesquisa é necessária para compreender melhor o papel da microglia na doença, e este protocolo facilita isso. O protocolo descrito abaixo combina um processo de centrifugação gradiente de densidade para reduzir restos celulares, com a separação magnética, produzindo uma amostra altamente pura das pilhas microglial primário que pode ser usado para a experimentação in vitro , sem a necessidade de 2-3 semanas de cultivo. Além disso, as etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, auxiliando os estudos para melhorar a nossa compreensão da polarização e injeção dessas células, que tem fortes implicações no campo da medicina regenerativa.
Introduction
Danos adquiridos durante o período perinatal da inflamação, hipóxia-isquemia e hemorragia podem ter uma matriz de sequelas de longo prazo. Teoriza-se que envolvem inflamação e isquemia com consequente morte neuronal e axonal1complexa fisiopatologia da lesão cerebral perinatal. A resposta imune inata desempenha um papel importante na cascata de eventos levando a lesão2.
Microglia, as células imunes residentes dentro do sistema nervoso central (SNC), estão as socorristas para lesão3. Microglia são tipos de células de plástico com a capacidade de ser protetora ou tóxico, dependente do ambiente4. Eles estão envolvidos na quimiotaxia, fagocitose, apresentação de antigénios e produção de citocinas e de4,de espécies reativas de oxigênio5. Microglia senescente constantemente pesquisa o ambiente e são ativados pela presença de uma substância estrangeira ou prejudiciais4. Ativação leva a uma resposta pró-inflamatória, crítica no CNS proteção4. Estes M1 "pro-inflamatórios" fenótipo microglia são principalmente envolvida na apresentação de antigénios e a morte de patógenos4. Apesar do papel crucial da resposta inflamatória na neuroproteção, inflamação descontrolada ou prolongada pode ser prejudicial e levar a dano neuronal4. No entanto, quando expostos a certos estímulos ambientais, microglia pode apresentar um fenótipo anti-inflamatórios. Estes pro-reparativa M2 microglia têm um papel fundamental na cicatrização de feridas e reparação6, liberando uma variedade de citocinas e outros mediadores solúveis que downregulate inflamação, aumentam a fagocitose e promovem reparo4, 7. os papéis de micróglia são diversos e incluem condução diferenciação oligodendrocyte durante re-mielinização8, protegendo os neurônios durante a depleção de oxigênio e glicose em curso modelos9 e promovendo o axônio consequência em 10modelos de lesão da medula espinhal.
O estudo destas células gliais representa um aspecto importante na compreensão e manipulando a resposta ao neuroinflammation. O protocolo descrito permite ainda mais a investigação sobre o potencial terapêutico de micróglia modulação em desordens MPTP.
A modulação da ativação microglial para um papel neuroprotetor tem sido observada em uma variedade de condições11,12,13. Assim, melhorar o entendimento atual e ainda mais, estudando modulação da ativação microglial é fundamental, exigindo o uso de vários modelos, incluindo tanto em vitro como em vivo. Estudos in vitro representam uma ferramenta importante devido à sua maior eficiência, menor custo e capacidade para investigar uma população de células isoladas.
Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia do cérebro murino, o desafio de produzir com eficiência uma amostra de alto rendimento com boa viabilidade e pureza elevada. Métodos comumente utilizados de isolamento primário microglia são por separação magnética e agitação prolongada das culturas gliais mistas. Através da experiência pessoal, verificou-se que havia um alto grau de restos celulares que obstruiu a coluna magnética. Assim, foi utilizado o seguinte protocolo, que incorpora uma etapa de centrifugação gradiente de densidade inicial seguida de CD11b separação magnética. O protocolo descrito abaixo foi otimizado para produzir uma amostra altamente pura em quantidade suficiente. É vantajoso devido à sua alta pureza e o curto período de tempo — um pode realizar ensaios dentro de 2 dias sem a necessidade de cultura para 2-3 semanas. Este protocolo potencialmente pode ser adaptado para o isolamento de astrócitos murino primários.
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Protocol
Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da Universidade de Monash. Camundongos C57Bl6/J P3-6 de saudável em recém-nascidos não tratados foram usados para gerar os resultados representativos.
1. enzimática digestão
Nota: É importante considerar a esterilidade quando isolar e cultivar as células primárias. Garantindo que o ambiente é tão estéril quanto possível, ao mesmo tempo a dissecção inicial e colheita de cérebros murino podem ser concluídas fora um capuz de fluxo laminais, com todas as etapas realizadas dentro de uma capa de fluxo laminar.
- Usando instrumentos esterilizados, eutanásia o mouse por deslocamento cervical, decapitar o animal e enxágue com 100% de etanol. Usando pequenas tesouras estéreis, faça pequenas incisões ao longo dos lados direito e esquerdos da cabeça. Nesta idade, a pele descasca facilmente. Usando as pontas da pinça curvada, deslize suavemente o tecido para a tribuna para expor o crânio, incluindo o Bregma.
- Inserir a ponta da tesoura na abertura do canal medular e fazer uma incisão lateral ao canal auditivo. Fazer uma incisão ao longo da sutura sagital para o Bregma, apontando suavemente a ponta da tesoura para cima para não danificar o cérebro. Introduza a ponta da tesoura em Bregma e fazer incisões laterais para os lados direito e esquerdos da cabeça ao longo da sutura coronal.
- Usando fórceps, delicadamente descasca o crânio para expor o cérebro. Para fazer isso, segure as extremidades da caveira exposta a incisão lateral e puxe cuidadosamente o crânio para o lado. O crânio deve descascar facilmente. Usando a pinça curvada, colher suavemente sob o cérebro para removê-lo.
- Coloque o cérebro num recipiente estéril 5 mL, lavar 2 - 3 vezes com mídia de lavagem gelada (de baixa glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 1% penicilina-estreptomicina), aproximadamente 5 mL meios de comunicação social por lavagem, para retirar o sangue.
- Numa vizinhança de fluxo de ar laminar, coloca o conteúdo do recipiente em um pequeno prato de petri (35 mm), 5 mL, descansando no gelo. Usando uma lâmina de bisturi estéril ou tesoura esterilizada, retire o cerebelo e o bulbo olfativo. Faça uma linha média corte para separar os dois hemisférios.
- Cuidadosamente descasca afastado a camada meníngea com pinça fina, tendo cuidado para não danificar os córtices. Identifica a camada meníngea como uma camada muito fina de células com uma coloração avermelhada na superfície do cérebro, com visíveis os vasos sanguíneos. Manter o cérebro frio é essencial para a remoção adequada de meninges. Se quebrar a camada meníngea, continue descascando afastado os fragmentos rasgados até que ele seja completamente removido.
- Transferi os hemisférios para um novo pequeno prato de petri (no gelo) e encha-a com a lavagem de mídia. Pique o cérebro em pedaços pequenos com lâmina de bisturi estéril/tesoura.
Nota: Estes devem ser mm ~ 12 no tamanho, e deve ter cuidado para não cortá-los em pedaços muito pequenos, como isto pode reduzir o rendimento. - Adicionar 100 µ l papaína (estoque de 17 U/mg) e 150 µ l DNase eu na mídia e incube por 30 min a 37 ° C
- Após digestão, Triture o tecido usando uma pipeta P1000. Se os pedaços de tecido são grandes demais para entrar a pipeta, considere o uso de um par ou tesoura esterilizada para alargar a ponta da pipeta. Durante este processo, tome cuidado para não introduzir bolhas na mídia como isto pode reduzir a viabilidade celular.
2. a mielina remoção de entulhos
- Sob uma capa de fluxo laminar, usar equipamento estéril, prepare um tubo cónico de 50 mL com um coador de célula de 100 µm, para cada cérebro. Despeje o conteúdo da caixa de Petri, contendo as peças de médio e cérebro digerir em um coador. Empurre com os pedaços de cérebro usando o êmbolo de uma seringa de 3ml estéril em um movimento de moagem até que não há nenhum tecido mais visível. Após a digestão, o tecido cerebral deve desmoronar facilmente.
- Continuamente, lave o filtro com os meios de lavagem, por encher o filtro de célula em todo este processo. Isto vai lavar através de quaisquer células presas no filtro.
Nota: Isto deve ser feito até que haja cerca de ~ 15 mL no tubo. Isto é para garantir que o filtro é suficientemente lavado através de e para maximizar a quantidade de células coletadas. -
Centrifugar a suspensão de célula única 500 x g por 5 min a 4 ° C. Durante este tempo, prepare o suporte de gradiente de densidade conforme descrito.
- Prepare o estoque percoll isotônica (SIP), que é o meio de gradiente de densidade utilizado. Faça isso adicionando-se 9:1 relação de médio gradiente de densidade de 10 x solução salina equilibrada do Hanks estéril (HBSS).
- Prepare-se gradientes como 30% SIP em DMEM e 70% SIP em 1 x HBSS. Por exemplo, para preparar 10 mL de 30% SIP, adicionar 3 mL de SIP para 7 mL DMEM.
- Aspire o sobrenadante do tubos cónicos e ressuspender o sedimento celular com 8 mL de 30% SIP em DMEM. Transferi todo o volume para um tubo cónico de 15 mL.
- Subjacência a solução SIP de 70%. Para fazer isso, encha uma pipeta de transferência com 70% SIP e cuidadosamente empurrar através da pipeta de transferência para o fundo do tubo cónico. Uma vez que a ponta está perto do fundo, empurre suavemente através do conteúdo da pipeta de transferência.
Nota: Faça isto lentamente para não perturbar a interface 30/70. Deve haver uma linha clara separando as duas camadas. - Centrifugar as camadas SIP, incluindo as células, a 650 x g com freio 0 e 4, a aceleração para 25 min à temperatura ambiente.
Nota: É essencial para completar o giro com freio fora e permitir que a centrífuga para lentamente vir a uma parada, como aplicação do freio perturbará a interfase e reduzir drasticamente a coleção de células entre as camadas SIP. - Aspire os restos celulares na parte superior do tubo e remova aproximadamente de 4 mL mídia do topo. Isto facilitará a remoção das células mononucleares na etapa seguinte. Usando uma pipeta P1000, baixe cuidadosamente a ponta da pipeta para a interfase. Isole as células mononucleares da interface médio gradiente de densidade 30/70. Colete aproximadamente 3 mL da interface nublado e transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Em seguida, dilua a mistura com 9 mL de HBSS para ajudar à remoção do meio de gradiente de densidade.
- Centrifugue a interfase médio gradiente de densidade diluída, que contém as células mononucleares em 500 x g, durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de meio de crescimento (DMEM suplementado com 10% fetal bovino soro e 1% antibióticos). Em seguida, manchar as ressuspensa células com trypan azul e realizar uma contagem de células usando um haemocytometer.
3. magnético celular ativado classificação
Nota: Estes passos são modificados de protocolo dos fabricantes.
- Centrifugar as células mononucleares coletadas a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover o meio de crescimento, pois isto irá interferir com o isolamento magnético. Usando a mesma contagem de células obtida passo 2.8, Ressuspender a 1 x 108 nucleated células/mL em PBS (++ de Ca e Mg ++ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM EDTA, dentro de uma faixa de volume de 0,1 a 2,5 mL.
- Adicione o volume total de células nucleadas em PBS da etapa anterior para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar 50 reagente de rotulagem CD11b PE µ l por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.
- Adicione 70 µ l de seleção cocktail (uma combinação de anticorpos monoclonais contra CD11b em PBS) por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.
- Misture partículas magnéticas pipetando para cima e para baixo mais de 5 vezes. Adicione 50 µ l/mL para a amostra. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz.
Nota: Estas partículas então formam um complexo tetramérica com os anticorpos e vão ficar ligadas a coluna magnética. - Se o volume total da mistura de célula é inferior a 2,5 mL, top esse volume com PBS (++ de Ca e Mg ++ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM de EDTA e misture suavemente pipetando 2 - 3 vezes. Coloque o tubo (sem tampa) para o ímã e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
- Em um movimento contínuo, inverta totalmente o ímã que contém o tubo para 2-3 s, decantar o sobrenadante. Retornar o ímã para uma posição vertical e retire o tubo do ímã. Prepare-se para lavar as restantes células da coluna.
Nota: O sobrenadante contém células rotuladas e indesejadas, que são removidas por inversão do tubo enquanto ainda no imã. O tubo contém o Cd11b anexado+ células. - Lave as células, repetindo as etapas 3.5 e 3.6 mais duas vezes. Se a amostra for maior que 1 mL, é recomendado um mais repetição de etapas 3.5 e 3.6.
- Ressuspender as células em um meio de crescimento desejado. Enxágue o lado do navio coleção também (ex. um tubo de 15 mL) para coletar as células dos lados do tubo e maximizar o rendimento.
4. verificação da pureza da micróglia
Nota: O primário microglia isolada de 3L (n = total de 5 animais) foram verificados através de fluorescente ativado celular classificação (FACS) para determinar a pureza para os resultados representativos.
- Células de cultura num balão de T-25 no meio de crescimento, contendo 10% FBS durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 106 células por balão.
- Lavar as células os frascos de T-25 com PBS 3 x por 5 min remover qualquer mídia de crescimento remanescente, que pode interferir com a tripsinização.
- Adicione 2 mL de tripsina 0,25% para separar as células dos frascos. Certifique-se de que o volume de tripsina é suficiente para cobrir toda a superfície do balão. Após agitação suave do frasco para assegurar uma cobertura uniforme de tripsina, incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Extinguir o processo tripsinização, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.
- Recolha o sobrenadante contendo as células trypsinized e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células.
- Remover o sobrenadante contendo o meio de crescimento e tripsina e resuspenda o pellet em buffer de FACS 500 μL. Realize a contagem de células usando trypan azul.
- Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Execute o bloco de receptor Fc adicionando 50 buffer de FACS μL + bloqueador de FcR 1 μL por 5 x 106 células. Incube por 15 min a 4 ° C.
Nota: O bloco do receptor Fc é um passo crítico no processo de coloração para evitar inespecificas de imunoglobulinas aos receptores de Fc em populações de células imunes. Este bloqueio não afeta a ligação a jusante de outros anticorpos. - Finalizar o processo de bloqueio diluindo com buffer de FACS 500 μL. Em seguida, centrifugar a mistura que contém as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Resuspenda em fresco buffer de FACS 500 μL.
- Coloque a maioria das células (por exemplo, se resuspending as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL por tubo de controle (por exemplo, para 6 tubos de controle, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top 83.33 buffer de FACS μL). Fazer os grupos (tubos de controle em negrito) como Unstained, single manchado (CD45, CD11b), única mancha ao vivo/morto, FMO e tubos de amostra.
- Pelotas as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Manche as células no tubo com 1 anticorpo μL por buffer de FACS 100 μL por 5 x 106 células. Incubar durante 20 min a 4 ° C.
Nota: Use 50 μL anticorpo cocktail se menos de 2 x 106 células são usadas. - Lave as células com buffer de FACS 500 μL. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em buffer de FACS 300 μL.
Nota: Use ~ 100 μl, se a contagem de células é de menos de 2 x 106. - Usando análise de citometria de fluxo, quantificar as células que são positivas para coloração de CD11b e CD45baixa . Esta percentagem corresponde a microglia primário isolado.
5. coloração imuno-histoquímica de micróglia primária
- As células em uma placa de 96 poços, com uma densidade de 1 x 105 células da placa com o meio de crescimento e incubar durante uma noite.
- Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com PBS.
- Consertar as células com paraformaldeído 4% em PBS por 15 min. remover o PFA com uma pipeta P1000 e, em seguida, lavá-los 3 vezes com PBS + 0,1% Triton-X.
- Bloco de ligação não-específica com 3% albumina de soro bovino por 1h à temperatura ambiente.
- Incube com coelho Iba-1 (1: 100) por 24 h a 4 ° C. Em seguida, retire a mistura do anticorpo primário e lavar 3 vezes com PBS.
- Incube com secundário conjugado anticoelho GFP (1: 200) por 1h à temperatura ambiente. Em seguida, retire a mistura do anticorpo secundário e lavar 3 vezes com PBS.
- Monte as lâminas com uma fluorescente montagem médio e captura de imagens utilizando um microscópio fluorescente.
6. quantificação da Microglia usando o pHrodo do ensaio
Nota: O ensaio de pHrodo permite a identificação dos níveis de fagocitose em células cultivadas. Após a captação através de endocitose, internalização no ambiente mais ácido aumenta os níveis de fluorescência de conjugados a bioparticle. Em seguida, níveis de fluorescência podem ser quantificados pela FACS. As etapas a seguir são modificadas de protocolo dos fabricantes.
- Cultura de células num balão de T-25 no meio de crescimento durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 106 células por balão. Lave as células em frascos de T-25 com PBS 3 vezes por 5 min.
- Separe as células usando a tripsina 0,25% de 2 mL. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
- Extinguir o processo de trypsinisation, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 500 x g por 5 min a 4 ° C para células de Pelotas.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo a microglia primário em meio de cultura em 106 células/mL.
Nota: Como alternativa, placa de células em uma placa de 96 poços, pelo menos, um dia antes e mire a 1 x 105 células viáveis por bem no dia do ensaio é para ser realizado. - Células de placa em placa de 96 poços, 1 x 105 células/poço, 100 μL por poço. Placa de controles e experimentais poços em triplicado e deixar um poço vazio por controlo positivo para uma subtração de fundo não-célula de controle.
- Adicione 100 μL de mídia de crescimento nos poços deixados vazios para subtração de fundo não-célula.
Nota: Como qualquer outro em vitro ensaio, controles apropriados são vitais para a precisão das leituras. Ao lado da célula não-controle (fundo de leitura), também incluem o controlo negativo (pHrodo conjugado adicionado, mas colocada no gelo). - Cobrir a placa e incubar por 1h em uma incubadora com 5% CO2 a 37 ° C.
- Prepare experimentais poços, acrescentando estimulante e tratamento. Adicione controles do veículo (apenas mídia de crescimento) para poços não tratados.
Nota: Lipopolissacarídeo 1 µ g/mL [estimulantes] e células epiteliais humanas âmnio (hAEC)-condicionada mídia [tratamento] foram usadas para gerar os resultados representativos. - Descongelar um frasco de corante conjugado, adicionar vórtice e brevemente 2 mL de tampão de captação. Transferir o conteúdo do tubo para um tubo de vidro limpo e proceda à sonicação por 5 min, para garantir que as partículas são uniformemente dispersos.
- Aspire o meio de cultura de poços de microplacas e substituir rapidamente com 100 μL de suspensão de tintura. Cobrir e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
Nota: Lembre-se de manchar os tubos de controle também. - Usando análise de citometria de fluxo, quantificar células coloração positiva para as contas pHrodo conjugados e apresentar em percentagem (do pai) de ativamente fagocitose microglia.
7. quantificação da Microglia apoptose após insulto inflamatório
- Repita os passos 1-7 da seção "Verificação de micróglia pureza".
- Coloque a maioria das células (por exemplo, se você resuspended as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL pelo tubo controle (por exemplo, para tubos de controle 6, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top buffer de FACS 83.33 μL). Grupos (tubos de controle em negrito): manchas Unstained, única (AnnexinV, iodeto de Propidium), única mancha ao vivo/morto, FMO, tubos de amostra.
- Granule as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min.
- Incube com 1 μL anticorpo/100 μL FACS tampão/5 x 106 células por 20 min a 4 ° C.
Nota: Use 50 μL se tiverem menos de 2 x 106 células. - Lave as células adicionando 500 μL FACS buffer e centrifugar a 500 x g por 5 min.
- Resuspenda o pellet de células no buffer de FACS 300 μL.
Nota: ~ 100 μL se a contagem de células é de menos de 2 x 106. - Quantificar as células dentro de cada quadrante (Q1: necrótico, Q2: tarde apoptotic, Q3: viável, Q4: apoptotic precoce).
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Representative Results
Usando os métodos descritos aqui, populações puras de microglia podem ser isoladas e podem estar prontas para a caracterização de uso in vitro e análise de FACS. Para começar, até 18 animais podem ser usados por ser rejeitada, com um rendimento esperado de cerca de 450.000-600.000 células microglial. É crucial confirmar primeiro a pureza das células isoladas, e para isso a análise FACS foi realizada pela coloração para os dois marcadores CD11b. identificação da microglia e CD45 pode provar problemático, como muitos marcadores expressados por microglia também são expressos por macrófagos e o uso destes dois marcadores permite a quantificação precisa e confiável. Especificamente, a microglia têm uma baixa expressão de CD45, em comparação com a alta expressão vista no CNS e macrófagos periféricos e também são positivo para CD11b (Figura 1). Este isolamento particular, foi relatada uma pureza de 89,3%. Depois da coloração para CD11b, notamos que nosso principal microglia compartilham características morfológicas semelhantes, com uma gama de morfologias do distintamente unramified (grande esférica célula corpo com pouca ou nenhuma processos estendidos) para o mais ramificado (com menores, mais somata oval e tipicamente até processos de ordem secundária) correlacionando a uma gama de Estados de ativação, como esperado para ver na vivo (Figura 2).
Em seguida, foram executados dois ensaios de caracterização para a função de micróglia e sobrevivência. Microglia são a célula fagocítica importante no SNC, e o ensaio de pHrodo permite a quantificação dessa propriedade funcional específica. Um 3 vezes de aumento função fagocitária após 24-h co-cultura com hAEC condicionado médio (Figura 3) foi observado, medido pela quantificação das partículas fluorescentes pHrodo. Finalmente, uma AnnexinV-PI coloração seguir co-cultura foi realizada para identificar a sobrevivência da microglia seguindo um insulto inflamatório. Uma redução da apoptose microglia após tratamento com meio condicionado (Figura 4) foi observado. Estes achados sugerem que esse meio de hAEC condicionado protege microglia e aumenta a sua atividade fagocítica, que pode ter terapia em desordens de lesão e MPTP cerebral perinatal.
Figura 1 : Expressão de CD45 e CD11b por microglia. Cada ponto representa uma célula rotulada e FACS análise permite a elucidação de populações de células separadas. Microglia têm uma menor expressão do antigénio CD45 comparado aos macrófagos derivados de monócitos periféricos e são positivo para CD11b. números abaixo do rótulo de anticorpos indicam a proporção de células gated, expresso em percentagem da população de pai. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Morfologia da microglia primária isolada. Como pode ser visto nesta figura, microglia reter seu corpo esférico de célula e estrutura ramificada distinta. Barra de escala = 20 µm.
Figura 3 : Quantificação da função fagocitária em isolado primário microglia. partículas pHrodo-rotulados apenas fluorescem quando em ambientes ácidos, como em endossomos celulares após a fagocitose. Aqui, observa-se um aumento na captação de partículas pHrodo em microglia tratado com hAEC condicionado médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análise de sobrevivência microglia após insulto inflamatório. (A) representante FACS parcelas de micróglia isolada. A coloração combinada de iodeto de AnnexinV e propidium permite a categorização em células vivas ou apoptose, necrose, após estimulação com LPS. (B) hAEC condicionado médio apoptose microglia significativamente reduzida em relação a controles, sugerindo uma forma de proteção neste tipo de célula. * significa p < 0.05, teste t de student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Médio de lavagem |
| Baixos de glicose Dulbecco modificada do médio águia |
| 1% v/v penicilina-estreptomicina |
| Médio de Digest (por cérebro) |
| 150 µ l DNase eu |
| 100 µ l papaína (estoque de 17U/mg) |
| 3 ml de meio de lavagem |
| Meio de crescimento |
| Baixos de glicose Dulbecco modificada do médio águia |
| 10% de soro fetal bovino |
| 1% v/v penicilina-estreptomicina |
Tabela 1: Tabela de soluções.
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Discussion
Microglia têm a capacidade de ser pró - e anti-inflamatórias, alterada por estímulos do ambiente. Estudos anteriores mostraram que a modulação da ativação da microglia pode conferir neuroproteção. Sua capacidade de fornecer proteção aos neurônios e reparar lesões necessita de mais pesquisas para promover a compreensão atual dessas células complexas. Assim, o isolamento de alta pureza primária microglia é uma técnica importante e útil. Este é um método relativamente rápido para obtenção de altamente puro microglia primário pronto para experimentação em vitro dentro de 2 dias.
Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia primária do cérebro murino. O principal desafio é produzir com eficiência suficiente amostra, alta na viabilidade e pureza. A principal vantagem deste protocolo é o rendimento de uma amostra altamente puro, sem a necessidade do tempo na cultura. Assim, o método é encurtado de 2 semanas, 2 dias, isso facilita resultados rápidos. As etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, reforçar a compreensão atual dessas células complexas. O protocolo combina duas abordagens atuais - centrifugação gradiente de densidade e separação magnética. Separação magnética foi bem validada na literatura para isolamento de micróglia de forma relativamente suave em comparação com outros isolamento técnicas14,15,16. Ao mesmo tempo, sem dúvida, há alterações nas características funcionais da microglia primário isolado em comparação com em seu estado nativo em vivo, quaisquer alterações às propriedades microglia, como observado em ensaios desenvolvidos acima são calculadas a partir uma linha de base após a digestão e como tal são reflexivo de modulação direta desse subconjunto imune.
Enquanto o protocolo é relativamente simples, cuidados durante as etapas críticas vão ajudar a garantir um bom rendimento. Em primeiro lugar, é importante usar mídias de baixa glicose para dar suporte ao crescimento glial. Além disso, o cérebro murino deve ser mantido gelo frio em todos os momentos durante o isolamento. Assim, recomenda-se pre-chill todos médio, bem como instrumentos se possível e realizar o procedimento no gelo. Importante, vezes prolongado isolamento vão levar a pior saúde celular e produzir, assim, é fundamental para trabalhar rapidamente. Além disso, a remoção adequada da camada meníngea é um passo crucial quando trabalhando com ratos adultos, caso contrário os fibroblastos vai outcompete as células gliais em termos de crescimento. Durante a digestão enzimática dos cérebros, é importante não cortar o cérebro em pedaços muito pequenos como isto pode aumentar a morte celular, idealmente aponta para peças de2 1mm de tecido. Quando a moagem do tecido através do filtro de célula, enxaguar com mídia cada poucos minutos para garantir que todas as células são lavados através de e não ficar preso no filtro, além disso é aconselhável usar um filtro de célula de 100 μm, filtros menores resultam em um rendimento reduzido. Outro passo crítico é o subjacentes da camada Médio gradiente de densidade de 70%, executar este passo cuidadosamente e lentamente, a fim de assegurar que uma clara interfase é visto é essencial, é recomendado o uso de uma pipeta Pasteur. Além disso, o uso de tubos cônico de 15 mL é recomendado como a separação das células foi menos eficaz, quando foram utilizados tubos de Erlenmeyer de 50 mL. Por último, a centrifugação gradiente de densidade deve ser executada à temperatura ambiente, como temperatura pode afetar o gradiente de densidade.
Este protocolo descreve um método confiável de produzir células altamente puro microglia primária, conforme mostrado pela alta expressão de CD45 e positiva expressão de Cd11b (em comparação com baixa expressão de CD45 visto em monócitos periféricos). As células também podem ser isoladas relativamente rapidamente, assim tem o escopo a ser significativamente maior compreensão dessas células da glia. Ele pode ser usado para identificar a microglia diferentes populações de diferentes origens, permitindo estudos que podem revelar diferenças entre microglia isoladas de animais doentes/feridos e saudáveis. Através do isolamento de uma população de puro microglia, modulação terapêutica desta população de células imunes pode ser avaliada. Por exemplo, verificou-se que mídia hAEC-condicionado aumentou a fagocitose, assim como melhoradas a microglia sobrevivência durante um estímulo inflamatório, assim, proporcionando benefícios terapêuticos17. Esta correlacionada com reduzida apoptotic restos e assim sugere afastamento destes detritos pode ter efeitos neuroprotective.
O protocolo pode ser aplicado aos ratos neonatais ou adultos, porém mais velhos ratos produzirá um rendimento reduzido. Além disso, pode ser adaptado para isolar primários astrócitos de ratos adultos ou neonatais, novamente mais velhos ratos resultará em uma diminuição da produção. Além disso, a modificação da etapa de dissociação mecânica com uma malha de nylon sob medida com tamanhos de poros maiores em oposição a peneira de célula 100 μm, pode melhorar ainda mais a célula rendimento18.
Limitações do presente protocolo incluem o rendimento mais baixo e o tempo necessário para este protocolo. O rendimento é de cerca de 150.000-200.000 células por abate de seis animais, contra os milhões que podem ser obtidos através de semanas de cultura de células. Além disso, enquanto as células podem ser obtidas no prazo de dois dias, o procedimento no primeiro dia é bastante demorado, tendo aproximadamente seis horas.
No entanto, esse método é uma ferramenta altamente útil em compreender o papel da microglia na doença, capaz de isolar e caracterizam as células dentro de dois dias. Produz células microglia primária de alta pureza, facilitar a investigação precisa e eficiente.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
