En este trabajo ofrecemos detalles de los métodos de producción y control de calidad de una proteína de fusión recombinante de IL4-10. También mostramos cómo probar la efectividad de esta proteína para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio.
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Artículo de método
Desarrollo de proteínas recombinantes para el tratamiento de dolor crónico
En este artículo
Resumen
Resumen
El dolor crónico es difícil de tratar y se necesitan urgentemente nuevos enfoques para resolver el dolor persistente. Citoquinas antiinflamatorias son candidatos prometedores para el tratamiento de afecciones debilitantes dolor debido a su capacidad para regular interacciones neuro-inmune aberrantes. Sin embargo, fisiológicamente funcionan en una red de varios cytokines, y por lo tanto su efecto terapéutico no puede ser óptimo cuando se utilizan como drogas independientes. Para superar esta limitación, hemos desarrollado una proteína de fusión de las citoquinas antiinflamatorias IL4 y IL10. Aquí, describimos los métodos de producción y control de calidad de la proteína de fusión recombinante de IL4-10 y probamos la eficacia de la proteína de la fusión de IL4-10 para resolver el dolor en un modelo murino de dolor inflamatorio persistente.
Introducción
Dolor crónico sigue siendo una de las más debilitantes y tratamiento problemas médicos del siglo XXI, que afecta a > 20% de la población adulta1,2. Sin embargo, los tratamientos para aliviar el dolor crónico son a menudo ineficaces o deben suspenderse debido a efectos secundarios graves3. Importante, actualmente fármacos disponibles sólo proporcionan alivio sintomático, pero no significativamente modificar o curar el dolor crónico. Aunque el dolor crónico parece ser un desorden neurológico, la evidencia sugiere la implicación del sistema inmune en el desarrollo de dolor crónico
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices internacionales y previa aprobación del Comité local de ético experimental. Sangre fue obtenida desde el servicio de donantes de Mini (Mini donantes Dienst, MDD) en la Universidad médica centro de Utrecht (UMCU) en los países bajos. El MDD ha recibido la aprobación positiva de la Comisión de ética médica de la UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) para el protocolo número 07-125/C.
1. Caracterización y producción de proteínas
- Cultivo de células
Nota: Consulte la Tabla de materiales para medio de cultivo utilizado.- ....
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Resultados
Una imagen representativa de un gel de SDS-PAGE que contiene diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de cromatografía de afinidad se muestra en la figura 1A. En la carga (L) y el flujo a través de fracciones (FT), se observan todas las proteínas presentes en el sobrenadante HEK293. Ninguna proteína se observa en la fracción de lavado (W). En la fracción de elución (E), se observan dos bandas de 35 y 37 kDa correspondientes a d.......
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Discusión
Este manuscrito describe métodos para la producción y caracterización de un recombinante de la proteína de la fusión de IL4-10 y métodos para probar su eficacia en la inhibición de hiperalgesia inflamatoria en modelos de ratón de dolor inflamatorio persistente. La producción y purificación de la proteína de fusión de IL4-10 se realiza en pequeña escala. Se seleccionan las células HEK293 como sistema de expresión para la producción de proteína porque permiten modificaciones post-traduccionales que no pueden lograrse en si.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Parte de este trabajo ha sido financiado por una ciencias biológicas de la Universidad de Utrecht conceda
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Células de riñón embrionario humano |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium Life | technologies 12338018 | Medio de cultivo | |
| 293fectina Reactivo | Invitrogen | 12347019 | Reactivo de transfección |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Medio de suero reducido para uso durante transfecciones de lípidos catiónicos |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | medios preactivados para acoplar anticuerpos u otras proteínas grandes |
| Ácido clorhídrico fumante 37% | Merck | 1003171000 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | S7653-1kg | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | 31437 | |
| Clorhidrato de Trizma | Sigma | T3253-500G | Clorhidrato de TRIS |
| Ácido Acético 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glicina-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Farmacia, UMCU | solución salina tamponada con fosfato | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tampón Tris/glicina/SDS para electroforesis SDS |
| Mini-PROTEAN TGX Geles | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS geles prefabricados |
| Trans-Blot Turbo Paquete de transferencia | BIO-RAD | 170-4157 | Paquetes de transferencia Western blot |
| Yarra 3u SEC-2000 columna | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | listo para usar Tinción de proteína Coomassie para geles de poliacrilamida |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R& D | DY217B | |
| TNF&alfa humano; Set ELISA | Diaclona | 851570020 | |
| BCA Pierce Kit de ensayo de proteínas | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carragenina | Sigma-Aldrich | 22049 | mucopolisacárido |
| vegetal CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | adyuvante para vacunas |
| Jeringa Hamilton | Sigma-Aldrich | 20779 | jeringa de vidrio |
| Animal Enclosure | IITC Ciencias de la Vida | 433 | Recinto para animales |
| Von Frey Soporte de malla | IITC Ciencias de la Vida | 410 | Soporte de malla |
| Von Frey pelos | Sondas sensoriales | Stoelting | 58011 |
| Prueba plantar (método Hargreaves) | IITC Life Science | 390G | prueba plantar con vidrio calentado |
| Prueba dinámica de rodamiento de peso | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M Prueba | déficit postural |
| Columnas Econo-Column de vidrio, 1,5 y veces; 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | columna de cromatografía en vidrio |
| Tubo de diálisis SnakeSkin | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Filtro de jeringa | Sartorius | 16555-K unidad de filtro de | un solo uso, 0,45 μ M |
| CASY Contador y Analizador de Células | Roche |
Referencias
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widesp....
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Reimpresiones y permisos
