Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.
Abstract
מניפולציה ג'ין במיוחד בלב פלאטין באופן משמעותי את החקירה של מחלות לב pathomechanisms, הפוטנציאל הטיפולי שלהם. In vivo המסירה הגן הספציפי דום לב מושגת בדרך כלל על ידי משלוח מקומי או סיסטמי. הזרקת מערכתית דרך וריד הזנב היא קלה ויעילה לתמרן את ביטוי גנים הלב באמצעות וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 (AAV9). עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור עבור התמרה חושית יעילה, עלול לגרום איברים nontarget ג'ין התמרה חושית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה ו לחיסכון בזמן של הזרקת intramyocardial עבור ויוו מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה (ללא אוורור), שרירי החזה ראשיות ומשניות היו גזור בלשון בוטה, בלב העכבר נחשף במהירות על-ידי הוצאתו ידני דרך חתך קטן ברווח הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, אדנו קידוד לוציפראז (לוק), קולטן ויטמין D (VDR), או סיכת ראש קצר RNA (shRNA) מיקוד VDR, הוזרק עם מזרק המילטון לתוך שריר הלב. הדמיה עוקבות ויוו הפגינו שלוציפראז הזה היה בהצלחה overexpressed באופן ספציפי בלב. יתר על כן, ניתוח תספיג אישר את ביטוי מוצלח או להחרשת VDR בלב העכבר. לאחר mastered, ניתן להשתמש בטכניקה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים כגון nanogels בלב העכבר.
Introduction
מחלת לב היא הגורם המוביל של התחלואה והתמותה ברחבי העולם1,2. העדר אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות עבור הלב מסכני כולל אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב מושך אינטנסיבית חקר pathomechanisms כבסיס וזיהוי של אפשרויות טיפוליות הרומן3. עבור האלה החקירות מדעי, מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב הוא בשימוש נרחב4,5. מניפולציה ג'ין הלב יכולה להיות מושגת על ידי הגנום עריכת בעזרת נוקלאז activator דמוי אפקטור את תמלול חזק (TALEN), מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) / CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) כלים, או דרך אספקה של חומרי גנטי חוץ רחמי (למשל, וקטורים וירוס נושאת גנים קידוד חלבונים עניין)6. למרות הגנום עריכה מאפשר שינויים הגנום ייתכן ומדויק בעכברים חי, זה עדיין מהגידולים ועתירת תרגול6. לחלופין, מניפולציה ג'ין הלב ספציפיים על-ידי וירוס וקטוריים או הפרעה קטנה מסירה מורכבת RNA (siRNA) יש לבצע6.
וירוס משלוח וקטור ללב העכבר למבוגרים מושגת על ידי בערך שתי אסטרטגיות: הזרקה מקומית או מערכתית. הזרקת מערכתית של cardiotropic serotype של AAVs כגון AAV9 היא לא פולשנית הלב גנים ספציפיים מניפולציה7. עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור הכרחי עבור התמרה חושית יעילה של ביטוי גנים, עלול לגרום משמעותי התמרה חושית של איברים nontarget כגון שרירים, כבד7. הזרקת וירוס המקומית מושגת על ידי הזרקת intramyocardial או משלוח intracoronary7. משלוח intracoronary מוביל הפצת וירוס בתוך הלב לעומת הזרקה intramyocardial אפילו יותר. עם זאת, החסרונות של שיטה זו הם כביסה מהירה החוצה של וקטורים ויראלי מחזור מערכתי, התמרה חושית איברים nontarget8, וכן את הדרישה של מכשירי מדידת לחץ במהלך המבצע. לעומת זאת, מאפשר הזרקת intramyocardial השמירה וירוסים יותר שריר הלב, כמו גם משלוח באתר מסוים, אבל זה נכשל לפיזור אחיד ויראלי וקטור7. לבעלי-חיים קטנים, משלוח intracoronary קשה מבחינה טכנית לבצע, בעוד הזרקת AAV9 מערכתית, הזרקת intramyocardial הם יותר נפוץ התאמן4,5,7. למרות הזרקת מערכתית הוא קל לביצוע, הזרקת intramyocardial המקובלת דורש אוורור מכני ניקור חזה גורמת נזק לרקמות נרחב, הרבה זמן.
בדו ח זה, אנחנו תיאר שיטה נוחה לחיסכון בזמן, יעילה במיוחד עבור intramyocardial הזרקה. אדנו קידוד לוציפראז VDR, או shRNA מיקוד VDR, הוזרק לתמרן ביטוי גנים הלב. לאחר mastered, ניתן להשתמש בשיטה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים בלב העכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של הבריאות הנחיות על שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעל חיים של המכון. עכברים C57BL/6J זכר (בגילאי 8-10 שבועות) שימשו כל הניסויים. עכברים שוכנו בתנאים ללא הפתוגן ב 24 ° C ± 4 ° C, תחת מחזור/כהה 12-h, עם גישה חופשית מים ומזון.
1. הכנת אדנו פתרון
- עם ההגעה של הפתרון אדנו מטוהרים, לאחסן את הפתרון במקפיא-80 ° C.
הערה: הזריקה אדנו בוצעה בעכברים קיימא. כדי להבטיח העקרות של וקטור אדנו, אדנו (לוציפראז קידוד, VDR או shRNA מיקוד VDR) הוכנו וטיהרו מסחרית9,10. - ביום של הניתוח, להוציא את הפתרון אדנו מטוהרים (3 x 1010 פלאק ויוצרים יחידות [pfu] /mL) מהמקפיא-80 ° C, להפשיר פתרון וקטור אדנו על קרח.
- לשים על facemask כפפות סטריליות, שמלת סטרילי.
- הכנת 50-µL של מזרק המילטון אשר יש עברו עיקור כפוי יום לפני הניתוח.
הערה: עבור עיקור, המזרק המילטון היה עטוף גזה והניח מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה. המצב של "עיקור עבור המוצק" נבחר והחלה עיקור היה על-ידי לחיצה על כפתור "התחל". - לאחר מלאה הפשרתו של הפתרון אדנו מטוהרים, לרסס את הצינור המכיל אדנו פתרון עם 75% אתנול, להעביר את הפתרון אדנו לתוך תא סטרילי למינארי.
- ב תא סטרילי למינארי, תשאף 50 µL אדנו פתרון באמצעות המזרק המילטון ללא מחט, ואחריו מצורף של מחט 30 G כדי המזרק המילטון.
- . תחזיק את המזרק עם המחט 30 G כלפי מעלה, דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק עד המחט מתמלא פתרון אדנו (אושר על ידי הופעת הטיפות הפתרון הראשון מהקצה מחט).
הערה: זה לוקח כ 45 µL פתרון כדי למלא את המחט 30 G, אז עכשיו כמעט אין פתרון מוצגת במזרק. - משתמשת במזרק מוכן לעיל לרוקן בזהירות אחר פתרון אדנו µL 30 ולמקם את המזרק רצ'ט באופן רופף על הקרח לשימוש עוקבות.
2. הרדמה והכנות פעיל
- להוסיף 20 מ"ל איזופלוריין לתוך מכשיר אידוי איזופלוריין, והתחבר מאדה איזופלוריין את מיכל חמצן.
- פתח את השסתום. ותן את החמצן זרימת ממיכל חמצן מאדה איזופלוריין. לשמור על קצב הזרימה חמצן ב 2 ל'/דקה באמצעות צג זרימת חמצן במאדה איזופלוריין.
- לגרום הרדמה של העכבר עם 4% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) למשך 2 דקות בתוך כלוב מפלסטיק מחובר מאדה איזופלוריין.
- להוציא את העכבר anesthetized מן הכלוב פלסטיק, לאבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה ב תא סטרילי למינארי ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) באמצעות קונוס האף.
- לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.
- קרם עיניים סטרילי חלות על כל עין כדי להגן על הקרנית מפני ייבוש.
- מגלח את החזה והבטן העליונה. להחיל קרם depilatory הנמכרים באתר מגולח עבור מינימלית 1 להסיר את הקרם depilatory, שנותרו פרווה עם פדים רטוב.
- לחטא באתר כירורגית (החלק התחתון השמאלי של החזה) עם 3 קרצוף של חיטוי יוד-chlorhexidine מבוסס (למשל entoiodine). מכסים באתר כירורגית עם תלוי סטרילי.
3. Intramyocardial הזרקה של אדנו בלב העכבר
- . תוריד את הכפפות ולהניח על זוג חדש של כפפות סטריליות.
- לחטא מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים, זוג מספריים כירורגיים, ולחץ בעל מחט ביום שלפני הניתוח בקול רם טמפרטורה/גבוהה מעקר (ראה הערה שלב 1.4).
- עושים חתך בעור 0.5 ס מ לאורך הקו המחבר בין מצאתי את בית השחי. בלשון בוטה לנתח את החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן עם מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים.
- לחשוף את בצלעות על ידי מפסק את החזה הגדולים ואת שרירי החזה משנית. . נקבי ופתח לחלל הבין-צלעי הרביעי (או לחלל הבין-צלעי הרחב באמצעות התבוננות) עם עוצר דימום מיקרו-יתושים.
- לדחוף הלב לכיוון החתך כדי להחצין את הלב עם האצבע המורה. של היד-הדומיננטי בהקשת בעדינות כנגד הצד הימני של הקיר החזה.
- בעדינות לאבטח את הלב מוחצן עם האצבע והאגודל של היד האחרת.
- להזריק סך של 30 µL אדנו פתרון לתוך שריר הלב של החדר השמאלי בשלושה אתרים (הגחון, הגבי ו לרוחב הקיר של החדר השמאלי) באמצעות המזרק המילטון מלא עם אדנו (איור 1C) עם היד הדומיננטית.
- לאחר סיום הזרקה, מיד מקום הלב בחזרה לחלל intrathoracic.
- לפנות באופן ידני את האוויר בחלל intrathoracic בהקשת קיר החזה בעדינות לכיוון מקום החתך בעור.
הערה: פינוי אוויר מוצלח יכול להיות שמעידים נפנוף של החזה גדול, שרירי החזה קטין הנגרמת על ידי האוויר גורשו. - לסגור את העור על ידי מזרון אופקי תפר בתפר משי 5-0.
הערה: החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן צריך לא להיות sutured, כי הם רק בלשון בוטה ביתר מבנים אנטומיים שלהם ניזוקו במהלך הפעולה.
4. לאחר הניתוח ניהול
- לנהל הבופרנורפין (3 מ"ג/ק"ג) פעמיים מדי יום באמצעות הזרקה תת-עוריים כדי להפחית את הכאב עבור ה 48 הראשון אחרי מבצע11.
- לאחר המבצע, מיד לשמור על העכברים על משטח חום (37 מעלות צלזיוס) עד החלים לחלוטין. הנח את העכבר בחזרה לכלוב לאחר מלא התאוששות מתקלה.
- לחטא את המזרק המילטון בשימוש ואת מחט מזרק 30 G מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה (ראה הערה שלב 1.4). לאסוף את המחט מזרק 30 G סטיריליים במיכל החדים.
5. דימות in Vivo למדידת ביטוי לוציפראז הלב
- ביום 5 לאחר ההזרקה אדנו, להכין פתרון מניות טריים של luciferin ב- 15 מ ג/מ ל תמיסת מלח פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 µm.
- Intra-peritoneally להזריק העכברים ער הפתרון luciferin-150 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
- הפעל את מערכת הדמיה.
- לאחר אוטומטי בדיקה עצמית של מערכת ההדמייה, לבחור את מצב הדמיה כמו "זורח" ובצע את ההגדרות הבאות: חשיפה: אוטומטי; Binning: 8; FStop: 1; עירור: לחסום; פליטה: פתוח.
- ב- 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, עזים ומתנגד העכברים בזריקה כלורין (300 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.
- לאבטח העכברים anesthetized על הבמה הדמיה מחומם במצב שכיבה, עם החזה לכיוון המצלמה.
- לאסוף תמונות (תמונה 1 עבור כל עכבר) ולכמת את עוצמת האותות על ידי ציור זהה מדידה מעגלית אזורים מעניינים (ROI) סביב בית החזה.
- לאחר האוסף של תמונות, להקריב את העכברים ולאסוף את הרקמות כאמור בסעיף הבא.
6. קצירת רקמות
- בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת וירוס (איור 1B), עזים ומתנגד העכברים עם 4% איזופלוריין, ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין באמצעות קונוס האף ואבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה.
- עושים חתך הגחון קו האמצע בצוואר הקדמי. חושפים את עורק תרדמני של ממש על ידי מפסק השרירים omohyoid, שריר הצוואר.
- להקריב את העכברים מאת transecting עורק תרדמני נכון, וגומר את הדם.
- עושים חתך הגחון קו האמצע בבטן. לחתוך את הצלעות משני צידי הצלעות לאורך הקו midclavicular, ו transect הסרעפת.
- לחשוף את הלב על-ידי הרמת מצאתי. לאתר של אבי העורקים ולהסיר בעדינות את רקמת השומן perivascular.
- נקרר אבי העורקים, retrogradely perfuse את הלב עם מחט 30 G המצורפת מזרק 1 מ"ל מלא 0.5 מ של 4 ° C בופר פוספט (PBS).
- לאחר זלוף, לסלק את הלב, ומחלקים אותו לתוך מתגלה ימינה ושמאלה. לסלק את הכבד, הריאות, הטחול.
- לאחר שני שוטף ב- PBS קר (4 ° C), לאחסן כל רקמות שנאספו בנפרד בקבוקונים קריוגני בחנקן נוזלי.
7. קביעה של ביטוי חלבון
- להכין מאגר המגון על-ידי הוספת קוקטייל מעכב פרוטאז לתוך מאגר פירוק זמינים מסחרית ביחס של 1: 100. לחשב את הנפח הכולל מבוסס על מספר דוגמאות יעובדו. לשמור על המאגר המגון מוכן ב 4 ° C לשימוש עוקבות.
- להוציא את רקמות ממיכל חנקן נוזלי. שוקלים את הרקמה על סולמות דיוק גבוהה (כ 60 מ"ג עבור כל פיסת הרקמה).
- להעביר את רקמת צינור 1.5-mL microcentrifuge. מיד מוסיפים 200 µL המגון מאגר precooled כדורי ברזל 1.5 מ מ (4 ° C) לתוך הצינור microcentrifuge.
- לאבטח צינורות microcentrifuge precooled (4 ° C) מחזיקי מתכת רקמה אוטומטית מכונת גריסה, ומתחילים המגון על-ידי הפעלת המכונה ההגדרות הבאות: תדירות: 70 הרץ; זמן: 120 s.
- לאחר המגון, centrifuge את homogenate (16,000 × g, 4 ° C), בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL עם פיפטה 100 µL.
- להוסיף טעינת מאגר לפתרון החלבון supernatant (5 x) ביחס של 1:4, denature החלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- רמות ביטוי חלבון את הלב ואת רקמות איברים אחרים נוספים המפוקחים על-ידי ניתוח תספיג (נציג התוצאות יוצגו ב- 2C איור , איור 3) לפי הפרוטוקול12שתואר קודם לכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול הניסוי וחלק השלבים המפתח עבור שיטת דיווח מוצגים באיור1. ב- 5 ימים לאחר הזרקת intramyocardial אדנו קידוד לוציפראז (עו ד-לוק), ויוו הדמיה בעכברים עו ד-לוק מוזרק המצוין ביטוי חזקים של לוציפראז במיוחד בלב (איור 2 א, ב'), אשר היה לאשר תספיג ניתוח (איור 2C), רומז העדר איברים nontarget התמרה חושית. לעומת זאת, אין ביטוי לוציפראז זוהה בעכברים שליטה. בקנה אחד עם ביטוי מוצלח של לוציפראז, ווסטרן כתם ניתוח הציע ולעלייה משמעותית VDR ביטוי החדר השמאלי של עכברים מוזרק עם אדנו קידוד VDR (עו ד-VDR) (איור 3 א). יתר על כן, עו ד-shVDR הזרקת הקטינה באופן משמעותי VDR ביטוי החדר השמאלי (איור 3B). לעומת זאת, הביטוי VDR לא משמעותית השתנה ב החדרים נכון אף עו ד-VDR מוזרק עכברים או עו ד-shVDR מוזרק עכברים (איור 3C, יח), כי אדנו היה רק מוזרק חדרית שריר הלב השמאלי.
איור 1 . הסכימה עבור העכבר intramyocardial הזרקת וג'ין ביטוי גילוי הפרוטוקול. (א) איור המציג שלושה אתרים הזרקת בשריר של החדר השמאלי. (B) פרוטוקול לגילוי גנים ביטוי בלב העכבר לאחר ההזרקה של וירוסים המצוין. עו ד-לוציפראז: אדנו קידוד לוציפראז; AdVDR: אדנו קידוד VDR; AdshVDR, אדנו shRNA קידוד מיקוד VDR. (ג) להחליפן בתמונות מציג מספר השלבים של השיטה שונה להזרקה intramyocardial העכבר. א . פינוי הפרווה על ידי קרם depilatory זמינים מסחרית. b. עיקור של האתר כירורגית עם המדים 3 של povidone יוד. ג. כיסוי באתר כירורגית עם תלוי סטרילי. ד 0.5 ס מ מבצעים חתך לאורך הקו המחבר מצאתי ובית השחי. אי קהה דיסקציה של החזה גדול, שרירי החזה קטן עם מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים. פ הוצאתו של הלב. ג זריקה של 30 µL אדנו פתרון לתוך שריר הלב של החדר השמאלי דרך המזרק המילטון. h - אני הסגר של העור על-ידי תפירת התיק-מחרוזת בתפר משי 5-0. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . זיהוי לוציפראז הביטוי ליבה. (א) תמונות שנאספו על ידי מערכת הדמיה מציג את האות זורח של הלב בקרת עכברים ועכברים מוזרק עם אדנו של קידוד לוציפראז 5 ימים לאחר ההזרקה. (B) עוצמות האות זורח בקבוצות שונות (n = 3) הם נתון סטטיסטי על ידי מבחן t . p < 0.01 לעומת בקרת עכברים. (ג) תספיג ניתוח תוצאות מציג לוציפראז רמות החלבון בלב, ריאות, כבד, טחול ב המצוין קבוצות ב 5 ימים לאחר הזרקת אדנו (n = 3). מאז לוציפראז ביטוי התגלתה רק בלב של עו ד-לוק מוזרק עכברים, ניתוח סטטיסטי לא בוצעה. עו ד-לוק: אדנו קידוד לוציפראז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . זיהוי VDR הביטוי ליבה. (א) הדף פאנל: תספיג להקות מראה רמות VDR החדר השמאלי (איפה אדנו מוזרק) ביום 0, 5 ימים, 7 ימים, ו-14 ימים לאחר ההזרקה VDR-עו ד. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). התוצאות היו מנורמל נגד GAPDH, המרה לקפל שינוי יחסית ליום 0. בכיוון אחד השונות (ANOVA) ואחריו פוסט-הבחינה Bonferroni (שונויות שוות ההנחה) או Tamhane שלאחר הבדיקה (שונויות שוות שלא הנחתי) בוצע לשם ניתוח סטטיסטי. p < 0.05 או * *p < 0.01 לעומת יום 0. החלונית העליונה (B): תספיג להקות מראה רמות VDR החדר השמאלי ביום 0, 3 ימים, 5 ימים, ו- 7 ימים לאחר ההזרקה עו ד-shVDR. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). p < 0.05 לעומת יום 0. (ג) הדף פאנל: תספיג להקות רמות VDR מראה החדר הימני (איפה אדנו לא מוזרק) ביום 0, 5 ימים, 7 ימים, ו-14 ימים לאחר ההזרקה VDR-עו ד. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). החלונית העליונה (D): תספיג להקות רמות VDR מראה החדר הימני ביום 0, 3 ימים, 5 ימים, ו- 7 ימים לאחר ההזרקה עו ד-shVDR. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדו ח הנוכחי מדגים טכניקה שונה להזרקה intramyocardial של וקטורים נגיפי עבור מניפולציה ג'ין הלב, אשר היה שונה משיטה של אוטם שריר הלב אינדוקציה על-ידי גאו. et al. 13 . כעת, ויוו אפיון של פונקציות גנים ספציפיים לרוב לערב את הדור של העכברים הטרנסגניים3,14,15,16,17 או נוק , אשר הוא יקר, זמן רב ו מהגידולים. לחלופין, מסירה של וקטורים ג'ין או siRNA בזריקה מקומית או מערכתית נהוגה גם נרחב עבור מניפולציה ג'ין ב מחקר הלב וכלי הדם-4,-5,-7. בפרט, הזרקת intramyocardial לא ניתן להחליף על מניפולציה ג'ין לב בנסיבות מסוימות: מתי האתר ביים הזרקת היא חובה (למשל, גבול אזור ההזרקה במודל אוטם שריר הלב)11; כאשר מניפולציה ג'ין בעל הגבלת משך הוא נדרש (למשל, אדנו הזרקה). . הנה, הראינו כי בשיטת הזרקת intramyocardial ששונה הוא פשוט לחיסכון בזמן, יעילים ביותר.
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול לפתרון בעיות:
על הפעולה המוצלחת של פרוטוקול זה, יצויין מספר שלבים קריטיים. לפני וירוס שואבת, האוויר בתוך המזרק המילטון, המחט המצורפת לפנותן, אחרת האוויר מוזרק לתוך שריר הלב עלולים לגרום אקטואלי לב לפציעה או אפילו מוות. כדי למנוע עוד יותר את הבעיה, המזרק המילטון מוכן לשימוש מלא עם אמצעי אחסון נאותים וירוס לא יוצבו עם תום הבוכנה כלפי מטה, כי זה עשוי באופן ספונטני תשאף אוויר על-ידי חומרת הבוכנה מתכת. הרדמה צריך להיות לפקח בקפידה, כפי הרדמה עמוקה עלולה לעכב את ההחלמה שלאחר הניתוח, הרדמה עמוקה באופן חמור עלול לגרום למוות. לאחר הרדמה נאותה, הלב צריך לא להיות externalized בחלל החזה בכוח, שכן זה עלול לגרום לפציעה חמורה ריאות. אכן, הוצאתו הלב תקין דורש רק דחיפה עדינה של הלב, התנגדות כלשהי עשוי להצביע על דוחפים לכיוון הכיוון לא תקין.
מגבלות של הטכניקה:
חיסול של צנרור בטכניקה זו, אשר מפחית את הזמן הדרוש לקבלת ההליך, עולה כי ההליך הזרקת intramyocardial להסתיים בתוך חלון זמן מוגבל יחסית כדי למנוע מוות. הניסיון שלנו, הלב צריך לא להיות externalized במשך יותר מ-30 s, כי זה מגביר את שיעור התמותה ומאט את ההחלמה שלאחר הניתוח. לכן, מומלץ השימוש צנרור הניסיונות הראשונים של הפרוטוקול המתואר כאן. מגבלה נוספת היא התפלגות לא אחידה של וקטורים ויראלי מועברים על ידי שיטה זו, אשר קיים גם בשיטות קונבנציונליות של הזרקת intramyocardial7. יתר על כן, השיטה המתוארת כאן הוא יותר שימושי עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בלבבות שציווית, אשר יכולה להיות מלווה את הקמת מחלות לב שונות מודלים18,19,20, 21,22,23. עם זאת, השימוש של השיטה הנוכחית באספקת סוכנים פצועים ללבבות לבבות infarcted ייתכן מוגבל, כי אלו עכברים לא אוכל לסבול את ההליך.
משמעות לגבי שיטות קיימות:
הזרקת intramyocardial המקובלת דורש צנרור ו אוורור מכני24, וזה מקשה על אתר עקב מהירות עכבר פעימות ההזרקה. בעיות אלה להאריך באופן משמעותי את פעולת הזמן13, ובכך מגדילים וריאציות שמציב משך ההשהיה. הטכניקה שונה המוצג כאן הוא מהיר ומאפשר מיקום האתר הזרקה מדויקת נאבטח באופן ידני את הלב מוחצן; בסך הכל, באופן משמעותי שמגדיל יכולתו המחקר העוקבות. יתר על כן, חיסול של צנרור, אוורור מכני להפוך את השיטה שונה נגיש כמעט כל מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית עבור חוקרים צעירים מכובד (81625002), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81470389, 81270282, 81601238), התוכנית של שנגחאי אקדמי למחקר מנהיג (18XD1402400), שנגחאי העירוני חינוך הנציבות Gaofeng ברפואה קלינית גרנט תמיכה (20152209), מרכז פיתוח בית החולים של שנגחאי Shenkang (16CR3034A), אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי (YG2013MS42), שנגחאי ג'יאו טונג אוניברסיטת בית הספר לרפואה (15ZH1003 ו- 14XJ10019), שנגחאי שיט התוכנית (18YF1413000), ואת התוכנית חדשנות לתואר שני במכללה לרפואה Bengbu (Byycx1722). אנו מודים ד ר Erhe גאו לעזרתו קודמים במעבדה שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
