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Artículo de método

Micro-disección del órgano del esmalte de incisivo de la mandíbula de ratas expuestas a tóxicos ambientales

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DOI:

10.3791/57081

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29 de marzo de 2018

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1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

En este artículo

Resumen

Comprensión esmalte formación y posibles alteraciones requiere el estudio de la actividad de ameloblast. Aquí, describimos un método confiable y consistente para micro-disecar órganos del esmalte que contiene fase de secreción y maduración de ameloblastos que pueden utilizarse para los procedimientos experimentales más cuantitativos y cualitativos.

Resumen

Defectos del esmalte resultante de las condiciones ambientales y formas de vida son las preocupaciones de salud pública debido a su alta prevalencia. Estos defectos resultan de la actividad alterada de las células responsables de la síntesis del esmalte ameloblastos, que se presentan en el órgano del esmalte el nombre. Durante la Amelogénesis, la ameloblastos seguir una secuencia específica y precisa de los eventos de proliferación, diferenciación y muerte. Una rata en continuo crecimiento incisivos es un modelo experimental adecuado para el estudio de fases de actividad y diferenciación de ameloblast en condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, describimos un método confiable y consistente para micro-diseccionar el órgano del esmalte de las ratas expuestas a tóxicos ambientales. El epitelio dental micro disecados contiene fase de secreción y maduración de ameloblastos que pueden ser utilizado para experimentos cualitativos, tales como ensayos de inmunohistoquímica y la hibridación en situ , así como para los análisis cuantitativos como RT-qPCR, RNA-seq y Western blotting.

Introducción

Muchos defectos del esmalte del desarrollo pueden resultar de la exposición a tóxicos ambientales o estilo de vida inadecuado1,2,3,4. Caracterización de alterar moléculas de amelogenesis utilizando el procedimiento descrito en la actualidad y eventos promoverá el uso de defectos del esmalte resultante como marcadores tempranos de la exposición a varias sustancias tóxicas y puede ayudar a reconstituir la historia de la salud de cada paciente durante el período perinatal cuando el esmalte es sintetizado1,2. Síntesis del esmalte pueden dividirse en cuatro etapas principales dependiendo de ameloblast actividad5. El primer paso reagrupa la proliferación celular y pre-ameloblast precursor. Durante el segundo paso, la ameloblastos diferenciados secretan proteínas de la matriz del esmalte (EMPs), principalmente amelogenina, enamelin y ameloblastin, que determinan el grosor del esmalte final. Así, cualquier interrupción de la síntesis de EMP conduce a defectos cuantitativos del esmalte. Después de la deposición del grueso esmalte completo, comienza la etapa de maduración. Durante esta etapa, el crecimiento de cristalitos de apatita en anchos y espesores permite el esmalte alcanzar el cociente más alto de mineralización en un tejido biológico, hasta el 96% en peso. Alterar los eventos que ocurren durante la maduración etapa pueda cualitativa defectos del esmalte. Por último, ameloblastos entran en una fase de maduración posterior, también llamada pigmentación en roedores y experimentan apoptosis durante la erupción de diente haciendo defectos del esmalte (si cualquier) irreparable e irreversible, así defectos proporcionan potenciales grabación retrospectiva de ameloblast tensiones. En roedores, Amelogénesis siguen una secuencia similar de eventos con la particularidad que sus incisivos crecen continuamente y que hace que sean un modelo adecuado para estudiar el proceso general de amelogenesis. Por lo tanto, cualquier alteración de la Amelogénesis produce alteraciones de esmalte calidad y/o cantidad, dependiendo de la ventana de tiempo de los eventos disruptores. En ese sentido, la exposición a dioxinas, plomo y productos químicos interrupción endocrina (EDCs) tales como Bisfenol A (BPA), genisteína y vinclozolina, han demostrado generar esmalte hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Manchas opacas blancas asimétricas se identificaron en los incisivos de ratas expuestas a una dosis BPA dosis bajas durante el período fetal y el primer mes después del nacimiento1. Estos defectos del esmalte en ratas y los de incisivo molar humano hypomineralization (MIH), comparten características clínicas, estructurales y bioquímicas similares. MIH es una patología del esmalte dental recientemente descrita, para que la etiología sigue siendo incierta9,10 a pesar de muchos factores causales haber presumido9,10,11 ,12.

Otra patología de hypomineralization del esmalte importante debido a factores ambientales es fluorosis dental (DF), que es la consecuencia de la absorción de fluoruro excesivo (> 0,1 mg/kg/día)13,14. La principal fuente de flúor es el agua potable que es complementado o enriquecido naturalmente con fluoruro. El fluoruro también a menudo se prescribe para prevenir la caries dental, pero la dosis profiláctica es de sólo 50% menos que el tóxico uno (≤0. 05 mg/kg/día). MIH y DF, dos patologías frecuentes, resultantes de la exposición a factores ambientales, pueden presentar características comunes que se caracteriza por la potenciación de los efectos hypomineralizing de flúor combinado con otras sustancias tóxicas como interruptores endocrinos2 o amoxicilina15.

Micro-la disección del órgano del esmalte de rata que contiene ameloblastos en etapas diferentes de la diferenciación le ayudará a entender el mecanismo de acción de moléculas capaces de perturbar la actividad de ameloblast y causar defectos del esmalte a ser diagnosticado después de la erupción dentaria. En otras palabras, la caracterización de los cambios de esmalte gene expresión y esmalte matriz composición debido a las sustancias tóxicas ambientales permite la reconstitución de la historia de exposición a sustancias tóxicas y facilita el monitoreo de seguridad ambiental para el público salud.

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Protocolo

Todos los animales utilizados en el presente estudio se mantuvieron con arreglo a las directrices para el uso y cuidado de animales de laboratorio del Ministerio francés de Agricultura (A-75-06-12).

1. animal exposición a sustancias tóxicas

  1. Antes de realizar este protocolo, obtener aprobación institucional necesario y asegúrese de cumplir con todas las pautas de cuidado de los animales.
  2. Aplicar el diseño del Protocolo de investigación que permite la Constitución de los diferentes grupos experimentales para probar el impacto de la molécula (s) investigado en la etapa de secreción de ameloblast y la etapa de maduración de ameloblast. Aquí, se constituyeron cuatro grupos de ratas Wistar macho dependiendo de su exposición a fluoruro (NaF) en combinación o no con BPA (figura 1A)2. Todos los animales fueron observados y disecados en el día 65 (figura 1B).

2. disección de Hemi-mandíbulas de ratas adultas

  1. Eutanasia ratas por CO2 asfixia, opcionalmente seguida por decapitación a la cabeza separada del resto del cuerpo. Exponer a ratas a CO2 por 5 min en una caja dedicada16.
  2. Retire toda la piel de los labios inferiores con bisturí #11 para obtener fácil acceso a los incisivos inferiores.
  3. Con el mismo bisturí, haga una incisión entre los dos incisivos inferiores con una ligera presión y la mandíbula se dividirá en dos mitades.
  4. Cortar la articulación temporal mandibular con un escalpelo para separar la mandíbula y mantenga la mandíbula hemi con pinzas finas.
  5. Corte de los tejidos blandos circundantes con un bisturí y retire todos los músculos, tendones y ligamentos con una espátula hasta que el hueso esté completamente limpio.

3. aislamiento del incisivo17,18

  1. Cepille cuidadosamente el hueso colocando la hoja paralela al eje longitudinal mayor del incisivo. Desde la cresta ósea cerca de las puntas de la incisivo (extremo proximal) hasta el final de la incisivo cerca el lazo cervical. El movimiento de la incisión se procede desde proximal hacia distal.
  2. Realizar un primer corte distal en el bucle cervical con el escalpelo para quitar el gonion de la mandíbula de hemi y permiten sacar la incisivo fácilmente sin dañar el bucle cervical o la etapa secretoria de la ameloblastos (línea roja en la figura 2).
  3. Hacer un segundo corte por debajo de la segunda molar e insertar el bisturí entre el hueso y la superficie medial de la incisivo. Cuando se levantó por todo el hueso basal, gire hacia fuera el incisivo y despegar con cuidado para evitar el esmalte tejido órgano deterioran con unas pinzas finas.

4. micro-disección del órgano del esmalte bajo lente Binocular

  1. Colocar 200 μL de tampón de fosfato salino (PBS 1 X) en el incisivo con una pipeta. Tome el incisivo con pinzas finas con la superficie labial hacia arriba. Marque con un bisturí entre el incoloro y el naranja del tejido. Esta marca corresponde a la mancha blanca subyacente que es observable luego (figura 2).
  2. Raspar con un excavador o herramienta equivalente, la superficie celular de la marca de bisturí el extremo apical correspondiente a ameloblastos (incoloro) fase de secreción y de la marca del bisturí a la punta del incisivo de la ameloblastos de maduración etapa (naranja).
  3. Eliminar el tejido de 2 mm correspondiente a la etapa de transición, como el anteriormente descrito19. No abra el incisivo durante la disección de órganos del esmalte para evitar la contaminación por el mesénquima.
  4. Corte el bucle cervical situado inmediatamente en la parte apical del incisivo (figura 2) como se describió anteriormente20.
  5. Recoger en 10% formalina o lisis solución para posteriores investigaciones (véase Tabla de materiales).

5. colección de tejidos de órgano esmalte separado para otras investigaciones

  1. Colocar 200 μL de tampón de PBS 1 X en el incisivo.
  2. Con una hoja de bisturí #11, separar con cuidado las células epiteliales dentales gradualmente en el buffer, por separado para cada etapa con la ayuda de la marca del bisturí previamente.
  3. Para células RNA y proteína extracciones, poner el tejido en una solución de lisis que permite la extracción de proteínas y ARN (véase Tabla de materiales).
    Nota: Preparar alta calidad RNAs girando la excavadora de tejido en el tubo, y luego moler las células hasta obtener una mezcla homogénea. La mezcla está lista para las extracciones de RNA y proteína según procedimiento del fabricante, que fue previamente descrita2,8,17. Lo general, alrededor de 5-10 μg total RNAs y 150 μg de proteínas totales se obtuvieron para cada preparación.
  4. Para el análisis histológicos, inmunohistoquímica (IHQ) e hibridación en situ (ISH), ponen la capa de células en formalina al 10% durante 2 h, y después almacenar a 4 ° C en PBS 1 X. El tejido puede entonces ser embebido en cera/parafina o tejido OCT para secciones congeladas.
  5. Extracciones de EMP, tomar el incisivo con pinzas finas. Después de una breve exposición al aire (deshidratación leve), una mancha blanca será visible alrededor de la parte media de la superficie labial del incisivo, que representa la iniciación de la mineralización del esmalte. Esta mancha blanca corresponde a la transición- / principios etapas de maduración de ameloblastos, así que utilizarlo como un indicador para extracción de EMPs21.

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Resultados

Muchos defectos del esmalte como resultado de condiciones ambientales debido a la absorción excesiva de fluoruro o similares a MIH debido a la exposición a algunos interruptores endocrinos1, hypomineralization del esmalte fluorosis dental12,13, 7,22. Estos defectos del desarrollo del esmalte pueden ser reproducidos experimentalmente en ra...

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Discusión

Actividad de ameloblast alterada o interrumpida ameloblast proliferación, diferenciación y maduración procesos plomo a defectos del esmalte irreversible y, a su vez, la caracterización de los defectos del esmalte puede ayudar a desarrollar el entendimiento de la alteración actividad de ameloblast durante amelogenesis. Así, los estudios sobre el órgano del esmalte aislados son determinantes para dilucidar los eventos patológicos que al esmalte defectos cualquiera que sea su origen, ambiental o genética.

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Universidad París-Diderot, el Instituto Nacional francés de salud e investigación médica (INSERM) y el Instituto francés de investigación odontológica (IFRO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bisfenol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formalina 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FranciaTR118
Tampón RLTQiagen, Les Ulis, Francia74126RNeasy Protect Mini Kit
Anticuerpo contra el receptor de andrógenosSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816anticuerpo policlonal de conejo
PBS 10xEUOMEDEXET330. A
Fluoruro de sodio (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast regularLeica microsystems, Nanterre cedex,  Francia39601006llamada was/parafin en el tejido de texto
OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, Francia411243
Tijeras Bonn Extra Finas - Rectas/8,5 cmPHYMEP , París, Francia14084-08
Mango para hojas de bisturí - 12,5 cmPHYMEP, París, Francia10035-12
Hoja de bisturí curvaPHYMEP , París, Francia10035-20
Cuchillo de disección - punta fina/rectaPHYMEP , París, Francia10055-12
Cuchillo circularPHYMEP, París, Francia10059-15
hojas de bisturí n° 11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, Francia233-0024
lente binocularLeica biosystems, Nanterre cedex,  FranciaMZFLIII

Referencias

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343(2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1(2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503(2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

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