Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Summary

Este estudio presenta un protocolo para el tejido reversible claro, immunostaining, renderizado 3D y análisis de redes vasculares en las muestras de vellosidades de la placenta humana del orden de 1-2 mm³.

Abstract

Intercambio de nutrientes y gases entre la madre y el feto se produce en la interfase de la sangre materna intervelloso y la vasta red capilares vellosa que compone gran parte del parénquima de la placenta humana. La red capilar vellosa distal es la terminal de la fuente de la sangre fetal después de varias generaciones de ramificación de los vasos que se extienden hacia fuera desde el cordón umbilical. Esta red tiene una envoltura celular contigua, la capa de barrera de trofoblasto sincitial, que evita la mezcla de sangre fetal y la sangre materna en el que está continuamente bañado. Insultos a la integridad de la red capilar placentaria, que ocurre en enfermedades como la diabetes, hipertensión y obesidad, consecuencias presente riesgos de salud graves para el feto, bebés y adultos. Para definir mejor los efectos estructurales de estos insultos, se desarrolló un protocolo para este estudio que refleja la estructura de la red capilar del orden de 1-2 mm³ en donde uno puede investigar sus características topológicas en su completa complejidad. Para lograr esto, se disecan los racimos de vellosidades terminales de placenta y la capa del trofoblasto y el capilar endothelia immunolabeled. Estas muestras se clarifican entonces con un nuevo tejido claro proceso que hace posible adquirir pilas de imagen confocal a z-profundidades de ~ 1 mm. Las representaciones tridimensionales de estas pilas son luego procesadas y analizadas para generar medidas de la red capilar básica tales como volumen, número de ramas capilares y extremos de la rama capilar, como validación de la idoneidad de este enfoque para caracterización de la red capilar.

Introduction

Nuestra comprensión de la placenta en desarrollo y sus patologías es, en gran medida, limitada a inferir relaciones espaciales entre las vellosidades adyacentes y capilares contenidos derivados de las secciones histológicas. En este estudio, hemos abordado este problema mediante el desarrollo de los medios para generar renders de (3D) tridimensionales de redes capilares placentarias humanas que son convenientes para el análisis de las características de la red capilar (por ejemplo, ramificación, solidez). Para ello hemos combinado coloración inmunofluorescente con dos productos de limpieza del tejido comercial, Visikol-1 y Visikol-2 (en adelante como solución 1 solución 2).

La placenta humana es un complejo enorme de los vasos sanguíneos situados en la interfase entre la sangre intervelloso de la madre y el feto en desarrollo. Extendiéndose hacia fuera desde su inserción en la placa coriónica, el cordón umbilical se ramifica en una red de arterias y venas que ramifique para cubrir la superficie coriónica con una elaborada red vascular. Sus extremos entonces penetran hacia abajo en el interior o la profundidad del disco placentario, donde se someten a varias generaciones más ramificadas y terminan en las vellosidades terminales y sus contenidos redes capilares, el sitio del intercambio de gases, nutrientes, y metabólicas desechos entre la sangre fetal y materna.

Insultos a la red capilar placentaria durante el desarrollo tienen consecuencias duraderas para la salud del feto, recién nacido y el adulto emergente ^1,2,3. Debido a patologías relacionadas con el embarazo como aborto espontáneo, restricción del crecimiento intrauterino, la preeclampsia y la diabetes ^4,5,6 allí es un alto valor a desarrollar métodos de medición y caracterización de las redes capilares vellosas placentarias. Un obstáculo importante es que las redes vasculares placentarias abarcan una amplia gama de escala. Las redes vasculares superficiales pueden ser tan grandes como 4-5 mm de diámetro. Los terminales capilares vellosos son del orden de 10 -20 μm de diámetro; la placenta contiene más de 300 km de vasos sanguíneos ⁷. En la actualidad, hay algunas técnicas fáciles de usar y rápidas que pueden captar estos extremos de la escala del buque. Hasta la fecha, sólo un pequeño número de vellosidades puede hacerse por microscopia. Por ejemplo, Jirkovska et al se centró en la vellosidad placentaria en término, combina la microscopia confocal con seriales secciones ópticas a intervalos de 1 μm de secciones gruesas de 120 μm; no hay datos sobre el número de muestras estudiadas ni estadísticas recibieron ⁸. Se identificaron estructuras capilares, y contorno de las vellosidades y los tubos capilares fueron dibujados a mano, con trazos exportados por análisis de imagen. Mientras que los autores discuten las implicaciones de sus hallazgos para la "creciente red vascular vellosa", dichas conclusiones son problemáticos cuando sólo "término" (36 + semanas edad gestacional) tejido se estudia. Asimismo, Mayo et unal. y Pearce et al. confiaron en el tejido de la misma edad, para sus simulaciones de sangre transferencia de flujo y el oxígeno, pero sus análisis se limitaron a solamente unos término, vellosidades terminales ^9,10 . Estereología también se ha aplicado al estudio de la estructura de los vasos vellosos. Pero una vez más, el foco ha sido generalmente en embarazos posteriores entregando a niños liveborn con uno o más embarazo complicaciones ^11,12.

Hasta hace poco, la microscopia confocal se limitaba a imágenes a 100-200 μm de profundidad del tejido debido a la absorción de la excitación y la emisión de la fluorescencia por el tejido que lo recubre ¹³ . Aunque tejido claro e histología 3D han sido ampliamente descritos en la literatura y hay numerosos métodos para el tejido, claro muchos son inadecuados para el uso con los tejidos en general, ya que dañar irreversiblemente morfología celular a través de la hiperhidratación de proteínas o eliminación de los lípidos. Por lo tanto, no es posible validar que estos resultados son indicativos del propio tejido y no artefactos de procesamiento mientras que nuestro tejido claro proceso es una técnica reversible que es capaz de validar contra la histología tradicional. Claro de tejido implica generalmente uno de tres enfoques principales: 1) uniforme que empareja del índice de refracción (RI) de los componentes tisulares por inmersión en soluciones coincidentes de RI, que elimina la dispersión de la luz acumulada causada de lentes debido a la continua fluctuación de bajo RI (citosol) y altos componentes de RI (proteína/lípidos); 2) remover componentes lípidos a modo de incrustación en hidrogel y utilizando la electroforesis, difusión para quitar los componentes de lípidos; 3) expansión/desnaturalización de la estructura de las proteínas para permitir la mayor penetración de solventes para fomentar la uniformidad de RI ¹³. Mientras que estos enfoques pueden representar los tejidos transparentes y permiten generar representaciones 3D de biomarcadores, estas representaciones 3D son de cuestionable valor clínico ya que es difícil determinar si estas imágenes son indicativas de las propiedades del tejido o del tejido claro proceso. Por otra parte, ya que nuestro tejido claro es reversible estándar histológica o immunohistochemistry puede aplicarse al mismo tejido para evaluar si las alteraciones son clínicamente significativas.

Este estudio presenta un análisis de 47 muestras vellosos distales de un total de 23 embarazos clínicamente normales y electivo terminados entre gestación y partos normales de dos termino 9-23 semanas terminados. Inmunofluorescencia de etiquetado de trofoblasto y endothelia ha permitido un análisis cuantitativo y automatizado de cambios en las redes vasculares vellosas y su complejidad.

Con este protocolo, había aislado y había analizado previamente vellosidades terminales y sus redes capilares en una escala no es posible. Este enfoque, cuando se aplica al desarrollo de la red capilar y velloso a través de la gestación identificará aquellas propiedades que son la base para el nacimiento de un niño sano. Cuando se aplica a los estudios de embarazos complicados, también aclarará cuando y cómo las patologías placentarias modifican los árboles vellosos y las redes de capilares que la envoltura, y cómo éstos inciden en el bienestar fetal.

Protocol

Este protocolo sigue las pautas del Instituto del estado de Nueva York para la investigación básica en discapacidades del desarrollo Comité de ética de la investigación en humanos.

1. disección del árbol velloso

1. Enjuague con formol fijada el tejido de la placenta con pulir fosfato salina (PBS)¹⁴ para eliminar el formol y coloque en una placa Petri sobre la platina de un microscopio de disección. Uso de bisturí y pinzas finas para el tejido de la placenta aparte para ubicar árboles vellosos (estructuras ramificadas filiformes blanco). Diseccionar piezas del árbol de vellosidades (varios mm de largo) y transferir el tejido a un micro tubo conteniendo ~ 1 mL PBS.

2. coloración inmunofluorescente

1. Con una pipeta, quite el PBS y reemplácelo con PBS fresco. Deje reposar por 10 min con agitación ocasional. Repetir una vez más.
   Nota: Este paso y los pasos se realizan a temperatura ambiente excepto la incubación del anticuerpo primario.
2. Usando una pipeta, quitar y reemplazar el PBS con PBS 0.1% Triton-X100 + 2% de suero de cabra (PBS-T-GS) para permeabilizar el tejido y bloque de fijación no específica de anticuerpos secundarios. Incubar durante 30 minutos.
3. Reemplazar el PBS-T-GS con PBS que contenga 2% de suero de cabra, tanto ratón monoclonal anti-CK7 y conejo anti-CK7.
   1. Incubar el tejido durante la noche a 4 ° C.
   2. Quitar los anticuerpos restantes por lavado con PBS-GS durante 10 minutos con agitación ocasional.
   3. Quite el PBS-GS y reemplácelo con PBS-GS que contiene ambos cabra anti-ratón IgG junto con una emisión verde (520 nanómetro) fluoróforo y cabra anti-conejo IgG acoplado un emisor infrarrojo (652 nm) fluoróforo.
   4. Quitar los anticuerpos repitiendo paso 2.1.
   5. Guarde el tejido immunolabeled a temperatura ambiente en la oscuridad.

3. clarificación del tejido

1. Lavar las muestras 3 veces con PBS a intervalos de 10 minutos.
2. Deshidratar el tejido eliminando el PBS con una pipeta y sustituir con etanol al 50% (el metanol puede utilizarse también). Incubar durante 10 minutos sustituir con etanol 50% fresco e Incube por 10 minutos repetir esto una vez más para un total de 3 incubaciones. Repita las incubaciones con un 70%. Entonces sustituir con etanol al 100% e incubar durante 15 minutos (como alternativa se puede utilizar metanol).
3. Con unas pinzas de punta fina, transferencia de tejido para un fresco tubo de micro que contiene ~ 1 mL solución 1 durante 4 horas.
4. Con pinzas de punta fina, transferencia de tejido a un fresco tubo de micro que contiene solución-2 para ~ 4 h.
   Nota: Cuando se almacena en la oscuridad, la inmunofluorescencia es estable a temperatura ambiente durante al menos 6 meses.
5. No mezclar con cualquier solución acuosa, (por ejemplo, medio de montaje) como el claro se perderá.

4. montaje para microscopía

1. Como el tejido es suave y fácilmente deformado, no instale el tejido entre un portaobjetos de vidrio estándar y un cubreobjetos.
2. Consulte la figura 5B y montar el tejido en una cámara de Sykes-Moore como sigue;
   1. Con pinzas de punta fina Coloque un cubreobjetos redondo de 25 mm en la cámara de base.
   2. Con una pinzas de punta fina para colocar la Junta de goma en la base sobre el cubreobjetos.
   3. Con una pipeta, coloque una gota (40 μL) de solución-2 en el centro del cubreobjetos.
   4. Con las pinzas de punta fina transferir un pedazo del tejido de 2 solución a la caída en el centro del cubreobjetos.
   5. Coloque un cubreobjetos de segunda en la parte superior de la Junta.
   6. Enrosque el anillo de fijación en la parte superior de la base el cubreobjetos y el empaque de compresión hasta que esté firme.
      Nota: Tenga cuidado de no apretar demasiado o se romperá el cubreobjetos.
   7. Inserte una aguja calibre 22 en un puerto en la base y a través de la Junta.
   8. Llene una jeringa de 3 mL con ~ 1,5 mL de solución 2.
   9. Montar una aguja de calibre 25 en la jeringa.
   10. Inserte la aguja de la jeringa en el orificio opuesto y a través de la Junta.
   11. Asegurar que el aire de la cámara se está ventilando a través de otra aguja de calibre 25, suavemente inyectar solución-2Y llenar la cámara.
   12. Retire la aguja y la jeringa y coloque la cámara sobre un portaobjetos de cristal de la platina del microscopio confocal.
3. Por otra parte, corte personalizados pozos fuera de hojas de silicona PDMS.
   1. Con una tijera corta un 25,4 x 25,4 mm² pedazo de la hoja de PDMS.
   2. Con un bisturí corta ~ 12.7 x 12.7 mm² en la pieza.
   3. Pulse la pieza firmemente sobre un portaobjetos de microscopio.
   4. Llenar el pozo hasta la parte superior con solución-2.
   5. Transferencia de la pieza de tejido desde el tubo de micro al centro del pozo.
   6. Con pinzas de punta fina Coloque un cubreobjetos sobre el pozo tal que la parte inferior del cubreobjetos se humedece con solución-2.
   7. Monte el conjunto de cámara de Sykes Moore con el tejido en la platina del microscopio confocal.

5. confocal microscopio

1. Poner el tejido en la cámara en foco con el objetivo 10 x.
2. Mover arriba y abajo la platina del microscopio a través del plano focal para medir la distancia entre la parte superior e inferior del tejido.
3. Mover el escenario en 2,5 μm pasos para recopilar un archivo de imagen confocal que contiene un conjunto de imágenes a través del tejido de arriba hacia abajo.

6. revertir la tala

1. Revertir la deforestación al transferir el tejido a un micro tubo que contiene > 20 x el volumen de etanol al 100%. A 1 h intervalos sustituir con etanol al 70%, 50% de etanol y PBS. Almacenar a 4 ° C en la oscuridad.
   Nota: Ahora procesar el tejido para inclusión en parafina estándar, seccionamiento e histológico o tinción inmuno-histoquímica.

7. deconvolución

Nota: Para los siguientes pasos, comandos de software, las pestañas y menús desplegables están en cursiva.

1. Inicie el software de deconvolución y abra el archivo de imagen.
2. Introduzca los parámetros enumerados en la ventana de'Summary'.
   1. Para 'espaciamientos entre el voxel x, y y z dimensiones en μm.
   2. Para cada canal de color, seleccione el tinte fluorescente utilizado para la inmunotinción en el menú desplegable.
   3. Para el 'modalidad ', seleccione láser Confocal de barrido en el menú desplegable.
   4. Para el 'objetivo ', seleccione 10 x en el menú desplegable.
   5. Para el 'medio de inmersión ', aire de seleccionar en el menú desplegable.
   6. Haga clic en el 'Aplicar ' botón.
3. Haga clic en la ficha'Deconvolution'.
4. Haga clic en 'deconvolución 3D' en el menú desplegable.
5. En el '3D - deconvolución ' ventana de asegurar que los valores son: 1) Adaptive ciego PSF, PSF 2) teórico, 3) utilización (PSF adaptativo por defecto, 10 iteraciones, ruido medio), nombre 4) Base.
6. Haga clic en el 'enlace Check' para iniciar el programa.
7. Cuando haya terminado, repita los pasos 7,3-7.6 para reiniciar el programa. Cuando termine reiniciar por tercera y última vez.
8. En el 'Data Manager' ventana, haga clic en el archivo con el prefijo "10-10 - 10-".
9. Haga clic en el 'File' ficha, haga clic en 'Guardar como '.
10. En la ventana de'Guardar As' Seleccione 'entero sin signo de 8 bits ' de la 'tipo de datos ' menú desplegable y haga clic en guardar.

8. tratamiento de la imagen

1. Inicie el software de Fiji.
   1. Haga clic en 'archivo ', haga clic en 'abierto ' haga clic en y seleccione el archivo de imagen Deconvolved las 'abierto ' botón en el 'abierto ' ventana.
   2. Haga clic en 'canales de imagen/Color/Split y convertir la imagen del archivo en tres nuevos archivos que contiene solamente un color. Guarde el archivo de imagen roja que contiene el conjunto de imagen capilar velloso immunolabeled. Elimine los archivos de imagen de verde y azul.
   3. Restar la fluorescencia de fondo desde el archivo de imagen roja con: 'proceso/restar fondo '.
   4. En el menú desplegable establece radio de la bola de balanceo en 10 píxeles.
   5. Deja sin marcar las opciones de 4 menú y haga clic en 'OK'.
   6. Haga clic en 'sí en el menú de la pila del proceso.
   7. Eliminar la fluorescencia tejido inherente (autofluorescencia) abriendo el 'imagen/ajustar/brillo-contraste ' menú y ajustar los valores mínimo, máximo, brillo y contraste. Tenga cuidado de no quitar ninguna de la inmunofluorescencia capilar.
   8. Minimizar el restante fluorescencia irrelevante mediante la apertura de la 'umbral de ajuste de imagen ' menú y ajuste los controles deslizantes que se destaca la inmunofluorescencia capilar. Compruebe el 'fondo oscuro ' de la caja y haga clic en 'Aplicar '. En el 'convertir a binario desplegable ' cheque menú el 'negro fondo ' de la caja y haga clic en 'OK'. Guarde el archivo de imagen en blanco y negro (binario) para el análisis a continuación.

9. Análisis

1. Objeto de conteo y Skeletonization.
   1. Seleccione el archivo de imagen binaria que se creó en el paso 8.1.8.
   2. Haga clic en 'Analyze/3D OC ' opciones ' y comprobar sólo 'volumen ' y 'tienda resultados...' cajas en el menú desplegable. Asegúrese de que la casilla de 'Mostrar números' esté desactivada. Haga clic en el 'OK' botón.
   3. K de CLIcen 'analizar/3D objetos contador '. En el menú desplegable, configurar 'tamaño filtro: min ' a 5000. Asegurar que la ' caja deexcluir los objetos en los bordes está desactivada. Comprobar que el 'objetosestadísticas y 'Resumen ' cajas se comprueban. Haga clic en el 'OK' botón.
      Nota: Esto puede tardar varios minutos dependiendo de la configuración de tamaño y equipo de archivo.
   4. Guardar la tabla de Estadística y el archivo de mapa de los objetos.
   5. Seleccione el archivo de mapa de los objetos. Haga clic en '2D-3D de Plugins/esqueleto/Skeletonize ' para skeletonize la red capilar en el archivo binario. Haga clic en 'archivo/guardar como. Seleccione 'Tiff...' en el menú desplegable. En el guardar como ventana TIFF añadir "Skel" al nombre de archivo de mapa de objeto y haga clic en el 'Guardar ' botón.
   6. Haga clic en '2D-3D esqueleto analizar/esqueleto/analizar '. En el menú desplegable aceptar la configuración predeterminada y haga clic en el 'OK' botón. Guardar la tabla rama de 'información' , la ' tabla deresultados y dos archivos de salida (Skel-objetos-labeled - esqueletos y el esqueleto con la etiqueta).

Results

Los renders 3D generados de los capilares en racimos de vellosidades terminales en placenta humana de 8 semanas de edad gestacional al parto prematuro fueron contados como racimos individuales y esqueleto para análisis de redes. Las unidades funcionales de la placenta (figura 1A) son los árboles de vellosidades que son una extensión de los recipientes superficiales donde penetraron el parénquima de la placenta (figura 1

Discussion

La Junta de revisión institucional aprobó la colección de tejidos vellosos placentarios para la fijación de formalina de embarazos terminados electivo. Antes de que los procedimientos se realizaron, una breve revisión de su expediente médico tomó nota de la edad materna, paridad y confirmó la ausencia de médicos subyacentes (p. ej., hipertensión, diabetes y lupus) o fetales (anomalías cromosómicas o estructurales, crecimiento anormal) fue realizado. La hoja de datos y las muestras obtenidas fueron etiquetadas só...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de formaldehído al 10% (p/v) en tampón de fosfato acuoso	Macron Fine Chemicals	H-121-08 Agente de	fijación general, fórmula lista para usar, tenga cuidado ya que los vapores son
tóxicos Hojas de bisturí	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Bisturí	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Pinzas finas	Servicios	de microscopía electrónica78354-119
Microtubo (1,7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma	D8537	PBS
Pipeta	VWR	52947-948	desechable, pipeta de transferencia de 3 ml
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Diluida al 0,1% de stock
Suero de cabra	Gibco	16210-064	Diluir a 2% en solución PBS
Ratón monoclonial anti-ck7 Queratina 7 Ab-2 (Clon OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Conejo Anticuerpo anti-CD31	Abcam	ab28364
verde emisor (520 nm) fluorocromo	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
emisor de infrarrojos (652 nm) fluorocromo	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Etanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Diluir hasta concentraciones más bajas usando PBS según sea necesario
Solución-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Cámaras Skyes-Moore BellCo	Glass Inc.	N/P 1943-11111
aguja de calibre 25	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Necesita
jeringa de 3 mL	Jeringa desechable	ThermoFisher Scientific	14-823-40
Hojas de silicona PDMS Microscopio confocal	McMaster-Carr	N/P 578T31
	Nikon Inc.		Nikon C1 Microscopio Confocal
Software de deconvolución	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji software			gratuito, de código abierto  disponible en
https://fiji.sc Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	Componente 1 de SelecTech H& Sistema de tinción E
Eosina Alcohólica	Leica Biosystems	3801615	Componente 2 de SelecTech H& Sistema de tinción
E Blue Buffer Leica	Biosystems	3802918	Componente 3 de SelecTech H& Sistema de tinción E
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	componente 4 de SelecTech H& Sistema de tinción E
Sistema de detección de inmunohistoquímica	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Sistema de detección Quanto HRP DAB