Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Resumen

Este estudio presenta un protocolo para el tejido reversible claro, immunostaining, renderizado 3D y análisis de redes vasculares en las muestras de vellosidades de la placenta humana del orden de 1-2 mm³.

Resumen

Intercambio de nutrientes y gases entre la madre y el feto se produce en la interfase de la sangre materna intervelloso y la vasta red capilares vellosa que compone gran parte del parénquima de la placenta humana. La red capilar vellosa distal es la terminal de la fuente de la sangre fetal después de varias generaciones de ramificación de los vasos que se extienden hacia fuera desde el cordón umbilical. Esta red tiene una envoltura celular contigua, la capa de barrera de trofoblasto sincitial, que evita la mezcla de sangre fetal y la sangre materna en el que está continuamente bañado. Insultos a la integridad de la red capilar placentaria, que ocurre en enfermedades como la diabetes, hipertensión y obesidad, consecuencias presente riesgos de salud graves para el feto, bebés y adultos. Para definir mejor los efectos estructurales de estos insultos, se desarrolló un protocolo para este estudio que refleja la estructura de la red capilar del orden de 1-2 mm³ en donde uno puede investigar sus características topológicas en su completa complejidad. Para lograr esto, se disecan los racimos de vellosidades terminales de placenta y la capa del trofoblasto y el capilar endothelia immunolabeled. Estas muestras se clarifican entonces con un nuevo tejido claro proceso que hace posible adquirir pilas de imagen confocal a z-profundidades de ~ 1 mm. Las representaciones tridimensionales de estas pilas son luego procesadas y analizadas para generar medidas de la red capilar básica tales como volumen, número de ramas capilares y extremos de la rama capilar, como validación de la idoneidad de este enfoque para caracterización de la red capilar.

Introducción

Nuestra comprensión de la placenta en desarrollo y sus patologías es, en gran medida, limitada a inferir relaciones espaciales entre las vellosidades adyacentes y capilares contenidos derivados de las secciones histológicas. En este estudio, hemos abordado este problema mediante el desarrollo de los medios para generar renders de (3D) tridimensionales de redes capilares placentarias humanas que son convenientes para el análisis de las características de la red capilar (por ejemplo, ramificación, solidez). Para ello hemos combinado coloración inmunofluorescente con dos productos de limpieza del tejido comercial, Visikol-1 y Visikol-2 (en adelante como solución....

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas del Instituto del estado de Nueva York para la investigación básica en discapacidades del desarrollo Comité de ética de la investigación en humanos.

1. disección del árbol velloso

1. Enjuague con formol fijada el tejido de la placenta con pulir fosfato salina (PBS)¹⁴ para eliminar el formol y coloque en una placa Petri sobre la platina de un microscopio de disección. Uso de bisturí y pinzas finas para el tejido de la placenta aparte para ubicar árboles vellosos (estructuras ramificadas filiformes blanco). Diseccionar piezas del árbol de vellosidades (varios mm de largo) y transf....

Resultados

Los renders 3D generados de los capilares en racimos de vellosidades terminales en placenta humana de 8 semanas de edad gestacional al parto prematuro fueron contados como racimos individuales y esqueleto para análisis de redes. Las unidades funcionales de la placenta (figura 1A) son los árboles de vellosidades que son una extensión de los recipientes superficiales donde penetraron el parénquima de la placenta (figura 1

Discusión

La Junta de revisión institucional aprobó la colección de tejidos vellosos placentarios para la fijación de formalina de embarazos terminados electivo. Antes de que los procedimientos se realizaron, una breve revisión de su expediente médico tomó nota de la edad materna, paridad y confirmó la ausencia de médicos subyacentes (p. ej., hipertensión, diabetes y lupus) o fetales (anomalías cromosómicas o estructurales, crecimiento anormal) fue realizado. La hoja de datos y las muestras obtenidas fueron etiquetadas só.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de formaldehído al 10% (p/v) en tampón de fosfato acuoso	Macron Fine Chemicals	H-121-08 Agente de	fijación general, fórmula lista para usar, tenga cuidado ya que los vapores son
tóxicos Hojas de bisturí	ThermoFisher Scientific	08-916-5B No. 11
Bisturí	ThermoFisher Scientific	08-913-5
Pinzas finas	Servicios	de microscopía electrónica78354-119
Microtubo (1,7 mL)	PGC Scientifics	505-201
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma	D8537	PBS
Pipeta	VWR	52947-948	desechable, pipeta de transferencia de 3 ml
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	Diluida al 0,1% de stock
Suero de cabra	Gibco	16210-064	Diluir a 2% en solución PBS
Ratón monoclonial anti-ck7 Queratina 7 Ab-2 (Clon OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Conejo Anticuerpo anti-CD31	Abcam	ab28364
verde emisor (520 nm) fluorocromo	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
emisor de infrarrojos (652 nm) fluorocromo	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
Etanol alcohol 200 proof	Pharmco-Aaper	111000200	Diluir hasta concentraciones más bajas usando PBS según sea necesario
Solución-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Cámaras Skyes-Moore BellCo	Glass Inc.	N/P 1943-11111
aguja de calibre 25	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Necesita
jeringa de 3 mL	Jeringa desechable	ThermoFisher Scientific	14-823-40
Hojas de silicona PDMS Microscopio confocal	McMaster-Carr	N/P 578T31
	Nikon Inc.		Nikon C1 Microscopio Confocal
Software de deconvolución	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji software			gratuito, de código abierto  disponible en
https://fiji.sc Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	Componente 1 de SelecTech H& Sistema de tinción E
Eosina Alcohólica	Leica Biosystems	3801615	Componente 2 de SelecTech H& Sistema de tinción
E Blue Buffer Leica	Biosystems	3802918	Componente 3 de SelecTech H& Sistema de tinción E
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	componente 4 de SelecTech H& Sistema de tinción E
Sistema de detección de inmunohistoquímica	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Sistema de detección Quanto HRP DAB

BD de procesamiento de imágenes