Summary
El enfoque del marcador trófica ácidos grasos, es decir, la asimilación de ácidos grasos como toda molécula y transferencia en tejido consumidor leves o no modificación, se ve obstaculizada por las brechas de conocimiento en el metabolismo de ácidos grasos de invertebrados de suelo pequeño. Isotopologue perfilado se presenta como una valiosa herramienta para desentrañar las interacciones tróficas.
Abstract
Los ácidos grasos (FAs) son biomarcadores útiles en ecología trófica porque normalmente son asimiladas como una molécula completa y transferidos en tejido de consumo con menor o ninguna modificación, lo que permite la dieta encaminamiento entre los diferentes niveles tróficos. Sin embargo, el enfoque de marcador trófica FA todavía está obstaculizado por el conocimiento limitado en el metabolismo lipídico de la fauna del suelo. Este estudio utilizó totalmente con ácido palmítico (C16: 013, 99% del átomo) como trazador en vías de metabolismo de ácidos grasos de dos suelos generalizada Collembola, Protaphorura fimata y Heteromurus nitidus. Para investigar la suerte y la modificación metabólica de este precursor, se presenta un método de generación de perfiles isotopologue, realizado por spectrometry total de ion solo bajo control. Por otra parte, se describe el laboratorio aguas arriba experimento de alimentación, así como la extracción y metilación de fracciones dominantes lípidos (lípidos neutros, fosfolípidos) y los relacionados con fórmula y el cálculo. Isotopologue perfilado no sólo rendimiento el enriquecimiento de 13C total de ácidos grasos derivado de 13C etiquetado precursor pero también produce el patrón de isótopos superior a la masa del ion del padre (es decir, el ion molecular de la FA M+) de cada etiqueta FA por una o más unidades de masa (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.). Este conocimiento permite conclusiones sobre la relación de la encaminamiento de la dieta de un FA enteramente consumida en comparación con la biosíntesis de novo . El isotopologue perfilado se sugiere como una herramienta útil para la evaluación del metabolismo de ácidos grasos en animales del suelo desenredar las interacciones tróficas.
Introduction
En un hábitat críptico como suelo, relaciones tróficas son difíciles de dirección y otros están restringidas por el tamaño pequeño de la fauna. La última década ha visto avances en ecología bioquímica, particularmente en el uso de ácidos grasos como biomarcadores para definir las estrategias de alimentación de la fauna del suelo bajo condiciones de campo1,2,3. Esto es basado en el hecho de que ácidos grasos de recursos puede ser incorporados en el tejido del consumidor como moléculas de todas, un proceso denominado enrutamiento dieta4. Transferencia de los ácidos grasos se ha divulgado en tres niveles tróficos, es decir, de hongos a los nematodos para Collembola5. Recientemente, la fauna depredadora se consideró6,7 y las primeras revisiones sobre los ácidos grasos como marcadores tróficos en cadenas alimentarias de suelo han sido publicados8,9.
Información más detallada sobre las interacciones tróficas se alcanza por el isótope estable ácidos grasos (FA-SIP) de sondeo. La determinación de 13C12C proporción en ácidos grasos de las dietas y los consumidores pueden atribuir vínculos binarios y estimar el flujo de carbono asociado, y se ha empleado en terrestre, agua dulce y marinos tróficas10,11 ,12,13. El supuesto básico es que ácidos grasos enrutados dietéticos no están sujetos a procesos enzimáticos; por lo tanto, sus 13C de la señal, es decir, 13C /12C cociente del ácido graso, el consumo es similar a la de la dieta1. Sin embargo, un agotamiento gradual de la firma de 13C en la cadena alimentaria se ha divulgado en los sistemas acuáticos, así obstaculizando el amplio uso de FA-SIP en Estudios tróficos14,15,16. Por otra parte, el conocimiento en el metabolismo de los lípidos en la mayoría de invertebrados en redes tróficas terrestres es todavía limitado.
La comprensión de las vías del metabolismo de lípido en los consumidores es esencial para el uso de ácidos grasos de marcador tróficas como medios para la determinación de los flujos de carbono cuantitativa en ecología trófica. Con esto en mente, 13C-isotopologue perfiles, que en principio puede ser aplicado para la investigación del metabolismo del carbono de cualquier sistema biológico17, es un método prometedor. Después de la introducción de un sustrato de carbono marcada con C 13, la distribución de los 13C en la red metabólica es rastreable desde los productos metabólicos generados en la Feria del consumidor una distribución específica isotopologue. Esto podrá evaluarse cuantitativa resonancia metabólica nuclear espectroscopia18,19 o espectrometría de masas20,21, con las muestras biológicas favorecidas en este último con baja biomasa debido a su mayor sensibilidad.
Aunque isotopologue perfiles ha sido exitosamente aplicado a aminoácidos y proporciona información sobre el metabolismo de carbono en vivo de patógenos bacterianos17,22,23, su implementación en grasos ácidos se ha rezagado. Recientemente se realizó el primer análisis detallado sobre el destino de un isótopo estable que etiqueta del ácido graso precursor, su dieta enrutamiento o degradación a través β-oxidación, en consumidores invertebrados de suelo, por Menzel et al. 24. aquí, se proporcionan las bases metodológicas para los experimentos de incorporación con 13C con ácidos grasos seguidos isotopologue análisis de los principales descendientes de invertebrados de suelo frecuentes, Collembola,. Estos microartrópodos son un grupo de buen modelo ya que son componentes importantes de la web de alimentos del suelo y son bien investigados para su marcador trófica ácidos grasos8,25.
La comprensión de las vías del metabolismo de lípido en los consumidores es esencial para el uso de ácidos grasos de marcador tróficas como medios para la determinación de los flujos de carbono cuantitativa en ecología trófica. El presente Protocolo da el diseño y montaje de un laboratorio de experimento y los procedimientos bioquímicos para la extracción y metilación de las fracciones dominantes de lípidos (lípidos neutros, fosfolípidos) de alimentación de Collembola. Demuestra cómo el isotopologue composición de ácidos grasos se analiza por espectrometría de masas y describe la fórmula relacionado y los cálculos. Este procedimiento resulta en: (i) las relaciones de superior a la masa del ion del padre (es decir, el ión molecular del ácido graso M+) por uno o más isótopos de masa unidades (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.) y (ii) el total 13 C enriquecimiento en ácidos grasos derivados de los precursores con 13C. Aunque utiliza para Collembola, este enfoque puede aplicarse generalmente a cualquier otro tipo de interacción depredador-presa en la premisa de que son cultivables en cantidad suficiente en condiciones controladas para asegurar una captación exitosa etiqueta y posterior verificación.
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Protocol
El protocolo descrito no cae bajo la competencia de la ética Animal. Sin embargo, cuando gente adapta los protocolos descritos en animales superiores, tenga cuidado de que el Comité institucional de ética Animal aprobado el protocolo para el manejo de animales.
1. cultivo de animales
Nota: Todo explicado pasos experimentales se basan en protocolos bien establecidos26,27,28. Biotests en el laboratorio necesita un suministro continuo de los organismos fácilmente cultivables. Aquí, se han utilizado las especies de Collembola Protaphorura fimata (Gisin, 1952) y Hetermurus nitidus (Templeton, 1835). Ambas especies son fáciles de mantener como cultivos de laboratorio productivo alimentados con levadura de panadería.
- En microcosmos de plástico con tapas ajustadas (diámetro 7 cm, altura 4.5 cm), agregar una mezcla de carbón activado, yeso de París y agua destilada para proporcionar un substrato de cría muy húmedo (figura 1A).
- Al preparar la mezcla de microcosmos suficiente sustrato, por ejemplo, para 10 microcosmos en un lote. Mezclar 9 partes de yeso de París (225 g) y 1 parte de dry carbón activado (25 g) junto en una olla de yeso, añadir cuidadosamente como 10 partes de agua destilada (250 mL) y dejar para reposar 5 minutos sin agitación a temperatura ambiente.
- Revuelva con una cuchara de laboratorio a una velocidad moderada en dirección a la derecha para evitar burbujas de aire hasta logra una consistencia espesa de la Aguada. Verter inmediatamente en un microcosmos, a una altura de 1 cm.
- Alisar el yeso suave golpeando en el Banco y remolinos. Tenga en cuenta que los agujeros (productos al azar de las burbujas de aire) y surcos (agregados activamente con una espátula estéril) pueden favorecer Collembola fértil a desovar allí. Este estudio evita los agujeros y los surcos a favor de tener las mismas condiciones reproducibles. Sin embargo, para fines de demostración figura 1B presenta algunos agujeros.
- Permita secar por cerca de 1-2 días a temperatura ambiente; incubación a 60 º C puede reducir entonces a 1-2 h.
- Humedecer el microcosmos antes de usar mediante la adición de agua con una pipeta hasta que el sustrato esté ligeramente húmedo. Mantenga húmedo microcosmos agregando agua destilada regularmente como Collembola tienen una cutícula blanda y es susceptible a la desecación.
- Transferencia de Collembola fácilmente a la base de yeso usando un tubo de succión simple, es decir, un tubo de silicona larga cerca de 25 cm largo con una punta de pipeta equipado con una malla pequeña para evitar succión de animales en el tubo. Alternativamente, transferir animales por lo que les permite adherirse a las cerdas de un cepillo pequeño.
- Transferencia (ver paso 1.2) 30 recién Collembola en microcosmos nuevo y vuelva a proporcionar granulado levadura seca como alimento (sobre una punta de cuchillo) (figura 1B); renovar por lo menos dos veces a la semana. Independiente del plan de tres repeticiones por día de muestreo; en este estudio días 0 - 7 y 14. Incubar a 15 ° C en oscuridad. Mantener que una temperatura constante es esencial, como los ácidos grasos se alteran por metabolismo de los animales para satisfacer las necesidades de fluidez de la membrana.
- Collembola de alimentación con levadura durante cuatro semanas antes de iniciar los experimentos de exposición para obtener una homogénea 13C /12C señal y el patrón de ácidos grasos. Utilizar un tubo de succión o un cepillo para eliminar todos los huevos (figura 1), pellets fecales, y exuvias regularmente como animales pueden alimentarse de ellos alterando su perfil lipídico.
Figura 1: cultivo de Collembola. (A) microcosmos llenado de reproducción sustrato, una mezcla seca de yeso de París, carbón activado y agua destilada. (B) y (C) muestra representativa de una cultura Protaphorura fimata ; Tenga en cuenta las pequeñas pepitas de seca levadura utilizado como la fuente de alimento y también como agujeros en el sustrato de cría (flecha negra) (B) así como dos huevos (flecha blanca) (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. etiquetado dieta, cosecha y manejo de muestra
- Etiquetado
- Cuatro semanas después del establecimiento de las culturas de Collembola, coloque a 30 personas un nuevo microcosmos e incubar a 15 ° C en oscuridad.
- Introducir la etiqueta de pulso de alimentación que contiene un completo 13marcado con C ácido palmítico (13C16: 0, 99% del átomo) mezclando ácido palmítico marcado con C de 13con levadura con una espátula en una relación 0.5:1, por ejemplo, 5 g de levadura de panificación 13 Seco de C16: 0 y 10 g levadura de panadero. Coloque sobre una punta de cuchillo en cada microcosmos.
- Después de 6 h, reemplace este etiquetado alimentos con levadura completamente sin etiqueta.
-
Cultivo más
- Durante el curso del experimento renovar la dieta de levadura cada tres días y agregar cantidades superiores a lo que consumirá Collembola dentro de dicho plazo. Lo más importante, utilice un tubo de succión o un cepillo para eliminar huevos de Collembolan, pellets fecales y exuvias con regularidad para asegurar la alimentación exclusiva por los animales en el alimento proporcionado.
- Cosecha
- Muestra un microcosmos destructivamente diariamente hasta el día 7. Entonces el día 14, se recogen tres repeticiones independientes en cada tiempo de muestreo; períodos de muestreo diferentes son posibles.
- Preparar los tubos de vidrio de 10 mL equipados con tapones recubierto de teflón, uno para cada muestra. Previamente Limpie estos tubos en una lavadora de cristalería y enjuague dos veces con agua desionizada después. Por último, para eliminar cualquier rastro de hidrofóbico contaminantes lavan dos veces añadiendo 2 mL de cloroformo (grado HPLC), vortex áspero y deseche el solvente.
- Para muestras de control (día 0), tomar 3 30 Collembola no expuestos de las pre-culturas como muestras del día 0.
- Para las muestras expuestas (día 1 y en adelante), toma de las muestras diarias en cada caso 3 30 exponen Collembola de las culturas intermedio alimentados con la mezcla de ácido palmítico marcado con C de 13y levadura.
- Registro Collembola peso fresco por un ultra microbalanza. La transferencia de animales utilizando un aspirador o cepillo para cacerolas de escala apropiadas. Para asegurar el fácil manejo de Collembola durante el pesaje en las sartencitas escala animales choque-cool antes (-80 ° C por 2 h). Por otra parte, una corriente de CO2 durante 10 minutos con seguridad puede aturdir animales.
- Directamente después de peso pone animales de las cacerolas de la escala cuidadosamente en tubos de ensayo de vidrio 10 mL. Llenar los tubos con 1 mL de metanol (grado HPLC) y almacenar a-20 ° C hasta su análisis.
Nota: De este paso adelante, evitar muestra manejo con equipo de plástico como se trate de disolventes orgánicos; en su lugar utilice pipetas que son adecuados para solventes así como los recipientes de vidrio y dispensadores.
3. extracción de tejidos animales y metanólisis
- Preparar tres vidrio-tubos de ensayo (equipados con tapones recubierto de teflón) por lote que contiene sólo 1 mL de metanol como valores en blanco. Lo importante es agregar o transferir ningún tipo de disolvente utilizado en este protocolo solamente por pipetas de vidrio o dispensadores resistentes a los solventes Cloroformo/metanol aclarado.
- Al principio del proceso de extracción de lípidos, reducir el metanol para almacenamiento (o esconder) por evaporación; se recomienda un sobremesa compacto concentrador de vacío rotatorio (RVC) equipado con una bomba de vacío y una trampa de frío. Transferir los tubos abiertos en la RVC y evaporar hasta que se seque a 50 ° C y vacío presión de 200 hPa durante 20 minutos.
- Añadir 5 mL de disolvente de extracción monofásico (chloroform/methanol/0.05 M 1:2:0.8 de buffer de fosfato, pH 7,4) a cada muestra (incluyendo espacios en blanco) y extraer lípidos de Collembolan a temperatura ambiente agitando durante la noche (~ 200 rpm).
- Transferir el solvente a nuevos tubos y volver a extraer muestras por agitación durante 3 horas con un adicional 2,5 mL de disolvente de extracción. Después de eso, combinan extractos de dos pasos; se recomienda el uso de Pipetas Pasteur de vidrio. Agregar 0,8 mL de cloroformo y 0,8 mL de agua destilada, luego mezclar y centrifugar a 2.000 g a 20 ° C durante 5 minutos. Finalmente, permite muestras reposar 5 min para la separación de acuosa y cloroformo fases.
- Para el análisis del patrón de ácidos grasos, se dividen los lípidos celulares totales de Collembola en lípidos neutros, glicolípidos y fosfolípidos fracciones.
- Para cada muestra, preparar una columna de sílice ácido (comercial columna con 0,5 g de ácido silícico, malla 100-200 μm del tamaño, véase Tabla de materiales) añadiendo 1 mL de cloroformo (precondicionamiento). Para acelerar este proceso, Monte las columnas en un bloque vacío que como comúnmente se utiliza en cromatografía para extracción en fase sólida. No utilice agujas de nylon; Utilice el acero inoxidable por encima de los tubos.
- Después el cloroformo utilizado en el preacondicionamiento ha pasado a través de la transferencia de columna la fase de cloroformo inferior completa de cada muestra a una columna individual. Para simplificar este procedimiento, la fase acuosa superior se puede quitar de antemano. Utilizar pipetas de Pasteur de vidrio, sin embargo, tenga cuidado de que las columnas no se resequen.
- Sucesivamente eluir fracciones lipídicas con 5 mL de cloroformo (incluyendo neutral lípidos ácidos grasos, NLFAs), 10 mL de acetona (glicolípidos - no analizados en este proyecto) y 5 mL de metanol (incluyendo ácidos grasos de fosfolípidos, PLFAs). Recoger cada fracción en recipientes de cristal individuales.
- Al final de la extracción, reducir el cloroformo (NLFAs) y el metanol (PLFAs) a través de la evaporación en un VCR. Transferir los tubos abiertos a la RVC y evaporar hasta que se seque, ~ 90 min a 60 ° C y un vacío de 24 hPa.
- Iniciar la saponificación de los lípidos (fracciones de la NLFA y PLFA) siguiendo el protocolo de Welch (1991)29 con adición de 1 mL de solución de hidróxido de sodio metanol (45 g de hidróxido de sodio, 150 mL de metanol y 150 mL de agua destilada) e incubar a 100 ° C por 30 min en un baño de agua. Enfriar la muestra en agua helada durante 2 minutos, luego vuelva a colocar las muestras en el Banco y seguir trabajando a temperatura ambiente.
- Añadir el estándar interno a cada muestra, incluyendo los espacios en blanco. Elegir un ácido graso no es común en los organismos experimentales; también utilizar un ácido graso saturado para minimizar la pérdida por escote y seleccionar una molécula con longitud de cadena intermedia. Para muchos propósitos, la nonadecanoic impares ácido (19:0) funciona bien. Por lo tanto, Añadir 30 μl de una solución de 0,74 mM en Isooctano. La cantidad exacta es muy importante - Asegúrese de verificar la precisión de la pipeta con una Microbalanza con antelación.
- Añadir 2 mL de ácido clorhídrico-metanol (mezcla de 325 mL de 6.0 N de ácido clorhídrico con 275 mL de metanol), incubar a 80 ° C por 10 min en un baño de agua y enfriar rápidamente en hielo durante 2 minutos. Este paso es el tiempo y la temperatura sensible; utilizar 80 ± 1 ° C y 10 ± 1 minuto Verifique con cuántas muestras pueden entrar en el baño de agua a la vez mantener los 80 ° C.
Nota: Este procedimiento produce ésteres metílicos de ácidos grasos (famas), es decir, ácidos grasos analitos estabilizados para la vaporización en cromatografía de gases. - Por último, añadir 1,25 mL de hexano/metilo o éter butílico terciario (1:1) y roca suavemente durante 10 minutos, luego centrifugar a 2.000 g durante 5 minutos retirar la fase inferior y mantenga la fase superior conformada por FAMAS; utilizar pipetas de Pasteur de vidrio. Añadir 3 mL de hidróxido de sodio acuoso (10,8 g de NaOH disolver en 900 mL de agua destilada) para un paso de lavado.
- Roca y centrifugar nuevamente.
- Tomar la fase completa de lípidos que contiene superior con una pipeta Pasteur de cristal y la transferencia a un frasco de la muestra de cromatografía de gases equipado con un septum de teflón. Evitar incluyendo incluso pequeñas cantidades de la fase acuosa, ya que esto causará problemas con la medición de GC. Encapsulan vial y almacenar a-20 ° C hasta su análisis.
4. cuantificación de los ácidos grasos por GC-FID
- Uso de cromatografía de gases para identificar y cuantificar las famas en el NFLA y PLFA fracciones de lípidos Collembola (animal). Un cromatógrafo de gases (GC) equipado con detector de ionización de flama (FID) es un equipo establecido y probado30.
- Para identificación de famas, compare el tiempo de retención de picos en la muestra a aquellos en un nivel de fama. Estos son cualitativa o cuantitativa estándar mezcla de clave famas que cubre una variedad de productos alimenticios y de microorganismos.
- Emplean mezclas estándar fama compuesto por FAs representante del grupo de organismo investigado y dieta experimental. En Collembola, son ácidos grasos característicos de eucariotas, por ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga como el ácido araquidónico (20:4ω6). Cuando se emplea la levadura como dieta son marcadores de hongos como el ácido linoleico (18:2ω6). Una buena opción es la llamada mezcla de fama, que comprende 37 diferentes ácidos de grasos frecuentes en animales, hongos y material vegetal y la bacteriana éster metílico del ácido (pondrá) mezclar (véase Tabla de materiales).
- Para ejecutar las muestras en el GC-FID, establecer una secuencia con el software respectivo del instrumento. Para obtener instrucciones, consulte el manual del fabricante. La secuencia comienza con las externas mezclas estándar (por ejemplo, fama y pondrá mix), seguidas de las muestras. ¡Tenga en cuenta que hay un cambio del tiempo de retención, es decir, un ligero retraso en el tiempo de elución de los ácidos grasos de la columna de GC con cada carrera, durante la ejecución de muestras! O bien, incluyen un estándar cada 10th ejecutar en la secuencia de muestra o tiempo de retención de bloqueo para ácido palmítico (16:0).
- Adaptar valores de GC depende del instrumento. El siguiente programa es sugerido para una columna capilar de alto rendimiento (HP) (25 m x 0,2 mm i.d., película espesor 0.33 μm. volumen de inyección Set a 1 μL en modo splitless y utilizar el hidrógeno como gas portador. Emplean un principio de programa de la temperatura a 50 ° C (celebrada durante 1 minuto) y aumentar en 25 ° C min-1 a 175 ° C seguido de 3 ° C min-1 a 230 ° C (sostenido por min 5,7).
- Calcular el ácido graso de nmol por gramo de peso (seco) fresco de organismos con la respuesta obtenida por FID para cada fama aplicando cantidades conocidas de los ácidos grasos respectivos mediante la fórmula siguiente:
Unafama: área del pico de la fama respectiva en la muestra
MWFM: Peso Molecular de la fama respectiva en μg/μmol
Ces: concentración del estándar interno en μg
Unaes: área del pico del estándar interno
mCol: peso fresco (seco) de la respectiva muestra de Collembola en g
1000: factor de conversión de μmol de nmol
cBW: concentración de la fama respectiva en la media de los valores en blanco correspondientes en nmol
5. Análisis de 13C Isotopologue perfilando
- Utilice un sistema de GC acoplado a un Detector selectivo masa (MS) provisto de una fuente de ionización (EI) de electrón para isotopologue determinación.
- Utilice una columna capilar polar (por ejemplo, 23 DB, CP-Sil 88) ya que esto además permite la separación de ácidos grasos insaturados incluso con el mismo número de enlaces dobles. La elección de la columna de GC es crítica para los resultados que determine la buena representación de los iones de la molécula en los ácidos grasos.
- Para una columna de 23 DB (60 m x 0.25 mm i.d., película espesor 0.15 μm), comenzar a temperatura del horno a 130 ° C y aumentar de 6,5 ° C/min a 170 ° C. Seguir con un aumento de 3 ° C/min a 203 ° C y manténgalo presionado durante 1,9 min seguir con un aumento de 40 ° C/min hasta 230 ° C y mantenga para temperatura de línea de transferencia sistema 8,3 minutos a 280 ° C. Otra vez, ajuste el método de GC en el instrumento.
- Utilizan estándares cuantitativos con cantidades conocidas de famas para todos los ácidos grasos ser investigado para la incorporación de 13C. Pone estas normas al principio y al final de cada secuencia de muestra ejecutar. Tomar los tiempos de retención de los ácidos grasos de interés de estas normas.
- Medir las muestras de los experimentos siempre a partir de las muestras sin etiqueta y las sondas marcadas después de eso. Solicitar una relación de división correspondiente a las concentraciones de la muestra, por ejemplo 1:12.5.If disponible para el instrumento, aplicar un enjuague con helio después de cada muestra a clara columna de analitos restantes.
- Aplicar el tiempo de retención de bloqueo para el método GC-MS para que la adquisición de SIM no sufre de desplazamiento y tiempos de retención del analito reproducible.
- Determinar la incorporación de 13C en el ion molecular de los ácidos grasos por GC/EI-MS con el ión seleccionado (SIM) modo de instrumento de monitoreo. Funcionamiento en modo de SIM permite para detectar analitos específicos con una mayor sensibilidad en relación con el modo de escaneo completo.
- Ejecute una exploración inicial para ver lo que está presente y ejecute SIM en los iones correspondientes. Adquirir datos en masas moleculares de interés mediante la selección de ventanas de exploración de m/z (grupos SIM) que abarca el tiempo de pico cromatográfico de los ácidos grasos respectivos. Por lo general, monitorear iones de dos a cuatro por analito y tiempo de la ventana.
- Con el fin de aumentar la sensibilidad, ajustar la velocidad de escaneo masivo y Moran veces (el tiempo empleado en cada Misa). Se obtienen los mejores datos de calidad a la menor velocidad posible y una regla en SIM es generalmente 8 a 12 exploraciones sobre el pico del analito. Un proxy para la configuración del instrumento es un tiempo de permanencia promedio por masa de 9 ms, un tiempo de ciclo de 6 s y un tiempo de análisis de ciclo de 175 ms-1.
- Detectar el ión molecular (M+) de los respectivos ácidos grasos y todos sus isótopos (M+ 1, M+ 2 y así sucesivamente). Para obtener ejemplos, vea representante resultados.
- Registro de la abundancia de cada fragmento de ion (isotopologue). Nota que la abundancia de los iones de la molécula y sus isótopos es relativamente baja y la calidad de cuantificación depende en gran medida el rendimiento del sistema MS. Ejecutar una melodía antes de iniciar una secuencia de muestras grandes (experimento) y limpiar la fuente de iones si es necesario.
Nota: En primer lugar, estos datos rendir el global 13C enriquecimiento de cada ácidos grasos por el precursor consumido (aquí 16:0). - Utilice la proporción de la composición de isótopos de marcado con ácidos grasos de sus contrapartes sin marcar para asignar el flujo de carbono trófica. Utilice la fórmula de % de átomo en el paso 6.1 para calcular el porcentaje de carbono etiquetado (por ciento de atom, atom %) en el correspondiente ácido graso. Comparar el porcentaje de 13C en ácidos grasos de Collembola entre animales sin etiqueta (día 0) y etiquetado (día 1 y más adelante) como indicación relativa para el flujo de 13C de la dieta en el consumo.
- Asignar la posición de 13C incorporación en la cadena de ácido graso. Basado en la distribución de los isótopos desenredar la encaminamiento dietética del ácido graso indicador marcado todo (aquí 16:0) de elongación de la cadena por el metabolismo de los lípidos. Mientras que la abundancia de isótopos más lejano para el ion del padre (M+), por ejemplo, aumenta la asimilación de la molécula del marcador todo M15, M16, con elongación de la cadena por el uso de 13C etiquetado C2 fragmentos (13C acetil-CoA) isótopos cerca el ion molecular consigue más frecuentes.
6. cálculos de enriquecimiento de 13C
- Según la distribución de los isótopos, calcular el porcentaje total del carbono etiquetado (en % de átomos) en el correspondiente ácido graso mediante la siguiente relación: atom % = (ratio 13C isotopologue incorporado) x (frecuencia de la isotopologue respectivo)
Esto se calcula después de Kuppardt et al. 31 como:
donde N es el número de átomos de carbono en el ácido graso, J es el número de isótopos de 13C, AM + J es la abundancia del isotopologue respectivo y unaT la abundancia total de los isótopos. - Para el cálculo, suma los valores de área de pico del ión molecular (M+) de la FA respectivo y los isótopos (M+ 1M+ 2y así sucesivamente), detectado por el análisis SIM-MS y establece en 100% de abundancia relativa. Calcular la porción de cada isotopologue detectado fácilmente siguiendo la regla de tres.
- Restar el valor de control no etiquetados día 0 (fondo natural 13C) de los valores experimentales para obtener datos finales que sólo se remonta a la externa realizada 13C-etiquetado.
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Representative Results
Contenido lípidos y peso fresco de Collembola
En el curso del experimento descrito, el contenido en NLFAs y PLFAs no cambió significativamente con el tiempo, mientras que el peso fresco de las muestras aumentó ligeramente pero no de forma significativa24. Ambos parámetros indican un buen nivel de condición física de los especímenes de Collembola. Tenga en cuenta investigar de Collembola fresco peso y lípidos el contenido durante todo el experimento correspondiente a los días de muestreo para ácido graso y el análisis de isótopo. Tenga en cuenta que una pérdida de peso o una disminución del contenido en lípidos durante el periodo experimental indican una aptitud reducida del organismo de prueba y los datos derivados drásticamente pierden importancia.
Isotopologue detección
El significado especial de isotopologue perfiles de proyectos se encuentra en la individual detección y cuantificación de los iones moleculares y todos isótopos en un ácido graso específico. Por ejemplo, en el caso de 16:0 los iones van desde 270, ión molecular , es decir, M+ (C esqueleto compuesto principalmente de átomos de C 12) a 286 (isotopologue M+ 16 - cadena de carbono totalmente cambiado por el pesado 13C). Figura 2A presenta un espectro de SIM-MS de puro 16:0, palmítico. La abundancia natural de 13C en este compuesto se convierte en perceptible por la presencia de M+ 1 y M+ 2 isótopos además del ión molecular (M+). En comparación, la figura 2B muestra el espectrograma del completamente etiquetado ácido palmítico (atom 99% 13C) utilizado en este estudio. Aquí, la única presencia de los iones M+ 16 refleja la pureza de este etiquetado sintético compuesto.
Figura 2: Análisis de SIM representante de puro (A) sin etiqueta y (B) completamente etiquetado de ácido palmítico. Tenga en cuenta la abundancia natural de M+ 1 y M+ 2 isótopos además del ión molecular (M+) en el C 16:0 (A), pero la presencia exclusiva del isotopologue de+ 16 M en el ácido graso completamente etiquetado (atom 99 % 13C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Desaturación/elongación versus de novo síntesis
Después de la cosecha de los organismos de prueba, extracción de lípidos y derivatización, el famas generados están listos para ser analizados por GC y MS SIM. Por la examinación de isotopologue perfiles de datos, se pueden distinguir ahora entre la síntesis de novo y desaturación/elongación eventos del ácido graso marcador etiquetado todo. El primero puede tener lugar, al menos parcialmente, en base a 13C acetil-CoA como producto de la degradación del precursor con vía de la beta-oxidación. La figura 3 muestra ejemplos representativos de SIM análisis derivados de cuatro ácidos grasos dominantes en la fracción PLFA de H. nítido en el primer día de muestreo después de etiquetado. La asimilación de la molécula del marcador etiquetado en ácido palmítico se hace visible por la abundancia de la M+ 16 - isotopologue, ya que representa el completamente etiquetado ácido graso (Figura 3A - 16:0). Además, la desaturación del 16:0 (figura 3B - 16:1ω7) o alargamiento y desaturación (figura 3 - 18:1ω9, figura 3D - 20:4ω6) puede ser asignado. Por lo tanto, la detección de isótopos más grande que M+ 16, por ejemplo M17 y M+ 18 demostrar elongación de la cadena del precursor con 16:0 por el uso de 13fragmentos de C2. Biosíntesis de novo basado en 13C acetil – CoA de los ácidos grasos se indicaron si el ion molecular cerca de isótopos, es decir, M+ 1 a M+ 2 obtener significativamente más frecuente que en el control representado por muestreo del día 0.
Figura 3: Análisis de representante SIM (monitoreo de iones seleccionados) de iones fragmento en ácidos grasos de Heteromurus nitidus (fracción PLFA, un día después de etiquetado). (A) de ácido palmítico ácido palmitoleico (B) de (16:0) (16:1ω7) (C) el ácido oleico (18:1ω9) y (D) del ácido araquidónico (20:4ω6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ilustrar aún más esto, la figura 4 compara el patrón isotopologue inicial de los cinco ácidos grasos más fuertemente marcados de (analizada en PLFAs y NLFAs); Comparado son los datos de las especies de Collembola fimata p. en el día 0 y día 1. El día 1, la señal de C 13en C16 y C18 FAs casi en su totalidad se basó en la aparición del ión M+ 16molécula, resulten totalmente etiquetado 13C 16:0, complementada a los alimentos. Como se mencionó anteriormente, las huellas observadas de M+ 18 de 18:0 y 18:1ω9 sugieren la introducción de una porción menor de 13C acetil-CoA mediante la elongación de la cadena de 16:0 18:0. Para 18:1ω9 esto fue más pronunciado en la facción PLFA. Estos 13C acetil-CoA proviene de β-oxidación de moléculas de etiquetado 13C 16:0. Incorporación de 13C acetil-CoA también ocurrió en el paso de alargamiento de la longitud de la cadena C18 C20, asignado por el 20:4ω6 de las muestras PLFA. Por lo tanto, el enriquecimiento de 13C en M16 y M18 aumentó significativamente con el tiempo hasta el día 14 (figura 4). Además, M+ 2 de esta 20:4ω6 PLFA en día 14 aumentó en comparación con el día 0 o 1. Esta asignación de 13C en isótopos diferentes indica que la formación de 20:4ω6 se basa tanto en la síntesis de novo con la inclusión de acetil – CoA etiquetada con 13C o en abundancia natural 13C y la alargamiento/desaturación de la molécula del precursor todo 13C16: 0. Por el contrario, claramente etiquetados 20:4ω6 no aparece en la fracción de la NLFA (figura 4).
Figura 4: Patrón de Isotopologue de la incorporación de 13C por SIM (monitoreo de ion seleccionado). Se presentan las porciones relativas de los iones M+ 1 a+ 3 de M y M+ 16 a M+ 20 de las cinco más fuertemente marcada NLFAs y PLFAs de Protaphorura fimata, estimado en el día 0 y día 1. Sólo para 20:4ω6 los datos de 14 días se presentan además. P< 0.05 (prueba de Dunnett con 0 datos como referencia). Esta figura es una reedición de la figura 5 publicado en Menzel et al. 24 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Isotopologue perfiles
Un análisis detallado de los aspectos cuantitativos en la distribución de 13C en FAs necesita tecnología de punta para asignar carbono repartir en redes tróficas. El presente trabajo empleado isotopologue perfilado para evaluar 13C /12C relaciones en común biomarcadores de FA para las interacciones trópico. Este método es establecido para el análisis de aminoácidos por cromatografía líquida (LC-MS) y se aplicó para las investigaciones del metabolismo del carbono en bacterias patógenas17,23. Recientemente, fue perfilado isotopologue desarrollado como una herramienta para el estudio de enrutamiento dietética de lípidos en invertebrados de suelo pequeño por Menzel et al. 24 ya que este método no es obstaculizado por el "llevar encima" de la señal de 13C, por lo tanto es ventajoso para la evaluación del tejido orgánico altamente enriquecido con un isótopo específico comparado con el GC-C-IRMS32.
Con este enfoque, los valores de masa a carga (m/z) en el ion molecular y sus isótopos se determinó por GC-MS IE y SIM modo. En comparación con el análisis completo, se puede aumentar la sensibilidad en la SIM por sobre factor 100, que incluso supera el de rango de cuantificación GC-FID33. Además, por la adquisición de un grupo especificado de iones en un intervalo de tiempo dado, el analito se mide confiablemente a pesar de un fondo de co liberador de picos30. Thurnhofer y Vetter34 demostró que el SIM es conveniente para la identificación de FA y cuantificación en muestras de alimentos incluso con cantidades bajas de lípidos disponibles.
Al usar la SIM para 13C isotopologue perfilar por lo menos dos limitaciones metodológicas tienen que ser considerados. En primer lugar, los iones moleculares son de relativamente baja abundancia y sus isótopos son aún menos. Con una fuente de ion sucio, éstos llegan a ser menos abundantes y en consecuencia el método SIM sólo será semi-cuantitativo33. En segundo lugar, la ocurrencia creciente de 13C en una o más posiciones de carbono del FA disminuye la abundancia natural de 13C de átomos de carbono asociados. Estos cambios con etiquetado son no lineales, un fenómeno llamado "sesgar" en abundancia natural, que puede conducir a la subestimación de enriquecimiento en estas masas20. Este efecto de inclinación debe ser tratadas contablemente utilizando una matriz de corrección basada en estándares de la fama (véase Fernández et al.) o mediante la inclusión de controles naturales, es decir, FAs de organismos experimentales sin etiqueta. El último fue realizado en el presente trabajo comparando el mismo FA etiquetado (día 1 y posterior) y Collembola no etiquetados (día 0).
Dietéticos y 13C flujo
Mientras que las ventajas metodológicas de isotopologue perfilado para la determinación de 13C en FAs son obvias, en vivo metabolismo de los organismos puede ser obstaculizado por medios biológicos. Estado estacionario isotópico y metabólico son difíciles de lograr cuando, por ejemplo, el uso de la dieta o el estado fisiológico de los consumidores no conocen, dificultando la obtención de flujos de carbono absoluta. Sin embargo, comparando 13C isótopos perfiles de FAs en la dieta y el consumidor, puede obtener la proporción relativa de FA asimilación y vías metabólicas. Este enfoque permite siguiente el destino específico de un marcador FA basado en su etiqueta de 13C trazando su enrutamiento dietética. MS-SIM demostró que el marcador de FA se enrutó principalmente en las fracciones NFLA de ambas especies analizadas Collembola del24. Por otra parte, el marcador de FA fue almacenado en los lípidos neutros con sólo leves o ninguna modificación. Se detectaron sólo alargamiento del dietético 13C16: 0 a 18:0 y desaturación a los equivalentes de monoenoic (ver figura 4). La presencia de iones M+ 16 en la C16 y la C18 FAs de muestras día 1 confirma que estos FAs son descendientes de la completada totalmente etiquetados ácido palmítico. Este hallazgo es la base de estudios anteriores que se basan en el patrón de la FA de consumo y dieta únicamente5,35 y sugiere que marcador FAs se incorporan como moléculas de todas tejido consumidor (para una revisión, véase Ruess y Chamberlain8).
Mientras tanto, el patrón de 13C isotopologue del PLFAs reveló que el incremento observado en 13C20:46 con el tiempo debido a la elongación/desaturación del precursor completamente etiquetado FAs y síntesis de novo con el último también está incluyendo 13 C etiquetado acetil-CoA como se indica por la presencia de M+ 18 trazas de iones en C20 y C18 FAs (ver figura 4). Figura 5 resume el enrutamiento dietético complementado 13C16: 0 PLFAs y NLFAs de las especies de Collembola observadas. Curiosamente, sólo 13C de ácido palmítico de PLFAs está sujeta a cambios más fuertes, mientras que la transformación metabólica en el NLFAs seguía siendo limitado a solamente un alargamiento y a dos pasos de desaturación.
Figura 5: Destino de dieta 13C ácido palmítico en lípidos consumidor. Los diagramas muestran el destino propuesto de incorporado 13C16: 0 en las especies de Collembola investigadas. Las flechas simbolizan los distintos niveles de facturación metabólica con diferentes espesores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para resumir, isotopologue perfilado por MS-SIM muestra claramente ese uso FA como marcador trófica es un método robusto y fiable en la ecología de redes tróficas. Aunque el diseño experimental no permitió la cuantificación precisa del flujo de 13C (por ejemplo, como átomo % 13C del FA suplementado) para los diferentes pasos en las vías del metabolismo de la FA, isotopologue perfiles es una herramienta útil para todos los estudios ecológicos utilizando ácidos grasos como marcadores tróficos. Una meta para el futuro es obtener un consumidor cuantitativo presupuesto de carbono de FA mediante sistemas de microcosmos cerrado y alimentar los consumidores define cantidades de etiquetado precursores de ácidos grasos.
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Acknowledgments
Se agradece el apoyo financiero de la R. Menzel y L. Ruess por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1). R. Nehring fue financiado por RU 780/10-1. Finalmente, estamos muy agradecidos al Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke para corregir el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | --- | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
References
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