Summary
تدهور الحمض في الأنسجة المحفوظات والتغاير الورم وعدم وجود عينات الأنسجة المجمدة الطازجة يمكن أن يؤثر سلبا على خدمات تشخيص السرطان في مختبرات علم الأمراض في جميع أنحاء العالم. ويصف هذه المخطوطة الاستفادة المثلى من لوحة المؤشرات الحيوية باستخدام مقايسة حبة مغناطيسية متعدد لتصنيف سرطان الثدي.
Abstract
تدهور الحمض في الأنسجة المحفوظات والتغاير الورم وعدم وجود عينات الأنسجة المجمدة الطازجة يمكن أن يؤثر سلبا على خدمات تشخيص السرطان في مختبرات علم الأمراض في جميع أنحاء العالم. تضخيم الجينات والتعبير التشخيص اختبار باستخدام المواد الأرشيفية أو المواد التي تتطلب النقل لخدمة المختبرات، يحتاج اختبار أكثر قوة ودقة تتكيف مع مهام سير العمل السريرية الحالية. لدينا فريق البحث الأمثل استخدام إينفيتروجين™ كوانتيجيني™ من نوع Plex المقايسة (الحرارية فيشر العلمية) تحديد حجم الجيش الملكي النيبالي في المواد المحفوظة باستخدام تكنولوجيا تشعبت الحمض النووي (بدنا) على لوميناكس xMAP® المغناطيسي الخرز. تحليل التعبير الجيني الموصوفة في هذه المخطوطة هو طريقة سريعة، ومتعدد رواية، التي يمكن أن تصنف بدقة سرطان الثدي في مختلف الأنواع الفرعية الجزيئية، إهمال الموضوعية لتفسير المتأصلة في تقنيات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب المدخلات المنخفضة للمواد المطلوبة، أورام غير متجانسة يمكن ميكروديسيكتيد الليزر باستخدام الهيماتوكسيلين والملون ويوزين (H & E) أقسام. يحتوي هذا الأسلوب على مجموعة واسعة من التطبيقات الممكنة بما في ذلك تصنيف الورم مع إمكانية تشخيص وقياس المؤشرات الحيوية في خزعات السائلة، مما يتيح إدارة أفضل للمرضى ورصد الأمراض. وبالإضافة إلى ذلك، قياس كمي للمؤشرات الحيوية في المواد الأرشيفية مفيدة في أبحاث علم الأورام مع الوصول إلى مكتبات المواد المشروح سريرياً، والتي يمكن التحقق من الدراسات الاستعادية المؤشرات الحيوية المحتملة ونتائجها السريرية الارتباط.
Introduction
الأمثل لفحوصات الحمض النووي الريبي على أساس استخدام الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) المواد الأرشيفية تحديا بسبب تقلب في المعالجة الجراحية الأنسجة وتحلل الحمض النووي الريبي الناجمة عن الفورمالين التي تستخدم للحفاظ على سلامة الأنسجة1، 2. للتغلب على الحد من إجراء دراسات التعبير الجيني دقيقة من المواد الأرشيفية، تستخدم مجموعتنا المقايسة حبة المغناطيسية متعدد بدنا. بدلاً من الانزيمية التضخيم من قالب المستهدفة، يستخدم تكنولوجيا بدنا تهجين تحقيقات محددة والتضخيم من إشارة مراسل3. تسلسلات الاعتراف قصيرة من المسابر الالتقاط والكشف عن مصممة هجن إلى أجزاء قصيرة من هدف الجيش الملكي النيبالي4. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام أنسجة هوموجيناتيس كمواد البدء مباشرة في هذا التحليل، يتغلب على الخسارة الحتمية للجيش الملكي النيبالي أن النتائج من الاختبارات التي تتطلب استخراج الحمض النووي الريبي السابقة وتنقية. تضخيم الإشارات واستخدام تسلسلات الاعتراف قصيرة، واستبعاد خطوة التنقية، تسهم في التقليل في الاختلاف التقني للمقايسة. التكنولوجيا يوفر إمكانية متعدد المقايسة (أهداف الجيش الملكي النيبالي يصل إلى 80)، وقياس التعبير عن فريق أهداف من مواد منخفضة المدخلات. ويصف هذا البروتوكول الإعداد وتلطيخ عينات الأنسجة لليزر ميكروديسيكشن. تلطيخ على الشرائح غشاء تسهيل تصوير الورم وبنية نسيجية لتوفير دقة التحديد وتوصيفها: (1) الورم والقنوات العادية في أنسجة الثدي، و (2) استنساخ الخلايا الخبيثة داخل الأورام غير متجانسة.
التصنيف الجزيئي لسرطان الثدي هو عملية أن يستجوب الواسمات الجزيئية لتصنيف أورام المرضى إلى ثلاث فئات الجزيئية، أي، مستقبلات عامل نمو البشرة لومينال، الإنسان 2 (HER2)-النوع الفرعي للتخصيب، والقاعدية. النوع الفرعي HER2 أثري يعرف جيدا، مع التعبير عالية من مستقبلات HER2، سبب التضخيم الجيني ERBB2، جنبا إلى جنب مع انخفاض أو غياب مستقبلات الإستروجين (ER) ومستقبلات البروجسترون (المدعي). النوع الفرعي لومينال إيجابي عموما ER والنوع الفرعي القاعدية هي النفي العام لثلاث مستقبلات (HER2، ER، مكتب المدعي العام الاتحادي)، وإلى حد كبير التداخل مع5،النوع الفرعي لتشخيص السرطان (تنزانيا) الثدي السلبي الثلاثي6. يتم استخدام علامات أخرى لتحديد الخصائص الظهارية والوسيطة. فيبرونيكتين (FN1) عنصر الرئيسي لمقصورة الوسيطة أنسجة الثدي. ويرافق زيادة FN1 التعبير Ki67 عالية تلطيخ، ويظهر توقيع لورم أكثر الغازية7،8 ويرتبط بورم خبيث9. من المثير للاهتمام، تم العثور على FN1 أن تكون موجودة في ميكروفيسيكليس التي تنشأ من الخلايا السرطانية، أن فعل تنشيط إشارات ميتوجينيك في الخلايا الليفية المستفيدة10. ومن ثم تعميم ميكروفيسيكليس مثل اكسوسوميس هي علامة محتملة للكشف المبكر أو ورم خبيث والانتكاس11.
وقد أجريت متكرر الورم منطقة التحديد لسرطان الثدي النسخي subtyping ماكروديسيكشن12،13. للتغلب على عدم تجانس الأنسجة وزيادة الحساسية، جمعنا بين الكلاسيكية الأنسجة تلطيخ مع متعدد أساليب التنميط الجزيئي موثوق بها. كدليل على المبدأ، حددت اثنين من استنساخ سرطان الثدي متميزة بالتوقيع الوسيطة الظهارية وإمكانات المنتشر. يمكن ترجمتها إلى الإعداد السريرية الحالية سير عمل بروتوكول وصف وتستخدم لعزل بشكل انتقائي وتميز الأنسجة الأنواع الفرعية استخدام التنميط مرناً المستهدفة بسهولة.
Protocol
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لاستخدام مواد أنسجة الثدي في هذه الدراسة من لجنة أخلاقيات البحوث جامعة (كامكو) من جامعة مالطة (Ref: 22/2012).
1-إعداد الأنسجة
- استخدام إجراءات ح & ه المناسب14، إعداد مرجع الملون أقسام الأنسجة ورقميا مسح الشرائح للرجوع إليها أثناء ميكروديسيكشن.
- مبضع، باستخدام قطع 20 ميكرومتر الأنسجة المقاطع على حمام مياه خالية من رناسي عند 40 درجة مئوية. تجميع المقاطع على شرائح غشاء ميكروديسيكشن الليزر باستخدام معدات نظيفة، وتطهير رناسي والمواد.
- جاف الشرائح الغشاء عند 37 درجة مئوية في حاضنة تجفيف بين عشية وضحاها. وصمة عار استخدام المناسبة ح & ه الإجراء15 بحلول الصف البيولوجيا الجزيئية وزيادة فترة الهيماتوكسيلين المصبوغة إلى 6 دقيقة. إذا لزم الأمر، وصمة عار الشرائح الغشاء مع البروتوكولات المناسبة المناعي16.
2-ليزر ميكروديسيكشن
- تعيين حدود الشريحة ومعايرة حركة مرحلة.
- نقل عرض الليزر على منطقة فارغة من شريحة الغشاء. معايرة تركيز الليزر بإطلاق ليزر أطلقوا النار على زيادة تركيز الفواصل (5%) حتى يبدأ الليزر لاختراق عبر الغشاء. رسم وميكروديسيكت أي شكل وصقل تركيز الليزر لتعظيم كفاءة الليزر أثناء تشريح الليزر.
- زيادة سرعة الحركة المرحلة إلى نقطة حيث عدم المساس بكفاءة تشريح الليزر. معايرة الليزر على عدسة الهدف المحدد وإعادة معايرة إذا تغيير الأهداف (سرعة الليزر 1 – 15%)، والتركيز على 70-75%، والسلطة على 90-100% عند استخدام الهدف X 4.
- مسح الغشاء الملون الشرائح باستخدام هدف X 4.
- حدد وتطويق المناطق المستهدفة ميكروديسيكشن على الشريحة الغشاء. تشريح الليزر مساحة لا تقل عن 42 مم2. سجل المجال تشريح لتحديد حجم العينة العازلة المتجانس لاستخدامها.
- استخدام إليه رفع الحد الأقصى لاسترداد قسم تشريح على قبعات الناشر المسمى أنابيب يعلق على أطرافهم المناسبة. إذا لم يتم استرداد القسم تشريح على الغطاء، كرر تشريح الليزر للمنطقة.
3. تحلل النسيج
ملاحظة: يتم توفير العديد من الحلول والمواد جنبا إلى جنب مع مجموعات المواد المذكورة في الجدول للمواد.
- إعداد حجم المخلوط المتجانس المطلوب لتحلل عينة استخدام التماثل الحل والبروتيناز ك بنسبة تفوقها.
- "الماصة؛" ميليلتر 2.4 من المجانسة الحل في كل أنبوب لكل 1 مم2 من منطقة الأنسجة، دوامة ل 10 ق على الحد الأقصى للسرعة، وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ل 5 ق في 2,500 س ز.
- احتضان في كتلة تدفئة عند 65 درجة مئوية ح 12-18 مع الهز 600 لفة في الدقيقة.
- الطرد المركزي في ليساتيس في 21,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام ماصة، نضح المادة طافية واضحة بعناية والاستغناء عن في أنبوب جديد مسمى. تجنب يسفط الشظايا الأنسجة/غشاء كهذا قد يقلل من جودة النتائج.
- تخزين المادة طافية واضحة في ثلاجة-80 درجة مئوية.
4-المستندة إلى التهجين بالانزيم
- القيام بالأعمال التحضيرية التالية.
- قبل الحارة الخليط تحلل بوضع زجاجة الكاشف في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخلط بلطف بانعكاس.
- إذا جمدت هوموجيناتيس الأنسجة، ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة واحتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 دوامة العينات في أقصى سرعة بعد في الحضانة.
- تعيين حاضنة تهتز عند 54 درجة مئوية ومكان مسبار أدوات التحقق من درجة الحرارة في بئر فارغة من لوحة 96-جيدا. بعد ح 2 التحقق من درجة الحرارة في ميزان الحرارة الرقمي وضبط درجة حرارة دلتا الهز حاضنة لتصحيح أي الفرق في درجة الحرارة.
- ذوبان الجليد ودوامه التحقيق تعيين وحجب كاشف لمدة 10 ق، أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ل 5 ق في 2,500 س ز، والحفاظ على الجليد.
- تبقى القنينة "ك بروتيناز" على الجليد أثناء الاستخدام.
- Sonicate الخرز الالتقاط في 46 كيلو هرتز لمدة 3 دقيقة، ثم دوامة في السرعة القصوى لآخر 3 دقائق.
- إعداد عامل ميليلتر 25 حبة مزيج كل بئر برفع مستوى الكواشف التالية تبعاً لذلك: 4.25 ميليلتر المياه خالية من نوكلياسي، ميليلتر 16.65 خليط تحلل، ميليلتر 1.00 لحجب الكاشف، 0.10 ميليلتر كبروتيناز، 0.50 ميليلتر من التقاط الخرز، 2.50 ميليلتر من مجموعة التحقيق.
- دوامة مزيج حبة العامل لمدة 10 ق بأقصى سرعة ممكنة، ثم "الماصة؛" 25 ميليلتر/بئر إلى لوحة الفصل المغناطيسي.
- ماصة 25 ميليلتر الأنسجة هوموجيناتي للوحة 96-جيدا فصل مغناطيسي و 25 ميليلتر المجانسة الحل إلى الآبار 3 الفراغات.
- ختم لوحة الفصل المغناطيسي باستخدام ختم ضغط بلاستيك الشفاف ووضع اللوحة في الحاضنة في 54 ± 1 درجة مئوية ح 18 – 22 بينما تهز 600 لفة في الدقيقة.
- إعداد 1 × الحل المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي للآبار 24 بخلط 31.5 مل خالية رناسي المياه مع 0.1 مل من المياه والصرف الصحي المخزن المؤقت المكون 1 و 1.67 مل أغسل المخزن المؤقت المكون 2.
- قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. تعيين درجة حرارة الحاضنة الهز إلى 50 ± 1 درجة مئوية.
- جبل اللوح الفاصل المغناطيسي في الغسالة اللوحة المغناطيسية المحمولة باليد وقفل في المكان. إزالة الختم الضغط وانتظر 1 دقيقة الخرز المغناطيسي لتسوية.
- خطوة الغسيل: عكس لوحة فصل المغناطيسية التي شنت على اللوحة على الحوض ووصمة عار بلطف على المناديل الورقية إزالة الحل المتبقية. استخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميليلتر من 1 × أغسل المخزن المؤقت الحل في كل بئر والانتظار 15 س. كرر هذه الخطوة لغسل اللوحة 3 مرات.
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من الكاشف ما قبل مكبر للصوت لكل بئر. ختم اللوحة مع ختم لوحة ألومنيوم ويهز اللوحة 800 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضانها ح 1 في 50 ± 1 درجة مئوية بينما تهز 600 لفة في الدقيقة.
- كرر الخطوة 4.9 (خطوة الغسيل).
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من الكاشف مكبر للصوت لكل بئر. ختم اللوحة مع ختم لوحة ألومنيوم ويهز لوحة كما في الخطوة 4، 10.
- كرر الخطوة 4.9 (خطوة الغسيل).
- دوامة التحقيق تسمية 10 s بأقصى سرعة ممكنة. إضافة 50 ميليلتر من التحقيق تسمية لكل بئر. ختم ويهز اللوحة (الخطوة 4، 10).
- كرر الخطوة 4.9 (الغسيل خطوة).
- دوامة phycoerythrin Streptavidin (سابي) ل 10 ق بأقصى سرعة ممكنة. إضافة 50 ميليلتر من سابي لكل بئر. ختم ويهز اللوحة (الخطوة 4، 10).
- كرر الخطوة 4.9 (خطوة الغسيل) ما عدا استخدام المخزن المؤقت يغسل سابي بدلاً من الحل المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- إضافة ميليلتر 130 سابي يغسل المخزن المؤقت لكل لوح جيدا والختم بختم لوحة ألومنيوم. اهتزاز اللوحة 800 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- بدء تشغيل محلل حبة المغناطيسية. تنفيذ إجراء المعايرة والتحقق باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- قم بإعداد بروتوكول لمحلل حبة المغناطيسي باستخدام المعلمات التالية: "حجم العينة": 100 ميليلتر؛ بوابة DD: 5,000-25,000؛ المهلة: 90 ثانية؛ منطقة الحدث/حبة حبة: 100؛ وانقر فوق التالي. حدد الأرقام حبة كل منهما في الفريق وتحديد المناطق حبة مع الجينات الهدف منها كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
- إضافة إجراء تحليل جديد عن طريق تحديد "" إنشاء الدفعية "استخدام بروتوكول القائمة" من علامة التبويب مجموعات . في تخطيط لوحة يسمى الآبار غير معروف أو فارغة، على التوالي، وتقدم تسمية لكل عينة في لوحة عينات .
- إزالة الختم لوحة الألومنيوم من لوحة الرد 96-جيدا. أخرج علبة لوحة عن طريق النقر على زر الإخراج ، وتحميل اللوحة إلى محلل حبة المغناطيسية. انقر فوق التراجع عن| تشغيل المجموعة لبدء المحلل. بعد القراءة، إخراج وإزالة لوحة 96-جيدا. تنظيف وإيقاف تشغيل محلل حبة المغناطيسي حسبما أوصت به الشركة المصنعة.
5-بيانات التحليل
- في المجموعة| حدد ملف تحليل كل تبويب النتائج ، وانقر فوق الزر تصدير to.csv . The.csv فتح الملف باستخدام برامج جداول بيانات.
- نلاحظ التهم حبة وتجاهل أي النتائج مع الخرز < 40/المنطقة.
- متوسط قيم فارغة الآبار والعمل على الحد من الكشف عن (اللد) والانحراف المعياري (SD) (فارغة في المتوسط + (3xSD)) كل الجينات المستهدفة. تعيين القيم أقل من اللد كالتي لم يتم كشفها.
ملاحظة: إذا كان أي من قيم التعبير تطبيع غير مكتشفة، تعتبر بيانات العينة كعدم كفاية. النظر في قيم التعبير أكثر من 20,000 كأكثر من الحد الأعلى من حساسية. وينبغي أن تضعف ليساتيس من هذه العينات وإعادة تحليل. - قم بطرح متوسط فارغة من البيانات الخام للجينات.
- حساب هندسي من الجينات تطبيع المحدد كل عينة. تطبيع البيانات النموذجية الفردية لكل منهما هندسي.
- تحليل البيانات على منصات العلم البيانات أو باستخدام خوارزميات محددة.
- استيراد البيانات إلى منهاج العلوم البيانات بواسطة النقر فوق إضافة البيانات. اسحب ملف البيانات في مساحة عمل العملية والاتصال بعامل [حدد سمات] ، ثم إلى الرئيسية مكون تحليل (PCA) المشغل، ومن ثم إلى ميناء t رسول.
- في حدد السمة حدد عامل تشغيل مجموعة فرعية البيانات الجينات تم تسويتها ومتغير القيمة اسمية مثل النوع الفرعي لسرطان الثدي. تشغيل العملية بواسطة النقر فوق تشغيل. في علامة التبويب مخططات حدد "مبعثر لون ثلاثي الأبعاد" في نمط المخطط والمتغير الأسمى في حقل اللون . تقييم تقلب البيانات محكمة التحكيم الدائمة في مؤامرة ثلاثية الأبعاد.
Representative Results
تم تطبيق الأسلوب وصف لقياس المتزامن للمحاضر 40 في ح & ه الملون (الشكل 1)، ميكروديسيكتيد (الشكل 2) متدهورة جداً المواد فب. باستخدام هذا الأسلوب، نعرض دقة توصيف حالة مستقبلات (الشكل 3 ألف)، تصنيف الأورام إلى أنواع فرعية الجزيئية لومينال والقاعدية17، والتعبير التفاضلية من علامة mesenchymal، FN1، عند مقارنة الورم ومراقبة مطابقة الأنسجة (الشكل 3B)، في المخططات مستقبلات مختلفة إيجابية وسلبية.
رقم 1: التعبير الجيني باستخدام ح & ه الملون المواد- الارتباط بين ملف تعريف تعبير مستمدة من قسم ورم أونستينيد بالمقارنة مع مقطع ورم الملون. [ارتباط بيرسون فالقيمه = 5.34E-26]. تتكرر مع إذن17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ميكروديسيكتيون الليزر من الأنسجة FFPE. (أ) ح & ه الملون الشرائح؛ (ب) المناعي تلطيخ للتعبير ER؛ (ج) HER2 تلطيخ المناعي؛ (د) قسم 20 ميكرومتر أونستاينيد على شرائح غشاء ميكروديسيكتيون ليزر. السهم الأصفر يشير إلى منطقة الورم الغازية التي هو عدم وضوح ترسيم الواجب إلى الافتقار إلى تلطيخ. الباب 20 ميكرومتر (ه) ملطخة H & E لتحديد أفضل للمجالات ذات الاهتمام. الأسهم البيضاء تشير إلى درب تشريح الليزر بينما يظهر السهم الأحمر تركيز الليزر أثناء التشريح. تم القبض على جميع الرسوم التوضيحية في 10 x التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التعبير عن حالة مستقبلات (A) والعلامة (ب) mesenchymal FN1، في ورم الثدي مقارنة بمطابقة العادي. يتم تعريف الأنواع الفرعية سرطان الثدي التشخيصية الكلاسيكية وفقا لنتيجة التشخيص باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري والأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) لتلطيخ HER2 المناعي ملتبسة. يتضح التعبير تطبيع HER2 (A) ولائحة، FN1 (ب) تقاس بمقايسة على أساس التهجين HER2 الإيجابية، ER إيجابية، وتنزانيا حالات المريض بالمقارنة مع مطابقة لانسجة الثدي العادي. "إحصائيات اختبار كروسكال واليس" (K W χ2) يبين أن التعبير عن HER2 إلى حد كبير (ف < 0.05) في أنسجة الورم بدلاً من أنسجة طبيعية المتطابقة في الفوج إيجابية HER2 أعلى وأقل بكثير في الفوج تنزانيا. لم يتم العثور على تعبير ER لتكون أعلى بكثير في أنسجة الورم بدلاً من العادي المتطابقة في إيجابية ER والأفواج تنزانيا. FN1 هو أعلى بكثير في أنسجة الورم في الأنواع الفرعية إيجابية HER2 و ER ويظهر اتجاها نحو يجري مرتفعة إلى حد كبير في الأنسجة السرطانية في الفوج تنزانيا أيضا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: دراسة حالة إفرادية: التغاير الورم. أورام شكلياً متميزة ميكروديسيكتيد وتعامل كعينات متميزة. (أ) الماجستير مسح المقطع ح & ه. (ب، ج) 10 x و 40 x التكبير، على التوالي لكل مورفولوجيا الورم حددت. (د) المناعي تلطيخ للائحة في 10 x التكبير. (ﻫ) المناعي تلطيخ ل Ki67 في 10 x التكبير تظهر نشاطا الانقسامية أعلى في ورم 1. (و) تطبيع مستويات التعبير للجينات ESR1 في كل ورم يظهر التعبير عالية نسبيا وعلى قدم المساواة بين الأورام كما هو متوقع من نتيجة المناعي. (ز) تطبيع مستويات التعبير FN1، علامة الوسيطة، حيث يرافق زيادة FN1 التعبير Ki67 عالية تلطيخ عرض توقيع لورم أكثر الغازية. ويلاحظ معكوس في ورم 2، الذي يبدو أنه ورم المتكاثرة أبطأ مع احتمال خبيثة أقل ممثلة بانخفاض FN1 التعبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
كان الأمثل مقايسة على أساس حبة بدنا متعدد لقياس التعبير الجيني في الجيش الملكي النيبالي المتدهورة المستمدة من أنسجة سرطان الثدي فب وقنوات الثدي العادي. الأمثل المقايسة، ينطوي عليها تطوير خوارزمية لتصنيف أورام سرطان الثدي في المخططات لومينال والقاعدية استخدام المؤشرات الحيوية المعروفة 8 و 5 المحتملة تطبيع الجينات. تم تطبيع البيانات باستخدام التباديل الجينات تطبيع. اختيار الجينات تطبيع استند التنبؤ بأفضل حالة مستقبلات استخدام الجينات المصنف لومينال/القاعدية. لتصنيف الأنواع الفرعية لومينال/القاعدية من الأنسجة FFPE، تم تحديد الجينات تطبيع بيتا-أكتين (أكتب) ونازعه 3-فوسفات جليسيرالديهيدي (جابده) هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيريز 1 (HPRT1).
الطريقة التي يمكن تكييفها للاستخدام في التشخيص الأخرى ومجالات البحث بعد الاختيار الملائم لمجموعة الجينات تطبيع. هو أحد التطبيقات الهامة لهذا الأسلوب في قطاع البحوث بقياس المؤشرات الحيوية في المواد الأرشيفية التي هي مشروحة جيدا مع النتائج السريرية. هذا يمكن التحقق من صحة علامات تنبؤية المحتملة في الدراسات الاستعادية، بسرعة ودقة، وتجنب دراسات مستقبلية طويلة الأجل في انتظار البقاء خالية من الأمراض، وبقاء البيانات الشاملة. حاليا لدينا فريق التحقيق استخدام الفحص للكشف عن اكسوسوميس مستقبلات إيجابية، الأمر الذي يتطلب تطوير جديد باستخدام خوارزمية بديل تطبيع الجينات لتطبيع البيانات. استخدام الخزعات السائلة وفحوصات التعبير الجيني قوية سيسمح فحوصات عالية الإنتاجية متعدد تكييفها لإدارة المريض أثناء العلاج، وتوفر وسيلة لتتبع نجاعة العلاج، احتمال الانتكاس بسبب مقاومة للعلاج، قدرة الورم المنتشر.
هذا الأسلوب أيضا مجموعة واسعة من التطبيقات الممكنة في تشخيص الأورام وهو يتكيف مع سير العمل الحالي التشخيص. وتشمل المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب في مجال التشخيص: (1) تنفيذ فحوصات عالية الإنتاجية، (2) باستثناء الذاتية ونتائج ملتبسة منشؤها القياسات المستندة إلى الصور، (3) كشف دقيق لأهداف متعددة في نفس الوقت، الذي يعزز دقة والتقليل من استخدام عينات المرضى الثمينة، و (4) لا يشترط لمرافق متخصصة للغاية والموارد البشرية. عملية أخذ العينات الأمثل، جنبا إلى جنب مع مدخلات منخفضة من المواد اللازمة للتحليل متعدد المستندة إلى حبة، يسمح مواصلة التحقيق في عدم تجانس الورم؛ باستخدام ميكروديسيكشن الليزر لفصل دقة بؤر متعددة من الأنسجة الخبيثة من الجزء المريض نفسه، من الممكن مقارنة متعددة الجينات فيما بينها وكذلك مع أنسجة طبيعية المتطابقة (الشكل 4). انخفاض المدخلات المادية أمرا حيويا لتطبيق التشخيص في ورم الخزعات التي توفر الأنسجة السرطانية محدودة. قدرة التحليل لقياس التعبير الجيني من عينات الحمض النووي الريبي المتدهورة يتيح سهولة نقل العينات للتحليل داخل مؤسسة أو إلى خدمات المختبرات. وباﻹضافة إلى ذلك، تحليل المقطع كله كان أيضا إمكانية استخدام ح & ه الملون المادية (الشكل 1).
لنجاح هذا البروتوكول، فمن الضروري: (1) ضمان مناسب لأخذ العينات من الموقع الورم/s التي هي تفكيك للمقايسة و (2) وضع الأمثل، والتحقق من صحة خوارزميات تطبيع البيانات، لكل فريق التعبير الجيني و/أو التنبؤات الفردية أو المؤشرات الحيوية التنبؤية. السابقة يعتمد على الخبرة التقنية للفني/الباحث إجراء أخذ العينات. من المستحسن اتخاذ أساسية إضافية وإعداد ميكرواري أنسجة (تي أم أية) بنفس الشكل للمقايسة حبة المغناطيسية متعدد (96-كذلك تنسيق). وهذا سيوفر أرشيف لمواقع الورم كنسخة طبق الأصل عينات المستخدمة للتحليل القائم على الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا تقييم طرفية مع تقنيات أخرى لمتابعة البحث أو للتحقق من النتائج. تطوير خوارزميات التطبيع تعتمد على المواد التي يجري التحقيق فيها وتطبيع الجينات المحددة للتطبيع. لوحات مختلفة لتطبيع الجينات المحددة على أساس مستوى وتنوع التعبير في العينة التي تم تحليلها، وهذا يختلف بين أنسجة السرطان من أصول مختلفة، واكسوسوميس من البلازما، أو تعميم الخلايا السرطانية. التحقق من الصحة للفحص يشمل تجهيز العينة نظراً للاستعدادات المختلفة سوف يؤدي أيضا إلى خوارزميات مختلفة التطبيع.
وباختصار، استخدام التكنولوجيا بدنا في تركيبة مع حبة المغناطيسي التكنولوجيا واختيار الفريق المناسب للجينات المستهدفة، وسيوفر ميزة إضافية لقياس التعبير الجيني مباشرة في أنسجة ليساتيس المستمدة من كميات صغيرة من المريض المادية، بما في ذلك ميكروديسيكتيد اكسوسوميس والمادية، وتعميم الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى الكشف عن تغاير الورم، إمكانات الاستخدام السليم للوحات للكشف عن اكسوسوميس الورم المشتقة للتشخيص المبكر والكشف المبكر عن حالات الانتكاس. إذ ليس هناك حاجة لخطوة تضخيم حمض النووي، تضخيم الإشارات باستخدام التكنولوجيا بدنا، جنبا إلى جنب مع متعدد المستندة إلى حبة، تدابير متعددة من التعبير الجيني في المواد الأرشيفية المشروح سريرياً وتوفير مورد التحقق من صحة العلامات البيولوجية.
Disclosures
إينفيتروجين™ قوانتيجيني™ من نوع Plex والرزن المالك الحرارية فيشر العلمية.
Acknowledgments
وأيده في العمل (1) "الثدي السرطان المشروع منحة دراسية" (2014-2016) الممولة من العمل لمؤسسة سرطان الثدي و 2013 على قيد الحياة من خلال البحوث والابتكار وتنمية الثقة (ريدت) من جامعة مالطة، (2) "كلية الطب" & الجراحة، جامعة مالطة والمشروع (3) قانون بتمويل من "المجلس الوطني المالطي" للعلوم والتكنولوجيا من خلال الانصهار: R وتكنولوجيا تطوير برنامج عام 2016. نشر هذه المخطوطة معتمد من خلال المنحة لوميناكس جوف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
| Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
| Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
| Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
| ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
| HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
| Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
| Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
| Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
| mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
| mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
| Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
| mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
| 1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
| 96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
| Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
| LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
| Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
| Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
| Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
| Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
| Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
| Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
| Sonicator | Silvercrest | ||
| RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
| Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
| Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
| RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
| Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |
References
- Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
- Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
- Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
- Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
- Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
- Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
- Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
- Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
- Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984 (2015).
- Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
- Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
- Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
- Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
- Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
- Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
- Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).
