Summary
Qui, presentiamo un protocollo per analizzare la cellula--cellula trasferimento di informazioni oscillatori di optogenetica controllo e monitoraggio dell'espressione genica live. Questo approccio fornisce una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.
Abstract
Cellule devono rispondere correttamente a cambiare temporaneamente gli ambienti, che sono influenzati da vari fattori da cellule circostanti. Il via di segnalazione di Notch è uno di tali macchinari molecolari essenziali per le comunicazioni cellula--cellula, che svolge ruoli chiave nello sviluppo normale degli embrioni. Questa via comporta un trasferimento di cellula--cellula di informazioni oscillatorie con Oscillazioni ultradiane, ma nonostante i progressi nelle tecniche di biologia molecolare, è stato impegnativo per delucidare l'impatto delle interazioni multicellulari sul gene oscillatoria dinamica. Qui, presentiamo un protocollo che consente la gestione di optogenetica e monitoraggio in tempo reale di espressione genica in modo temporale preciso. Questo metodo con successo ha rivelato che intracellulari e intercellulari ingressi periodici della tacca di segnalazione entrain oscillazioni intrinseche di frequenza di sintonizzazione e fase spostando la risoluzione di singole cellule. Questo metodo è applicabile per l'analisi delle caratteristiche dinamiche delle varie vie di segnalazione, fornendo una piattaforma unica per testare un significato funzionale dei programmi di espressione genica dinamici nei sistemi pluricellulari.
Introduction
Comunicazione della cellula--cellula giocano un ruolo critico nel patterning embrionale in processi di sviluppo. In embrioni vertebrati, le strutture metamerica chiamate somiti si formano lungo l'asse antero-posteriore corpo con una precisione temporale precisa sotto il controllo di un orologio di tempo di mantenimento, chiamato la segmentazione dell'orologio1. Durante questo processo, un gruppo di cellule del mesoderma presomitic (PSM) periodicamente vengono convertiti in somiti in modo sincrono. Questo processo coinvolge l'espressione genica di oscillatori sincronizzati e cellule PSM che oscillano in fase formano dei metameri stessi. Il periodo dell'espressione genica oscillatorio è circa 2-3 h in topi e a circa 30 min in zebrafish. Quando dissociate, PSM cellule perdono la sincronia2,3, ma quando sono ri-aggregati, possono auto-organizzarsi e recuperare la popolazione sincronia4, suggerendo che l'accoppiamento cellula-cellula è una chiave per il sincronizzato oscillazioni.
Gli sforzi profusi hanno rivelato che le molecole di segnalazione nella via del Delta-Notch strettamente collegate alle oscillazioni sincronizzate dei geni orologio segmentazione. O inibitori farmacologici o mutazioni genetiche della tacca di segnalazione desincronizzarsi la popolazione degli oscillatori. In zebrafish, mutanti della tacca di segnalazione componenti, quali DeltaC, DeltaD e Notch1a, visualizzano asincrona oscillazioni5,6. Negli embrioni di pulcino o il mouse, non solo il ligando Notch Delta-like1 (Dll1), ma anche il tacca modulatore Lunatic fringe (Lfng) è richiesto per oscillazioni sincronizzata7,8,9. Tuttavia, è stato difficile testare la funzionalità di tali molecole per il trasferimento di informazioni dinamiche da cella a cella, perché risoluzioni temporali di perturbazione convenzionale della dinamica di regolazione genica non erano sufficienti per indagare il processi di tempistiche di 2 – 3 h (ultradiane).
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo integrato per controllare e monitorare pattern di espressione genica in cellule di mammifero10. Questa tecnologia consente ad induzione di impulsi di espressione genica di illuminazione a luce periodici su scale di tempo ultradiane. Questo protocollo rappresenta i metodi per stabilire linee di cellule fotosensibili e osservare le risposte dinamiche delle cellule reporter di luminescenza di cellule vive di monitoraggio nei contesti delle comunicazioni cellula--cellula. Questo metodo è applicabile per l'analisi di molte altre vie di segnalazione.
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Protocol
1. generazione di linee cellulari stabili dal sistema Tol2
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Transfect vettori plasmidici (Figura 1A) di moduli basati su Tol2 optogenetica insieme con il vettore di espressione transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in cellule C2C12. In tutte le fasi, le cellule di cultura con medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina-streptomicina a 37 ° C (tabella 1), in presenza di 5% CO2, altrimenti indicato.
- Contare tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 5x104 C2C12 cellule per pozzetto in un piatto di 12-pozzetti un giorno prima di transfezione.
- Co-transfect 0,375 μg di vettori basati su Tol2 optogenetica (pAI177 o pAI218), 0,125 μg di un vettore di selezione della droga (pAI170) e 0,5 μg di pCAGGS-mT2TP vettoriale utilizzando lipofezione reagente.
- Tripsinizzano cellule trasfettate e impiattatelo in piastre di coltura di 100 mm, un giorno dopo la trasfezione.
- Cambio di coltura per cellule trasfettate per cultura supplementato con igromicina 100 mg/mL.
- Cellule di coltura per 3 giorni eliminare le cellule non trasfettate. Si noti che il cambiamento medio non è necessaria.
- Tripsinizzano cellule trasfettate e purificare una popolazione di cellule che esprimono le proteine fluorescenti per la selezione. Per le cellule ricevitore pAI177, impostata il cancello ordinamento canale verde-PE per la purificazione della popolazione delle cellule mCherry-positivi. Per le cellule fotosensibili mittente pAI218, impostata il cancello ordinamento canale APC per la purificazione della popolazione delle cellule iRFP713-positivi.
- (opzionale) Stabilire una popolazione clonale delle cellule con i metodi standard, ad esempio diluizione limitato o singolo-cella ordinamento di FACS.
2. valutazione della sensibilità della foto di cellule ingegnerizzate a livello della popolazione
Nota: Questa parte descrive un protocollo per controllare la dinamica induzione delle proteine di ligando Dll1 su illuminazione luce blu di saggi biochimici, quali qPCR e Western blotting.
- Impostare due tipi di incubatori con o senza fonti di luce per una condizione indotta dalla luce o una condizione di buio, rispettivamente. Set-up luce-intensità di un blu-trans-illuminatore LED, come illustrato nella Figura 1B, utilizzando un misuratore di luce. Gli orari del programma e la durata dell'illuminazione dal caricamento di uno script di controllo a un micro-controller monoscheda che consente orari programmabili per l'illuminazione (Figura 1).
- Conta cellule tripsinizzate con un contatore di cellule e piastra 1.0 x 105 mittente fotosensibile cellule portando pAI218 e pAI170 su piastre di coltura in plastica di diametro 35 mm (più di 12 piatti per condizione di luce e 1 piatto per condizione di buio) e impostare i piatti separare gli incubatori per condizioni di buio/luce. Dopo aver impostato piatti, tenere porte di incubatrici chiuse fino al collezionismo lisati cellulari.
- Giorni di un anno e mezzo dopo il placcaggio, avviare illuminazione luce (cellule dovrebbero essere più di 80% confluenti). Non esporre le cellule alla luce per evitare indesiderata foto-stimolazione.
Nota: Gli orari per l'illuminazione dipende dallo scopo di esperimenti. Si noti che una condizione di illuminazione costante (ad es. 1-min intervalli di durata e 10 min con 40 µmol/m2/s-intensità luce) è sufficiente per un semplice controllo della foto-induzione e quel forte illuminazione luce è dannoso per le cellule. Così, di assicurarsi che siano selezionati i parametri innocui per l'illuminazione. - Circa 2 giorni dopo il placcaggio, preparare delle cellule-lisato con intervalli di 30 min. Spostare assaggiare piatti dalle incubatrici sul ghiaccio e iniziare a preparare i lisati cellulari per ulteriori analisi.
3. dinamica mittente-destinatario test a livello di popolazione: monitoraggio in tempo reale delle risposte cellulari dopo stimolazione ottica di PMT
- Tripsinizzano e contare i numeri del mittente e le cellule del ricevitore con metodi standard. Preparare un volume totale di 1 mL di sospensione di 2,5 x 1,25 x 10 e 104 ricevitore di miscelazione cellule mittente5 (rapporto 1:5).
Nota: 2:1, 1:1, o rapporti di 1:2 mittente-destinatario anche lavorano con un numero totale di cellule di 1.5 x 105. 10 - Piatto miscelati di cellule in tutti i pozzetti di piastre nere 24 pozzetti con mezzo di coltura contenente luciferina di 1 mM.
- Analizzare le cellule il lettore di piastre per l'analisi di luciferase e confermare che i segnali in uscita non sono troppo elevati per il sistema di registrazione.
Nota: Se segnali di uscita sono superiori a 1 x 106 fotone conteggi/s, essi possono essere saturo. In tal caso, ridurre la concentrazione di luciferina a valori ottimali in modo che segnali di uscita sono inferiori a 1 x 106 fotone conteggi/s. - Mettere la piastra sul sistema di registrazione e avviare un programma di registrazione (Figura 1). Ad esempio, avviare illuminazione luce a 18 h dopo aver impostato la registrazione.
Nota: Filtro temporale, quali i segnali di detrending con lo spostamento in media e Savitzky-Golay filtraggio, sono utile per la visualizzazione delle forme d'onda e rilevamenti di picco.
4. dinamica mittente-destinatario l'analisi a livello di singola cellula: in tempo reale di Imaging delle risposte di singola cellula sotto il controllo di optogenetica perturbazione
- Ricevitore5 piastra di 0,5 x 10 e 2,5 x 10 celle di mittente di5 piatti di diametro 35 mm 27-mm-diametro-vetro-base. Garantire che rapporti di miscelazione e un numero totale di cellule (una densità cellulare) siano regolati correttamente.
- Un giorno dopo il placcaggio, cambio mezzo con 2 mL di supporto di registrazione (rosso fenolo libero DMEM supplementato con 5% FBS, penicillina-streptomicina e luciferina di 1 mM) e impostare il piatto di vetro-base sul microscopio. Se necessario, lavare i detriti di cellule morte con PBS (-).
Nota: È preferibile fare questo passaggio in una condizione di buio. - Impostare un microscopio invertito, dotato di una camera climatica a 37 ° C e 5% CO2.
- Impostare una fotocamera CCD raffreddata. Accertarsi che la temperatura del sensore CCD è raffreddata al valore di destinazione (in genere,-90 ° C).
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Impostare i parametri per "Multi-dimensional Timelapse" finestra nel software di acquisizione automatica di catturare immagini con intervalli di 5 min e più di 288 volte (più di una registrazione durante la notte).
- Aprire "Multi-dimensional Timelapse" finestra, selezionare un canale di luminescenza e una modalità di lettura lenta 50 kHz dal menu pull-down e impostare 4x4 binning con esposizione di 4 min. Accertarsi che la modalità di lettura è impostata la modalità lenta 50 kHz, che è fondamentale per ridurre i rumori di lettura per rilevare debolmente che emettono luce bioluminescente.
- Aprire "Multi-dimensional Timelapse" finestra, selezionare canali di fluorescenza e una modalità di lettura di 1 MHz veloce dal menu pull-down e impostare 2 x 2 binning con esposizione di 400 ms. Assicurarsi che la modalità di lettura è impostata la modalità veloce di 1 MHz per ridurre il tempo necessario per l'imaging di fluorescenza.
- Start Time-lapse di registrazione cliccando su "Acquire".
- Estrarre tracce unicellulare di canali di luminescenza da filmati time-lapse di software di analisi di immagine, come segue. Prima di tutto la luminescenza e fluorescenza immagini dello stack importando i dati di immagine al software di analisi di immagine. Per le immagini di luminescenza, rimuovere pixel caldi derivata da raggi cosmici confrontando le intensità dei pixel nelle immagini temporaneamente adiacente, sostituendo i valori di pixel per la media temporale dei fotogrammi precedenti e successivi (implementato come filtro"SpikeNoise"), applicare queste immagini elaborate a un filtro spazialmente e sottrarre i valori dei pixel di sfondo di giocatori visite da ogni fotogramma. Quindi, stabilire una "regione di interesse" (ROI) per ogni cella su un'immagine fluorescente in ogni momento, applicare il ROI immagini luminescenti e misurare l'intensità luminescente di ogni ROI.
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Representative Results
Abbiamo adattato il LightOn sistema11,12, che consente l'espressione genica di foto-indotta in cellule di mammifero, allo studio della genetiche oscillatori con periodicità di 2 - 3 h. Questo sistema è composto da due parti: il hGAVPO foto-inducible attivatore trascrizionale e una cassetta di UAS-promotore alla trascrizione di unità di arbitrari geni di interesse. Per accelerare la cinetica pulsatile di espressione genica indotta da foto, la sequenza di polyA nel cassetto UAS-promotore è stata sostituita da murino Hes1 3' UTR, che accorcia il tempo di dimezzamento di mRNA a 20 min in fibroblasti murini.
Per stabilire linee cellulari stabili, tri-cistronici vettori basati sul sistema Tol2 transposase è stato usato13 (Figura 1A). Il vettore di espressione Tol2 è essenziale per migliorare l'efficienza di integrazione del plasmide cassette14. Tali vettori portano non solo le cassette di espressione di geni inducibili luce guidati dal UAS-promotore, ma anche le cassette di espressione delle proteine hGAVPO e fluorescenti di proteine fotosensibili (iRFP71315 o mCherry). Questo design permette di purificare una popolazione di cellule che efficacemente integrati i plasmidi con i genomi di host.
Abbiamo stabilito le cellule fotosensibili mittente che producono proteine ligando Dll1 su illuminazione a luce blu (Figura 2A). A tal fine, è stato utilizzato un Tol2 basato su sistema bi-cistronici vettore (pAI218). Per verificare la induzione del ligando Dll1 su illuminazione luce, le cellule sono state coltivate in incubatrice con sorgenti di luce blu LED programmate mostrate in Figura 1B e 1C. Risultati rappresentativi della foto-indotta rilevato dall'analisi macchiante occidentale dinamica per l'espressione della proteina Dll1 sono mostrati in Figura 2B e 2C.
Per stabilire le cellule che rispondono alla tacca di segnalazione ingressi, abbiamo usato un Tol2 basato su sistema bi-cistronici vettore (pAI177) che trasportano il reporter di luciferase destabilizzato sotto il controllo del promotore del gene Notch effettori Hes1 ed il deficit di fosfoglicerato chinasi (PGK) promotore-driven localizzato i nuclei rosso fluorescente reporter H2B-mCherry. In questo caso, il reporter fluorescente è utile per la purificazione e a cella singola nella microscopia time-lapse di rilevamento.
Una volta cellule foto-inducible mittente e ricevitore vengono stabilite, è pronto ad eseguire analisi dinamica mittente-destinatario di co-coltura queste cellule (Figura 2A). In questa analisi, le cellule fotosensibili mittente che esprimono la proteina di ligando Notch Dll1 su illuminazione luce blu erano co-coltivate con le cellule del ricevitore foto-insensibile che trasportano l'oscillatore endogeno di Hes1 ed un Hes1 reporter (bioluminescenza pHes1-dLuc) (Figura 2D). Le cellule del ricevitore in modo endogeno esprimono il recettore di Notch, che è sensible a reagire al Dll1 presentato da cellule vicine.
Risultati rappresentativi delle analisi dinamica mittente-destinatario sono mostrati in Figura 2E e 2F. Per rilevare le risposte dinamiche delle cellule ricevitore con registrazione di bioluminescenza, abbiamo usato prima di un sistema di monitoraggio di cellule vive dotato di un tubo di foto ad alta sensibilità-fotomoltiplicatore (PMT) per photon-counting e una sorgente di luce blu LED per stimolazione luminosa ( Figura 1). Questo sistema permette la registrazione in tempo reale di bioluminescenza segnali a livello di popolazione con illuminazione a luce pianificata. Quando questi due tipi di cellule sono stati co-colture ed esposto a illuminazione luce ripetitiva (30 s durata, intervalli di 2,5 h), cicliche risposte delle cellule ricevitore erano rilevabili in varie condizioni di miscelazione rapporti (Figura 2E). In questo esempio, abbiamo applicato Savitzky-Golay filtraggio (4th ordine e una finestra di dati-punto 13) per attenuare segnali disturbati. La microscopia time-lapse con illuminazione luce ripetitiva (durata 2 min, intervalli di h 2,75) ha rivelato anche le risposte sincronizzate delle cellule ricevitore a livello di singola cellula (linee grigio in Figura 2F) e a livello di popolazione (linea rossa in figura 2F). questi dati suggeriscono che espressione ciclica di Dll1 proteina in cellule di mittente è sufficiente per sincronizzare Hes1 oscillazioni nel ricevitore cellule vicine.
Figura 1: strategia per analizzare le risposte cellulari su perturbazioni optogenetica. (A) schema di vettori plasmidici rappresentativo utilizzato per questo protocollo. Questi plasmidi sono disponibili su richiesta. (B) una foto di un incubatore di2 CO dotato di dispositivo LED blu sotto una piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti. (C) rappresentazione schematica di un circuito elettrico di controllo potenza fornitura per la sorgente luminosa LED da un micro-computer programmabile. Un relè a stato solido (SSR) è stato impostato per l'inoltro degli Stati del digitale PIN-out del micro-computer per stati di sorgente luminosa del LED di accensione e spegnimento di accensione e spegnimento. (D) una foto e disegno schematico di un vivere-cella bioluminescenza sistema di monitoraggio. Si noti che il tavolino motorizzato può spostare unidirezionalmente da una posizione di registrazione sulla parte superiore del rivelatore PMT una posizione di illuminazione sulla parte superiore la sorgente luminosa LED. Si noti inoltre che il rilevatore PMT può spostare da bene a ben monitorare i segnali provenienti da diversi pozzi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esempi di esperimenti di perturbazione optogenetica. In questi esempi, linee di mioblasti murine C2C12 sono state usate. (A) schema di dosaggio dinamico mittente-destinatario. (B, C) Risultati rappresentativi di indotta dalla luce Dll1 espressione analizzati dall'analisi macchiante occidentale. Dll1 proteine sono stati indotti da periodici illuminazione luce con un periodo di 2,5 h, 2 min durata e l'intensità di 24,7 W/m2. Immagine di fluorescenza (D) del sistema di co-coltura delle cellule di mittente e destinatario. (E, F) Risultati rappresentativi del test dinamico mittente-destinatario. (E) schemi temporali delle risposte ricevitore registrate dal sistema di monitoraggio di cellule vive con la PMT. Il numero totale delle cellule è stato fissato a 1,5 x 105 celle, ma i rapporti tra i mittenti e i destinatari sono stati distribuiti da 5:1 a 1:2. (F) cella singola formazione immagine ha rivelato che informazioni oscillatorie, che è stata indotta tramite periodica illuminazione luce (durata 2 min, intervalli di 2,75 h), è stato trasferito dal mittente alle cellule del ricevitore. 1.5 x 105 celle con il rapporto mittente--ricevente di 5:1 sono stati usati. Adattato da Ref. 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo mostrato un metodo per controllare le dinamiche di espressione genica con una periodicità di h 2 o 3. Questa scala temporale è molto più breve rispetto a quelle di altri sistemi convenzionali, tra cui il sistema Tet-On e il sistema LightOn originale. Parametri chiave per raggiungere le scale temporali ultradiane sono emivite di prodotti molecolari indotti da foto, mRNA e proteine. Questi parametri cinetici possono dipendere di specie e tipi di cellule. Per la sintonizzazione la cinetica, sostituendo sequenze Hes1 3' UTR con gli altri è un modo semplice, perché non altera le sequenze e le funzioni delle proteine bersaglio. Per cercare altri 3' UTR di ottenere auspicabile pulsatile modelli in particolare celle di interesse, monitoraggio di cellule vive di dLuc di induzione di luce è un buon punto di partenza e utilizzato per lo screening e la convalida.
Una delle domande più frequenti riguarda la gestione quotidiana delle cellule sensibili alla luce. Nel caso il test dinamico mittente-destinatario della tacca di segnalazione, siamo stati in grado di fare ogni giorno passaggi cella sotto luci della camera, perché i nostri sistemi (foto-inducibile dLuc o Dll1 cellule e cellule ricevitore) non alterare la proliferazione delle cellule e di tornare rapidamente a riposo Stati entro 6 ore dopo che le cellule vengono spostate in una condizione di buio. Se i geni di interesse sono fattori di destino-determinazione, espressione che perde può indurre la differenziazione cellulare o impedire espansioni delle cellule, e pertanto è essenziale per impostare un ambiente di luce rossa per evitare indesiderati optogenetica perturbazione durante manipolazione delle cellule.
In questo protocollo, abbiamo presentato le procedure per generare linee cellulari stabili con cassette di foto-inducible gene expression. Questo è un passo fondamentale per ottenere risultati affidabili nell'analisi della dinamica mittente-destinatario. Si può considerare trasfezione transiente per l'introduzione di moduli optogenetica nelle cellule, ma non funziona bene nelle nostre mani per le misure quantitative di ultradiane impulsi. Abbiamo trovato quel trasfezione transiente di plasmidi che trasportano UAS-promotore cassette porta alla espressione che perde a livelli relativamente elevati anche in condizioni di buio. Questa espressione che perde causa un'elevato background senza alcuna stimolazione luminosa e ostacola una misura affidabile del tempo-corso. Un metodo alternativo per stabilire cellule stabili è un sistema di lentivirus, che è utile per i tipi di cellule che non sono adatti per la transfezione12. Linee clonali delle cellule presenti risposte più omogenee rispetto a linee cellulari eterogenei, ma anche in una popolazione clonale, le risposte delle cellule non sono sempre uniformi: alcune cellule non rispondono alla luce stimolazione e pertanto presentano un distribuite i livelli di luce-indotta espressione della proteina. Questo potrebbe essere dovuto i livelli di espressione variabile di hGAVPO della proteina e/o variabile endogena abbondanza di flavin, un cromoforo necessario per il rilevamento della luce di hGAVPO.
Il protocollo qui presentato fornisce un potente strumento per l'analisi delle dinamiche di espressione genica, ma ci sono alcune limitazioni. Uno svantaggio è che alcuni canali di fluorescenza per microscopia di cellule vive non sono compatibili con la stimolazione di luce blu. Luce blu illuminazione attiva non solo le proteine blu-luce-sensibile, ma anche proteine fluorescenti, tra cui verde e gialle fluorescente proteine (GFPs e YFPs), che sono suscettibili di foto-candeggio. Al contrario, visualizzazione di GFP richiede eccitazione di luce blu che può scatenare indesiderabile attivazione delle cellule fotosensibili durante la cattura immagini fluorescenti. Bright-campo (a contrasto di fase) imaging dalla sorgente di luce ambiente è anche incompatibile con luce blu optogenetica esperimenti, ma si può ovviare a questo problema utilizzando sorgenti di luce di lunghezza d'onda verde o più lungo per l'imaging.
L'analisi dinamica mittente-destinatario sarebbe utile per investigare altre vie di segnalazione. Una possibilità è un'applicazione per secernere sistemi di segnalazione. Per tale analisi, l'applicazione di ligandi purificate in dispositivi microfluidica è un modo alternativo per stimolare le cellule del ricevitore in un preciso modo temporale16,17. Tuttavia, questi approcci sono inaccessibili ai processi di produzione dinamica di molecole leganti in cellule di mittente. Impiegando il test dinamico mittente-destinatario insieme espressione del ligand foto-inducible consentirebbe ulteriore dissezione della trasmissione del segnale dal mittente di cellule ricevitore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da JST, PRESTO (A.I.), Core ricerca evolutiva di scienza e tecnologia (JPMJCR12W2 (R.K.)), sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone 26119708 (A.I.) e 16 H 06480 (R.K.)), scientifico (A) (Giappone società per la promozione della scienza (JSPS) 24240049 (R.K.)), di ricerca e giovani ricercatori (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) e una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi "fluorescenza Live imaging"del MEXT, Giappone e piattaforma per approcci dinamici a Living System da MEXT, Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
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