Summary
Aquí, presentamos un protocolo para analizar la transferencia de célula a célula de información oscilatoria por control optogenetic y control de la expresión génica en vivo. Este enfoque proporciona una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.
Abstract
Células deben responder correctamente al cambio temporal de entornos, que están influidos por varios factores desde que rodea las células. La muesca que se vía de señalización es una de dichas máquinas moleculares esenciales para la comunicación de célula a célula, que juega un papel clave en el desarrollo normal de embriones. Esta vía consiste en una transferencia de célula a célula de información oscilatoria con Ritmos ultradianos, pero a pesar de los avances en técnicas de biología molecular, ha estado desafiando a dilucidar los efectos de interacciones multicelulares gen oscilatoria dinámica. Aquí, presentamos un protocolo que permite optogenetic control y seguimiento directo de los patrones de expresión génica de manera temporal precisa. Este método con éxito reveló que entradas periódicas intracelulares e intercelulares de la señalización de Notch arrastrar las oscilaciones intrínsecas por sintonización de frecuencias y fase de cambio en la resolución de unicelulares. Este enfoque es aplicable para el análisis de las características dinámicas de varias vías de señalización, ofreciendo una plataforma única para probar una significación funcional de los programas de dinámica gene expresión en sistemas multicelulares.
Introduction
Comunicación de célula a célula juega papeles críticos en modelar embrionario en procesos de desarrollo. En embriones de vertebrados, las estructuras metaméricos, llamadas somitas se forman a lo largo del eje corporal antero-posterior con una precisa exactitud temporal bajo el control de un reloj de tiempo, llamado el reloj de segmentación1. Durante este proceso, un grupo de células del mesoderm presomitic (PSM) se convierten periódicamente en somitas en forma sincrónica. Este proceso implica la expresión génica oscilatoria sincronizada y forma de las células PSM que oscilan en fase el mismo somitas. El período de la expresión génica oscilatoria es alrededor de 2 a 3 h en ratones y unos 30 min en el pez cebra. Cuando disociado, PSM células pierden la sincronía2,3, pero cuando son nuevamente agregadas, puede auto-organizarse y recuperar la población sincronía4, sugiriendo que el acoplamiento de la célula es una clave para la sincronización oscilaciones.
Esfuerzos extensos revelaron que moléculas de señalización en la vía de Notch Delta están conectadas firmemente a las oscilaciones sincronizadas de los genes de reloj de segmentación. Inhibidores farmacológicos o mutaciones genéticas de la señalización de Notch desincronizando la población de los osciladores. En el pez cebra, mutantes de la muesca señalización componentes como DeltaC, DeltaD y Notch1a, Mostrar oscilaciones asincrónicas5,6. En embriones de pollo o el ratón, el ligando de Notch Delta-like1 (Dll1), sino también el muesca modulador Lunatic fringe (Lfng) se requiere para oscilaciones sincronizadas7,8,9. Sin embargo, ha sido difícil para poner a prueba la capacidad funcional de estas moléculas para la transferencia de información dinámica de célula a célula, porque las resoluciones temporales de perturbación convencional de la dinámica de regulación gen no eran suficientes para investigar la procesos de escalas de tiempo de 2-3 h (Ritmos ultradianos).
Recientemente hemos desarrollado un método integrado para controlar y supervisar patrones de expresión de genes en células de mamíferos10. Esta tecnología permite la inducción de pulsos de expresión del gene por iluminación de luz periódica en escalas de tiempo ultradianos. Este protocolo representa los métodos para establecer líneas de células fotosensibles y observar respuestas dinámicas de las células de reportero por luminiscencia de células vivas en los contextos de la comunicación de célula a célula. Este método es aplicable para el análisis de muchas otras vías de señalización.
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Protocol
1. generación de líneas celulares estables por el sistema de Tol2
-
Transfectar vectores plásmido (figura 1A) de módulos basados en Tol2 optogenetic junto con el vector de expresión de la transposasa (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) en las células C2C12. En todas las etapas, células en cultivo con medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina a 37 ° C (tabla 1), en presencia de 5% CO2, denotada lo contrario.
- Contar células tripsinizaron con un contador de células y placa de 5 x 104 C2C12 células por pocillo en una placa de 12 pozos un día antes de la transfección.
- Co transfectar 0,375 μg de vectores basados en Tol2 optogenetic (pAI177 o pAI218), 0.125 μg de un vector de la selección de medicamentos (pAI170) y 0,5 μg de pCAGGS-mT2TP vector utilizando reactivo lipofection.
- Trypsinize células transfected y les placa de en platos de cultivo de 100 mm un día después de la transfección.
- Cambio de medio de cultivo para células transfected a medio de cultivo suplementado con 100 mg/mL Higromicina.
- Células en cultivo durante 3 días eliminar transfected las células. Tenga en cuenta que medio cambio no es necesario.
- Trypsinize células transfected y purificar una población de células que expresan proteínas fluorescentes para la selección. Para las células del receptor con pAI177, establezca la puerta de la clasificación en canal verde-PE para la purificación de la población de células mCherry-positiva. Para las células fotosensibles remitente llevar pAI218, establezca la puerta de la clasificación en canal APC para la purificación de la población de células iRFP713-positiva.
- (opcional) Establecer una población clonal de la célula por métodos estándar, tales como dilución limitada o unicelulares clasifica por FACS.
2. evaluación de la foto-sensibilidad de las células de ingeniería a nivel de población
Nota: Esta parte describe un protocolo para comprobar la inducción dinámica de proteínas de ligando Dll1 con iluminación de luz azul por ensayos bioquímicos, tales como qPCR y Western blotting.
- Establecer dos tipos de incubadoras con o sin fuentes de luz para una condición inducida por la luz o una afección oscurezca, respectivamente. Configuración-intensidad de la luz de un LED azul trans-iluminador, como se muestra en la figura 1B, utilizando un medidor de luz. Programa horarios y duración de iluminación de luz cargando un script de control a un micro-controlador de una placa que permite horarios programables para la iluminación (figura 1).
- Contar las células tripsinizaron con un contador de células y placa de 1.0 x 105 emisor fotosensible células con pAI218 y pAI170 en los platos de la cultura plástica de 35 mm de diámetro (más de 12 platos de condición de luz y 1 plato de condición oscura) y los platos en incubadoras para condiciones de luz/oscuridad se separan. Después de la creación de platos, mantenga las puertas de las incubadoras cerraron hasta recoger lysates de la célula.
- Uno y medio días después de la galjanoplastia, empezar a luz (las células se esperan que más del 80% confluente). No se exponga a la luz para evitar indeseable foto-estimulación de las células.
Nota: Horarios de iluminación depende del propósito de los experimentos. Tenga en cuenta que una condición de iluminación continua (por ej. intervalos de duración y 10 minutos de 1 minuto con 40 μmol/m2/s-intensidad de la luz) es suficiente para un simple control de inducción de foto y esa iluminación luz fuerte es perjudicial para las células. Así, asegúrese de que se seleccionan parámetros inofensivos para la iluminación. - Aproximadamente 2 días después de la galjanoplastia, preparar cell-lisado con intervalos de 30 min. Hacia platos muestra de incubadoras en hielo y comienza a preparar los lysates de la célula para su posterior análisis.
3. dinámica de emisor y receptor ensayo a nivel de población: monitoreo en tiempo real de respuestas celulares al estímulo óptico por PMT
- Trypsinize y cuenta el número de remitente y el receptor las células con métodos estándar. Preparar un volumen total de 1 mL de la mezcla de suspensión de 2.5 x 104 receptor y 1.25 x 105 células de remitente (proporción 1:5).
Nota: 2:1, 1:1, o 1:2 relación de emisor-receptor también funciona con un número total de células de 1.5 x 105. 10 - Placa mixta células en cada pocillo de las placas de 24 pocillos negras con medio de cultivo con luciferin 1 mM.
- Analizar las células en el lector de placas para ensayo de luciferasa y confirmar que las señales de salida no son demasiado altas para el sistema de grabación.
Nota: Si las señales de salida son mayores que 1 x 106 fotones cuenta/s, puede estar saturados. En ese caso, disminuir la concentración de luciferin valores óptimos para que las señales de salida son menores que 1 x 106 fotones cuentas/s. - Coloque la placa en el sistema de grabación y comenzar un programa de grabación (figura 1). Por ejemplo, iniciar la iluminación de la luz a las 18 h después de configurar la grabación.
Nota: Filtrado Temporal, tales como señales robustos con móviles promedio y Savitzky-Golay filtrado, son útil para la visualización de formas de onda y las detecciones de pico.
4. dinámica de emisor y receptor análisis a nivel unicelular: en tiempo real imágenes de unicelular respuestas bajo el Control de perturbación Optogenetic
- Placa de 0,5 x 105 receptor y 2.5 x 105 células de remitente en platos de base 27 mm vidrio diámetro 35 mm de diámetro. Asegurarse de que proporciones de mezcla y un número de celular total (una densidad de la célula) están ajustadas correctamente.
- Un día después de la galjanoplastia, intercambio medio con 2 mL de medio de grabación (rojo de fenol libre DMEM suplementado con 5% FBS, penicilina-estreptomicina y luciferin de 1 mM) y el plato base de cristal en el microscopio. Si es necesario, eliminar restos de células muertas con PBS (-).
Nota: Es preferible hacer este paso en una condición oscura. - Configurar un microscopio invertido, dotado de una cámara a 37 ° C y 5% CO2.
- Configurar una cámara CCD refrigerada. Asegúrese de que se haya enfriado la temperatura del sensor CCD en el valor de destino (normalmente,-90 ° C).
-
Establecer parámetros para la ventana de "Lapso de tiempo multidimensional" en el software de adquisición automática para capturar imágenes con intervalos de 5 min y más de 288 veces (más de una grabación durante la noche).
- Abrir ventana de "Lapso de tiempo multidimensional", seleccione un canal de la luminiscencia y un modo de lectura lenta de 50 kHz en el menú desplegable y ajuste binning 4 x 4 con 4 min de exposición. Asegúrese de que el modo de lectura se establece en el modo lento de 50 kHz, que es crítico para la reducción de ruidos de lectura para detectar la débil emisión luz bioluminiscente.
- Abrir ventana de "Lapso de tiempo multidimensional", seleccione canales de fluorescencia y un modo rápido de lectura de 1 MHz en el menú desplegable y sistema 2 x 2 binning con exposición de 400 ms. Asegúrese de que el modo de lectura se establece en el modo rápido de 1 MHz para reducir el tiempo necesario para la proyección de imagen de la fluorescencia.
- Start Time-lapse de grabación haciendo clic en "Adquirir".
- Extraiga el unicelular rastros de canales de luminiscencia de películas Time-lapse por software de análisis de imagen, como sigue. En primer lugar, hacer imágenes de pila de luminiscencia y fluorescencia mediante la importación de los datos de imagen a software de análisis de imagen. Imágenes de luminiscencia, quitar píxeles calientes derivados de los rayos cósmicos mediante la comparación de las intensidades de los píxeles de imágenes temporal adyacentes, reemplazando los valores de píxel para el promedio temporal de los fotogramas anteriores y siguientes (implementado como filtro"SpikeNoise"), Estas imágenes procesadas se aplica un filtro espacial suavizado y restar valores de píxeles de fondo de out-field vistas de cada fotograma. A continuación, determinar una "región de interés" (ROI) para cada celda en una imagen fluorescente en cada momento, el retorno de la inversión se aplica a imágenes luminiscentes, y medir la intensidad luminiscente de cada retorno de la inversión.
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Representative Results
Adaptamos el LightOn sistema11,12, que permite la expresión del gen foto-inducida en células de mamíferos, el estudio de los osciladores genéticos con periodicidad de 2 - 3 h. Este sistema consta de dos partes: el hGAVPO activador transcripcional inducible por la foto y un cassette de promotor de UAS a transcripción unidad arbitraria genes de interés. Para acelerar la cinética pulsátil de la expresión génica inducida por la foto, la secuencia de polyA en el cassette de UAS-promotor fue substituida por Hes1 murino 3' UTR, que acorta la vida media del mRNA a 20 min en fibroblastos murinos.
Para establecer líneas celulares estables, tri-cistrónicos vectores basados en el sistema de la transposasa de Tol2 fue usado13 (figura 1A). El vector de expresión de Tol2 es esencial para la mejora de la eficiencia de la integración cromosómica del plásmido cassettes14. Estos vectores llevan no sólo a los cassettes de expresión de genes inducible por la luz impulsados por el promotor de UAS, sino también a los cassettes de expresión de las proteína fotosensible hGAVPO y fluorescente proteínas (iRFP71315 o mCherry). Este diseño nos permitió purificar una población de células que integran eficazmente la plásmidos en el genoma del anfitrión.
Establecimos las células fotosensibles remitente que Dll1 ligando producen con iluminación de luz azul (figura 2A). Para ello, se utilizó un Tol2 basado en el sistema bi-cistrónicos vector (pAI218). Para comprobar la inducción de Dll1 ligando sobre la luz, las células fueron cultivadas en las incubadoras equipadas con fuentes de luz azul LED programadas que se muestra en la figura 1B y 1C. Resultados representativos de la foto-inducida Dll1 proteína expresión dinámica Western Blot análisis se muestran en la figura 2B y 2C.
Para establecer las células que responden a entradas de señalización de Notch, utilizamos un Tol2 basado en el sistema bi-cistrónicos vector (pAI177) lleva el reportero desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gene de efector de muesca Hes1 y el fosfoglicerato quinasa (PGK) impulsado por el promotor localizadas en núcleos rojo fluorescente reportera mCherry H2B. En este caso, el reportero fluorescente es útil para la purificación y unicelular en time-lapse microscopia.
Una vez que se establecen con éxito células foto-inducible del remitente y receptor, está listo para realizar análisis dinámicos de emisor y receptor por co-cultivo estas células (figura 2A). En este ensayo, las células fotosensibles remitente que expresan la proteína ligando de Notch Dll1 sobre iluminación luz azul fueron cultivadas conjuntamente con las células del receptor insensible a la foto que el oscilador endógeno de Hes1 y una bioluminiscencia (reportero) Hes1 pHes1-dLuc) (Figura 2D). Las células del receptor endógeno expresan el receptor Notch, que responde a la Dll1 presentado por células vecinas.
Resultados representativos de los análisis dinámicos de emisor y receptor se muestran en la Figura 2E y 2F. Para detectar las respuestas dinámicas de las células del receptor con la grabación de la bioluminiscencia, primero utilizamos un sistema de monitoreo de células vivas equipado con un tubo Foto-multiplicador de alta sensibilidad (PMT) para el conteo de fotones y una fuente de luz azul para el estímulo de luz ( Figura 1). Este sistema permite la grabación en tiempo real de señales de la bioluminiscencia en el nivel de población con iluminación de luz programada. Cuando estos dos tipos de células fueron cultivados conjuntamente y expuestos a iluminación luz repetitiva (30 s duración, intervalos de 2,5 h), las respuestas cíclicas de las células del receptor eran perceptibles en diversas condiciones de la mezcla de proporciones (Figura 2E). En este ejemplo, hemos aplicado Savitzky-Golay filtrado (4to orden y una ventana de datos-punto 13) para atenuar las señales ruidosas. Time-lapse microscopia con iluminación luz repetitiva (2 minutos de duración, los intervalos de h 2,75) también reveló las respuestas sincronizadas de las células del receptor en el nivel unicelular (líneas grises en la figura 2F) y a nivel de población (línea roja en figura 2F). estos datos sugieren que la expresión cíclica de Dll1 proteína en células de remitente es suficiente para sincronizar Hes1 oscilaciones en los vecinos de las células del receptor.
Figura 1: estrategia para analizar las respuestas celulares a las perturbaciones optogenetic. (A) esquema de vectores plásmido representativo utilizado para este protocolo. Estos plásmidos están disponibles bajo petición. (B) una foto de una incubadora de CO2 equipada con un dispositivo LED azul bajo una placa de cultivo celular 6-bien. (C) esquema de un circuito eléctrico para controlar el poder de la fuente para la fuente de luz LED por un microordenador programable. Un relé de estado sólido (SSR) fue creado para transmitir Estados de los pines digitales de la computadora a los Estados de la fuente de luz LED de encendido/apagado encendido/apagado. (D) una foto y el esquema de una bioluminiscencia de células vivas, sistema de monitoreo. Tenga en cuenta que la etapa motorizada puede mover unidireccionalmente desde una posición de grabación en la parte superior del detector PMT a una posición de iluminación en la parte superior de la fuente de luz LED. También, tenga en cuenta que el detector PMT puede pasar de bien a bien a monitorear las señales de los pozos individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplos de experimentos de perturbación optogenetic. En estos ejemplos, se utilizaron líneas de celulares de mioblastos C2C12 murinas. (A) diagrama esquemático del ensayo dinámico de emisor y receptor. (B, C) Resultados representativos de la expresión inducida por la luz de Dll1 analizadas por Western Blot análisis. Dll1 proteínas fueron inducidas por iluminación luz periódica con un período de 2,5 h, 2 min de duración y la intensidad de 24,7 W/m2. Imagen de fluorescencia (D) del sistema de co-cultivo de células emisor y receptor. (E, F) Resultados representativos del análisis dinámico de emisor y receptor. Patrones temporales (E) de las respuestas del receptor registrados por el sistema de monitoreo de células vivas equipado con el dto. El número total de células se fijó a 1.5 x 105 células, pero las relaciones entre los remitentes y los receptores se distribuyeron desde 5:1 1:2. (F) proyección de imagen de unicelular reveló que información oscilatoria, que fue inducida por la iluminación de luz periódicos (duración de 2 minutos, intervalos de h 2,75), fue trasladado desde remitente a las células del receptor. se utilizaron 1,5 x 105 células con la relación emisor-receptor de 5:1. Adaptado de ref. 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mostramos un método para controlar la dinámica de expresión de genes con una periodicidad de 2 a 3 h. Esta escala de tiempo es mucho más corta que los de otros sistemas convencionales, incluyendo el sistema Tet y el original sistema de LightOn. Parámetros clave para llegar a las escalas de tiempo ultradianos son la vida media de productos molecular inducida por la foto, mRNAs y proteínas. Estos parámetros cinéticos pueden depender de las especies y tipos celulares. Para afinar la cinética, sustituir secuencias de Hes1 3' UTR con otros de forma directa, porque no altera las secuencias y funciones de las proteínas blanco. Para buscar otros 3' UTRs para obtener patrones pulsátiles en particular las células de interés accesible, células vivas monitoreo de dLuc por la inducción de luz es un buen punto de partida y utilizado para la proyección y validación.
Una de las preguntas más frecuentes es sobre el manejo diario de las células sensibles a la luz. En el caso del análisis de la dinámica de emisor y receptor de la señalización de Notch, éramos capaces de hacer diariamente pasajes celulares bajo luces de la habitación, porque nuestros sistemas (foto-inducible dLuc o células Dll1 y receptor células) no alterar la proliferación celular y volver rápidamente al reposo Estados dentro de 6 horas después de que las células se mueven a una condición oscura. Si los genes de interés son factores de determinación sino, expresión con fugas puede inducir la diferenciación celular o prevenir expansiones de las células, y por lo tanto, es esencial establecer un ambiente de luz roja para evitar perturbación indeseable optogenetic durante manejo de la célula.
En este protocolo, se presentan los procedimientos para generar líneas celulares estables con casetes de expresión génica inducible por la foto. Este es un paso crítico para obtener resultados confiables en el análisis dinámico de emisor y receptor. Uno puede considerar transitorios de la transfección para la introducción de módulos de optogenetic en las células, pero no funciona bien en nuestras manos para mediciones cuantitativas de pulsos ultradianos. Encontramos transitorios de la transfección de plásmidos que conduce de cassettes de promotor de UAS a expresión agujereado en niveles relativamente altos, incluso bajo una condición oscura. Esta expresión con fugas causa un fondo alta sin cualquier estimulación ligera e impide una medición fiable del curso del tiempo. Un método alternativo para establecer células estables es un sistema de lentivirus, que es útil para los tipos de células que no son adecuados para la transfección12. Líneas celulares clonales presentan respuestas más homogéneas que las líneas celulares heterogéneas, pero incluso en una población clonal, las respuestas de la célula no están siempre uniformes: algunas células no responden a la estimulación de luz y por lo tanto presentan una distribución niveles de inducida por la luz expresión de la proteína. Esto puede ser debido a los niveles de expresión variable de hGAVPO proteína o variable endógena abundancia de flavin, un cromóforo para detección de luz de hGAVPO.
El protocolo que presentamos proporciona una poderosa herramienta para el análisis de la dinámica de expresión de genes, pero hay algunas limitaciones. Una desventaja es que algunos canales de fluorescencia para microscopía de células vivas no son compatibles con el estímulo de luz azul. Iluminación de la luz azul activa no sólo las proteínas sensibles a la luz del azul, sino también proteínas fluorescentes, entre verdes y amarillas fluorescentes proteínas (PFG y YFPs), que son susceptibles de blanqueo de foto. Por el contrario, la visualización de GFP requiere excitación de luz azul que puede desencadenar la activación indeseable de células foto sensibles durante la captura de imágenes fluorescentes. Campo brillante (contraste de fase) la proyección de imagen de la fuente de luz es también incompatible con experimentos de optogenetic de luz azul, pero uno puede evitar este problema mediante el uso de fuentes de luz de longitud de onda verde o más para la proyección de imagen.
El ensayo dinámico de emisor y receptor sería útil para investigar otras vías de señalización. Una posibilidad es una aplicación para secretoras de señalización. Para tales análisis, aplicación de ligandos purificadas en dispositivos micro fluídicos es una alternativa para estimular las células del receptor en una forma temporal precisa16,17. Sin embargo, los enfoques son inaccesibles a los procesos de producción dinámica de moléculas de ligando en las células del remitente. Empleando el ensayo dinámico de emisor y receptor junto con la expresión del ligand foto-inducible permitiría más disección de transmisión de la señal de remitente a las células del receptor.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por JST, PRESTO (A.I.), núcleo investigación evolutiva de la ciencia y tecnología (JPMJCR12W2 (r)), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT), Japón 26119708 (e) y 16 H 06480 (R.K.)), científico (A) (sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) 24240049 (r)), de investigación y jóvenes científicos (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)) y subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras "de la fluorescencia Vivo imagen"del MEXT, Japón y plataforma para enfoques dinámicos a vivos de MEXT, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
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