Summary
该方法描述了介入静脉移植在家兔中的位置、移植物的转导以及持久性转基因表达的实现。这允许调查转基因及其蛋白产品在接枝静脉中的生理和病理作用, 以及对静脉移植病基因治疗的检测。
Abstract
静脉搭桥术是治疗闭塞性动脉疾病的常见方法;然而, 由于血栓形成、内膜增生和动脉粥样硬化的移植失败, 长期的成功是有限的。本文的目的是演示一种将双侧静脉介入移植在兔身上的方法, 然后用基因转移载体传感移植物, 达到持久的转基因表达。该方法可用于研究基因及其蛋白产物在正常静脉移植稳态中的生物学作用。它还允许测试转基因的活动, 以防止静脉移植失败, e., 转基因的表达是否能防止新生内膜的生长, 减少血管炎症, 或降低家兔动脉粥样硬化高脂肪饮食。在最初的生存手术中, 左颈外静脉的部分被切除, 并放置在双边上, 作为反向端对侧颈总动脉介入移植。在第二次生存手术中, 28 天后进行, 每一个移植从循环与血管片段分离, 流明是填补 (通过 arteriotomy) 与解决方案, 其中包含帮助者依赖腺病毒 (HDAd) 向量。经过20分钟的孵化, 矢量解吸气, arteriotomy 修复, 流恢复。这些静脉是在个别实验规程所规定的时间点上收获的。移植术与转导之间的28天延迟是确保移植静脉适应动脉循环的必要条件。这种适应避免了快速丢失的转基因表达, 发生在静脉移植转基因之前或紧接移植后。该方法具有在嫁接静脉中获得持久、稳定的转基因表达能力的独特性。与其他大型动物静脉移植模型相比, 家兔具有成本低、处理方便等优点。与啮齿动物静脉移植模型相比, 家兔具有更大、更易于操作的血管, 为分析提供了丰富的组织。
Introduction
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病, 其中脂质积累和炎症在血管壁导致血管腔狭窄, 心脏病发作, 中风, 四肢失去1,2。经皮介入治疗 (e., 血管成形术和支架植入术) 和医疗疗法 (g., 他汀类药物和抗血小板药物) 是治疗动脉粥样硬化的有效方法;然而, 在冠状动脉和外周循环中, 它们往往不能有效地治疗严重的梗阻性疾病。旁路移植术, 使用自体静脉段, 仍然是一个常见的程序治疗严重, 弥漫性冠状动脉和周围血管疾病3,4。然而, 在冠状动脉和外周循环中放置的静脉移植有很低的长期通畅率。在冠状动脉循环中, 大约10-20% 的静脉移植被闭塞1年, 50% 被闭塞10年5,6。在外周循环中, 静脉移植失败率为 30-50%, 5 年7。
基因治疗是一种很有吸引力的方法, 以防止静脉移植失败, 因为它可以提供一个治疗基因产品精确地在该疾病的地方。因此, 许多临床前研究已经测试了静脉移植基因治疗8,9。然而, 基本上所有这些研究已经检查的功效在早期点 (2-12 周)10,11,12,13,14,15,16,17. 我们知道没有证据表明基因治疗干预能提供持久 (多年) 保护, 防止晚期静脉移植失败, 通常是由新生内膜增生和动脉粥样硬化4引起的。我们开发了一种方法, 允许持久的转基因表达在嫁接静脉, 从而允许测试的基因治疗干预的后期以及早期的时间点。为实现持久的转基因表达, 该方法纳入 HDAd 载体和延迟转导策略。HDAd 载体提供长期的转基因表达, 因为他们缺乏病毒基因, 防止转基因细胞的识别 (和排斥) 的免疫系统18,19,20, 21. 延迟转导 (移植术后28天进行) 可防止移植22后早期发生的动脉过程中转基因细胞的丢失。
在静脉移植术中实现转基因表达的其他方法依赖于移植术10、11、12、15、16 时静脉移植的转导. ,17。在连续测量时, 使用这种方法的转基因表达在转导22、23后迅速下降。因此, 用这种方法进行的研究并没有对静脉移植后12周后的疗效进行检查, 最不评估疗效超过4周。相比之下, 我们的方法实现了静脉移植基因的表达, 稳定持续至少24周, 并根据类似的研究在动脉中进行-可能继续远长于22,24。我们知道没有其他静脉移植基因治疗干预, 达到稳定的转基因表达这一持续时间。
我们用兔子模型来发展我们的方法。另一些则使用啮齿动物、兔子或较大的动物来测试静脉移植基因治疗10、11、12、15、16、17、25、 26。与啮齿类动物模型相比, 兔子更昂贵, 并受到更严格的监管要求。然而, 与较大的动物相比(例如, 猪和狗), 兔子购买和房子的成本要低得多, 而且处理起来也更容易。此外, 兔血管与人体血管相似, 在生理上27, 它们足够大, 可以用来测试经皮介入治疗28,29, 他们提供了足够的组织,多个端点 (e., 组织学, 蛋白质, RNA) 可以使用单血管标本22,30检查。此外, 当带静脉移植的兔以高脂肪饮食喂养时, 他们发展静脉移植动脉粥样硬化31,32, 这是冠状动脉旁路移植失败的常见原因4,5.这些动脉粥样硬化兔静脉移植可以作为一个基质, 以测试的基因治疗干预提供这种方法。所提供的协议可以帮助研究者掌握在兔静脉移植中实现持久转基因表达所需的技术技能。
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Protocol
所有动物协议和研究被华盛顿大学动物福利办公室批准。
1. 手术前 (所有手术)
- 麻醉兔与30毫克/千克氯胺酮和1.5 毫克/千克甲苯噻嗪通过肌肉注射 (IM) 在 paraspinous 肌肉。
注意: 手术前不限制食物和水。 - 在等待足够深度的麻醉时, 在准备室和手术室 (或) 设置表。
- 准备准备房间剃须兔颈部和放置静脉 (IV) 口岸在耳朵 (仅生存手术)。放置眼科软膏, 芬太尼贴 (生存手术), 发剪, 酒精准备垫, 24 克 x ¾ "导管, 注射口, 和手术胶带在准备表。
- 在或, 设置监测设备和相关探头 (心电图 (心电图), 脉冲氧 (2) 和温度)。用18克或19克针的100毫升盐水 iv 袋准备 IV 泵, 并将流速设置为10毫升/小时/千克 (仅限存活手术)。用 nosecone (静脉移植或收割手术) 建立氧和异氟醚设备。
- 为了帮助保护 nosecone 的兔子, 循环一个纱布条周围的管道, 供应气体的 nosecone。这个循环应该围绕在它附加到 nosecone 的管。纱布条的游离端应长约45厘米。将 nosecone (附纱布) 放在桌子的头端。
- 打开或放在桌子上的循环水和/或强迫空气预热毯。在暖毯上, 将一条卷起的毛巾定位为颈部支撑, 并放置烙色散电极板。
- 作为局部镇痛剂, 在注射器1毫升2% 盐酸利多卡因和1毫升的0.5% 布比卡因盐酸盐. 稀释病毒到所需浓度 (这里, 使用 2 x 1011的病毒微粒/毫升为 HDAd) 在无菌 DMEM 和保持冰 (仅基因转移手术)。
- 在达到足够的麻醉深度后, 准备好兔子进行手术。
注: 测试缺乏踏板退出反射, 以确保足够的麻醉深度。继续监测整个手术中的踏板反射。- 将眼膏应用于兔眼。
- 为了放置直肠温度探头, 请按下直肠上戴手套的手指, 然后向肛门移动手指, 从兔子的直肠中取出 stooling。
- 将兔子从胸骨切口刮到下颌边缘。剃须一耳为 IV 安置和相反耳朵为芬太尼补丁管理 (仅生存手术)。剃须左后中脚趾的位置的2探头。
- 为载体输液手术, 插管兔。使用4毫米外径/3 毫米的 uncuffed 气管插管, 螺纹在关节镜。把兔子放在胸骨卧床和超伸展颈部。把兔子的嘴巴张开, 用关节镜来形象化声门和喉部的褶皱。在灵感的过程中, 轻轻地将气管导管插入喉部, 进入气管。
- 为生存手术, 安置和安全一个24克 IV 导管入兔子的左耳朵静脉并且盖它与注射口岸。将25µg/小时芬太尼贴在兔子的右耳上。
注意: 该协议是一个外科医生定位在兔子的右侧。如果外科医生将在兔子的左侧, 扭转这一步骤的两侧保持与外科医生的线和 IV。根据需要在以后的步骤中切换双方。 - 对于静脉移植和收获手术, 用 nosecone 进行全身麻醉;对于矢量输液手术, 通过气管插管进行全身麻醉。
注: 气管插管可用于所有手术。 然而, 在我们的经验中, 气管插管和喉部外伤后并发症的风险可能超过插管的好处。 包括基因转移到移植物 (特别是胆固醇喂养的兔子) 的手术是唯一的手术, 气管插管似乎提供了净好处。 - 把兔子带进或。把兔子放在手术台的仰卧位上, 颈部支撑毛巾放在兔子头下面。轻轻伸展兔子的脖子, 直到它是直的和近似水平。
- 把 nosecone 到兔子 (静脉移植和收割手术) 或连接气管导管 (矢量输液手术) 与 O2在1升/分, 并开始异氟醚。如果使用的是 nosecone, 通过包装在兔子的脖子支持毛巾周围的附着纱布条的两端来确保它。根据需要调整异氟醚浓度 (通常为 1-2%), 以维持手术水平的麻醉。
- 将烙分散电极板放在兔子背部的中央。插入直肠温度探头, 并应用2探头和心电图导致兔。
- 将生理盐水 iv 线连接到兔左耳的导管口, 并以10毫升/小时/千克开始静脉注射输液泵。1小时后, 将盐水输液率降低到5毫升/小时/千克。
- 将兔子的前腿松散地拴在手术台上作为克制。
注: 可选, 可以将一个小的塑料桌子放在兔子上, 以防止外科医生按下兔子的胸部/腹部, 并有可能引起胃食管反流和吸入。 - 注射利多卡因/布比卡因 (2 毫升, 50/50 混合, 步 1.2.4) 在颈部沿计划切开线 (平方米), 用于局部麻醉。
- 让助手用3的葡萄糖酸氯己定和异丙醇交替磨砂消毒手术部位, 然后用聚维酮碘喷洒该部位。有外科医生擦洗, 长袍和手套, 遵循无菌原则。
- 在无菌条件下进行生存手术。让助手处理任何无菌物品, 灌装将不育的材料传给外科医生或灌装把它们放在被覆盖的仪器桌上。
- 让外科医生使用无菌毛巾灌装操作非消毒设备, 如显微镜。外科医生在执行手术前半部分时, 要佩戴2x 外科放大镜。
2. 静脉移植手术 (生存)
- 准备仪器和无菌场。
- 有助理开放无菌包装 (表悬垂, 纸悬垂, 6 毛巾) 和灌装转移的内容给外科医生。
- 把仪表桌挂上。将纸张悬垂和无菌毛巾放到被覆盖的仪表桌上。用4条毛巾, 将兔子披上, 只留下颈部的手术部位。把纸披在兔子身上。稍后将使用一条毛巾, 最后一个是备份。
- 让助手打开消毒的仪器包, 灌装把仪器托盘递给外科医生。在仪表桌上安排仪器。
- 让助手打开以下设备, 灌装将其传递给外科医生或将其放到仪表桌上: 一个1毫升的注射器, 一个3毫升的注射器, 一个20毫升的注射器, 一个21克针, 3-0 羟基酸 (pga) 缝合, 5-0 PGA 缝合, 7-0 聚丙烯缝合, 一24克 IV 导管。
- 用 7.25 "坎特罗威茨钳" 将烙电缆固定在覆盖兔子的褶皱上。将电缆的插头端放在操作表的边缘上, 使其连接到高频单元并由助手打开。
- 用由助手持有的盐水袋或小瓶中的无菌生理盐水填充20毫升注射器。使用此生理盐水, 以防止在手术期间暴露的组织脱水。
- 在一个小的外科碗中加入0.1 毫升5000血气的肝素到5毫升盐水溶液, i., 100 的肝素/毫升, 准备5毫升的生理盐水溶液。使用此解决方案在接枝过程中定期冲洗颈动脉和静脉移植。
- 在兔子脖子上的手术部位上, 把纸上的一个洞剪掉。使用毛巾夹钳夹住孔的角落到位的基础毛巾。
- 血管解剖
注: 使用2x 外科放大镜来辅助手术的这一部分。- 烙沿胸骨切口与下颌骨之间的中线切开皮肤 (长度约为7-9 厘米), 用毛巾钳夹住兔子的颈部皮肤到毛巾上。在尾端, 用烙在筋膜上进行短侧切。用大剪刀直接解剖整个中线下的筋膜下。烙沿中线切开经解剖的筋膜层。
- 从右边开始。解剖在气管上的胸骨舌骨肌和 V 形 sternocephalic 肌之间, 以暴露颈总动脉。
- 仔细解剖4-5 厘米的颈总动脉和其较大的分支 (通常1-2 每侧) 没有周围的组织。将解剖从下部颈底延伸至咽神经远端交叉处。在解剖过程中使用手术硅循环来帮助颈动脉的收缩。结扎颈总动脉的较大分支与5-0 丝缝线缝合, 然后再切开每个分支远端。
注意: 注意不要扰乱与颈总动脉平行的迷走神经, 也不要干扰过动脉的小神经。 - 重复左侧的解剖 (步骤 2.2.3)。
- 使用组织夹钳暂时关闭皮下组织层。解剖从右侧皮肤的浅筋膜, 直到外颈静脉暴露。解剖4-5 厘米外颈静脉, 并从周围组织游离其分支, 结扎小枝与5-0 丝缝线切开分支。
- 重复左侧的解剖 (步骤 2.2.5)。
- 注射肝素 (150 毫升/千克) 在 IV 导管和冲洗与 10 mL 生理盐水。
- 测量右侧颈外静脉3厘米段, 并结扎段尾端与5-0 丝缝合。允许静脉填充血液, 然后结扎静脉段的颅骨末端。将颈外静脉段的颅底分开, 用一支3毫升的注射器, 用一根24克 IV 导管, 小心冲洗血气正常生理盐水 (100 U/毫升) 的血管。将静脉段分在尾端。将静脉段放置在一个标准化的位置, 尾部和颅骨末端是明确地可辨认的。
- 静脉移植
- 让助手从外科医生那里取出手术放大镜, 将手术显微镜 (25X) 移到原位。
注意: 外科医生应该在显微镜上挂一条不育的毛巾。这使得外科医生可以在保持不孕的同时操纵显微镜。 - 用迷你夹子钳住隔离段每一端的右颈总动脉, 先放置颅骨钳, 使动脉充盈, 然后放置尾钳。
- 切 1 x 2 厘米硬纸 (可从无菌缝合包装) 和放置在颈总动脉下方, 以改善暴露。
- 执行一个 arteriotomy 只是颅尾钳 (尾部 arteriotomy)。arteriotomy 长度应等于静脉段颅底的直径。插入注射器与 IV 导管通过尾 arteriotomy 和冲洗颈动脉腔与血气生理盐水。
- 将静脉的颅底缝合至尾 arteriotomy, 使用7-0 聚丙烯缝合单针 (图 1)。
- 放置第一针缝合尾 arteriotomy 尾端到静脉段的颅骨末端。将第二针180°从第一针, 缝合尾 arteriotomy 的颅骨末端到静脉段的颅骨末端。
- 将第三针放在与前两针相等的点上, 在吻合的侧面。将第四针放在吻合的内侧, 从前两针到三针的距离相等。放置4针 (针 5-8) 之间的每针1-4。
- 在颅骨 arteriotomy 的尾部进行颅骨的侧向。颅 arteriotomy 和尾 arteriotomy 尾端之间的距离应与静脉段长度相同。颅 arteriotomy 的长度等于静脉段尾端的直径。
- 将静脉 cranially 从吻合口伸展, 放置在颈动脉顶端, 不引入任何曲折。通过颅骨 arteriotomy 血气正常生理盐水冲洗颈动脉和静脉。生理盐水将流经动脉, 通过骶管吻合进入静脉, 并将从静脉的游离和腹膜端退出。冲洗静脉也可防止其扭曲。
- 将静脉尾端缝合至颅骨 arteriotomy (图 1)。
- 放置第一针缝合的尾端的颅骨 arteriotomy 到尾端的静脉段。第二针缝合颅骨 arteriotomy 的颅骨末端到静脉段的尾端。完成步骤2.3.5.2 中所述的吻合。就在最后一个结被绑在颅骨吻合之前, 简单地打开解剖颈总动脉段颅骨末端的钳位, 以允许在颈动脉和接枝静脉内冲洗空气的背部出血。然后, 拧紧最后一个结。
- 释放颅骨钳, 允许静脉灌入血液, 然后松开尾钳。在静脉移植中应看到轻快的脉动。使用温和的压力与干纱布, 以阻止任何出血的吻合。
- 结扎颈总动脉段的两端连接吻合与3-0 丝缝合, 并将颈动脉分割成连字的一半 (图 1)。应用几滴罂粟碱 (3.5 毫克/毫升) 的颈动脉相邻的每一个吻合。
- 注射肝素 (75 毫升/千克) 到耳 IV 导管和冲洗与 10 mL 生理盐水。此时, 注射丁丙诺啡 (平方, 0.02 毫克/千克), 以提供术后镇痛, 直到芬太尼补丁提供镇痛血浆水平的芬太尼。
注: 另外丁丙诺啡注射液 (平方, 0.02 毫克/千克) 可能是必要的6小时后第一次注射, 以保持镇痛, 直到血浆芬太尼达到治疗浓度。 - 在左侧重复移植 (步骤 2.2.8, 2.3. 2-2. 3.9)。
- 使用连续的模式关闭皮下组织与 5-0 PGA 缝合。使用一个皮模式关闭 3-0 PGA 缝合皮肤。把结埋在两端。
- 让助手从外科医生那里取出手术放大镜, 将手术显微镜 (25X) 移到原位。
- 手术后的恢复、清理和护理
注意: 允许兔子在平静安静的环境中从麻醉中恢复。持续监测家兔的正常氧合和体温直到完全恢复。- 关闭异氟醚和氧气, 从兔身上拔下麻醉机。从兔子身上拔下 iv 流体导管, 但将 iv 端口留在耳静脉中, 以便紧急进入。
- 把兔子运到一个恢复笼子里, 放在它的一侧。用温水毯 (或强迫空气变暖) 提供热支持。通过 nosecone 给 O2 , 直到2稳定。
- 直到兔子可以坐起来, 走动在笼子里, 每隔15分钟就把兔子翻转到另一侧。然后取下耳 IV 套管, 将兔子送回笼子。只有在完全恢复麻醉后, 才能将兔子送回其他动物的公司。
- 根据有关生物危害和锋利废物处置的适当议定书处置任何废物。
- 术后, 每天检查家兔的健康和手术伤口。管理丁丙诺啡的疼痛需要不由芬太尼补丁管理。在手术后3天取出芬太尼补丁。
3. 经皮超声
- 为评估移植术后的通畅率, 对非麻醉家兔进行静脉移植手术和基因转移手术5-7 天的超声检查。
- 将不麻醉的兔子安全地裹在毯子里, 把兔子仰卧在兽医的 V 型槽中, 颈部延长。剃掉颈部, 或者如果需要, 用脱毛剂去除头发。将超声波凝胶应用于颈部并进行超声检查。
注: 在基因转移手术和终末嫁接收获手术时, 对麻醉家兔进行超声检查, 观察移植通畅度, 测量接枝腔直径。检查是在颈部擦洗前完成的, 并以与非麻醉家兔相似的方式进行。
- 将不麻醉的兔子安全地裹在毯子里, 把兔子仰卧在兽医的 V 型槽中, 颈部延长。剃掉颈部, 或者如果需要, 用脱毛剂去除头发。将超声波凝胶应用于颈部并进行超声检查。
4. 基因转移手术28天后移植安置 (生存手术)
- 准备仪器和消毒场。
- 按照步骤 2.1. 1-2. 1.3。静脉移植手术。
- 让助手打开以下设备, 或者灌装将其传递给外科医生或将其放到仪表桌上: 六1毫升注射器 (带针), 一个3毫升注射器, 一个20毫升注射器, 一个21克针, 一个19克针, 3-0 PGA 缝合线, 5-0 PGA 缝合, 7-0 聚丙烯缝合, 两个24克 IV 导管和无菌血流探针。
- 按照步骤 2.1. 5-2. 1.6。静脉移植手术。
- 准备一个1毫升的注射器与1毫升 DMEM 洗动脉和静脉移植, 并准备两个1毫升注射器与病毒解决方案 (~ 0.5-0.7 毫升病毒解决/静脉移植)。让助手解冻病毒, 稀释它在 DMEM。用0.5 毫升的利多卡因/布比卡因 (50/50 混合, 步 1.2.4) 准备一个3毫升的注射器。
- 在静脉移植手术中遵循步骤2.1.8。
- 静脉移植与颈旁动脉的分离
注: 2x 外科放大镜应用于本部。- 用烙沿胸骨切口与下颌骨之间的中线切开皮肤 (长度约为7-9 厘米), 用毛巾钳夹住皮肤。应用0.5 毫升利多卡因/布比卡因 (50/50 混合, 步 1.2.4) 到皮下组织。
- 在尾端, 用烙在筋膜上进行短侧切。在整个中线的筋膜下坦率地解剖。用烙, 切开沿中线的解剖筋膜。
- 从右边开始。解剖的胸骨舌骨肌肉覆盖气管和 V 形 sternocephalic 肌肉, 以揭露静脉移植。小心地隔离静脉移植和 1.5-2.0 厘米的颈动脉相邻的移植在颅和骶两侧。
- 在步骤4.2.3 后, 在左侧重复解剖。
- 测量静脉移植物中的血流量。
- 用生理盐水填充右侧的外科伤口腔, 使声波传播。将2毫米周围流探针 (连接到容积流量计) 浸入伤口腔中的盐水中, 并将流速设置为零。
- 将血流探头放在颈动脉尾部或颅骨周围, 将静脉移植。用电子数据采集系统记录流量探头的数据。
- 重复步骤4.3.2 后左侧的流量测量。
- 根据峰值收缩流速、最小舒张流速和平均流速计算搏动。根据流速和流明直径 (经经皮超声测量) 计算层流剪切应力。
- 在静脉移植中注入载体溶液
注: 手术显微镜 (16X) 用于治疗颈动脉穿刺、输液和修复。- 让助手删除外科医生的手术放大镜, 将手术显微镜移到原位。让外科医生在显微镜上披上一条不育的毛巾。无菌毛巾允许外科医生操作显微镜, 同时保持不育。
- 让助手在 IV 导管中注射肝素 (150 磅/千克) 并冲洗生理盐水。
- 使用大针驱动程序将21克针弯曲到大约80°正上方的斜角 (不要弯曲斜面;图 2A)。
- 用小钳夹住静脉移植端的颈总动脉, 先放置颅骨钳, 使动脉充盈, 然后放置尾部夹。将尾鳍约10毫米的尾端放置在吻合处, 为 arteriotomy 留出一些空间。
- 在动脉周围放置两条丝质领带, 只在骶管上接上, 并在每个接头上系上一个单头结, 而不收紧。
- 用弯曲的 21 G 针将颈骶管穿刺至尾部血管夹的颅骨。小心不要刺穿背部或侧面墙壁。将针插入腔内来回两次, 以确保流明清晰, 然后小心取出针头。
注: 颈动脉穿刺可通过用细钳抓住动脉膜, 轻轻抬起前壁, 而将针的尖端插入到升力点 (图 2A) 来辅助。这降低了用针击中后壁的风险。 - 用几个展开的纱布垫, 创建一个巢放置注射器用于输液。把这个纱布窝尾侧放到手术部位。
- 将24克 IV 导管放在注射器上, DMEM, 并拧紧注射器上的导管, 以防止渗漏 (注射器将在本手术后取出), 并将导管从尖端弯曲至4毫米, 以便在释放后弯曲保持在约75°。
- 将 IV 导管插入颈动脉 arteriotomy 至折弯点, 并用0.5 毫升的 DMEM 洗涤静脉移植腔两次。每次重复, 用 DMEM 填充静脉移植物。然后用戴着手套的手指轻轻按压移植物的颅骨, 将 DMEM 从嫁接中取出。小心地将手指滑向接枝尾端, 通过 arteriotomy 冲洗腔内的内容。
- 从导管中取出 DMEM 注射器, 将导管留在血管内。连接含有病毒溶液的注射器, 确保没有空气进入导管。将松散打结的丝绸领带移至动脉, 直到导管尖周围, 但不要收紧。
- 注入0.03 毫升病毒溶液, 将剩余的 DMEM 从导管中推出。用手指从静脉移植腔中取出所有液体, 从颅骨轻轻按压尾部。
- 拧紧动脉和导管尖端的两条领带以封住流明。注入病毒溶液, 直到静脉扩张。轻轻地把注射器放在纱布的巢上。
注: 重要的是, 静脉移植扩大到其前转导口径, 并保持膨胀, 在病毒注入。如果没有, 基因转移的数量将大大减少。 - 将含有病毒的溶液留在静脉移植腔内20分钟, 然后用空注射器将附在导管上的含有病毒的注射器替换。轻轻地从移植物中吸取含有病毒的溶液, 直到血管坍塌。取出注射器, 把导管留在原地。切开并解开丝缝线, 从容器中取出导管。小心地从颈动脉取出导管, 以避免损伤内皮。
- 借助手术显微镜, 用 X 型 (图 2B) 闭合 arteriotomy 7-0 聚丙烯缝合线。
- 用针头夹住缝合线, 进入 arteriotomy 右下角的容器, 然后从左下角离开容器。穿过容器外的开口, 使第二个通行证从右上至左上。
- 在收紧缝合之前, 要简单地释放颅内血管夹, 以冲洗出静脉和动脉中的空气和残余病毒。当钳被释放时, 血液会流出 arteriotomy。
- 通过轻轻拉缝合线结束 arteriotomy, 并将其与2平方结绑在一起。
注意: 拉缝线太紧会引起组织的聚束, 这会扰乱水流, 增加血栓风险, 并可能引入不受控制的变数。
- 释放颅骨血管夹, 然后尾部夹。用纱布敷用轻压止血。
- 在此期间, 注射丁丙诺啡 (平方, 0.02 毫克/千克), 以提供术后镇痛, 直到芬太尼补丁提供止痛药的芬太尼血浆水平。
注: 另外丁丙诺啡注射液 (平方, 0.02 毫克/千克) 可能是必要的6小时后第一次注射, 以保持镇痛, 直到血浆芬太尼达到治疗浓度。 - 按照步骤 4.4 5-4. 4.15, 在左侧重复病毒输液协议。
- 伤口闭合
- 使用连续模式, 用 5-0 PGA 缝合闭合皮下组织。使用一个皮模式关闭 3-0 PGA 缝合皮肤。把结埋在两端。
- 手术后的恢复、清理和护理
- 执行步骤2.4。
5. 收获手术 (终端)
- 准备仪器和手术部位。
- 遵循 2.1. 1-2. 1.3 在静脉移植手术中的步骤。
- 让助手打开和灌装在仪表桌上 (或传递给外科医生): 一个20毫升的注射器, 一个21G 针, 3-0 丝缝合, 和一个无菌血流探针。
- 按照步骤 2.1. 5-2. 1.6 和2.1.8 静脉移植手术。
- 颈总动脉与静脉移植的分离
- 烙沿胸骨切口与下颌骨之间的中线切开皮肤 (长度约为7-9 厘米), 并将兔子的颈部皮肤夹在毛巾夹上。
- 在尾端, 用烙在筋膜上进行短侧切。在整个中线的筋膜下坦率地解剖。用烙切开沿中线的解剖筋膜。
- 从右边开始。解剖的胸骨舌骨肌肉上的气管和 V 形 sternocephalic 肌肉暴露的共同颈动脉和静脉移植。
- 解剖右静脉移植和颈总动脉游离于周围组织。在解剖过程中, 使用手术硅循环对动脉和静脉移植进行回缩。
- 在步骤 5.2 3-5. 2.4 中, 重复左侧的解剖。
- 在基因转移手术中, 根据步骤 4.3. 1-4. 3.3 进行流量测量。
- 静脉移植的收获
- 与3-0 丝缝合, 结扎右颈总动脉颅内移植。然后结扎颈骶管移植。
- 将相邻的颈动脉除以结扎和相邻吻合口, 将右静脉移植术切除。取出兔静脉移植物, 用生理盐水冲洗腔内。
- 从静脉移植的两端修剪颈动脉和吻合。从静脉移植中修剪多余的血管外膜组织, 并根据需要为不同的终点分析切割移植物。
- 重复步骤 5.4. 1-5. 4.3, 收获左静脉移植。
- 注射1毫升苯妥英/戊巴比妥 IV 弄死兔。
- 根据有关生物危害和锋利废物处置的适当议定书处置任何废物。
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Representative Results
在操作员可以使用此方法生成实验数据之前, 必须验证新操作员的技术熟练程度。新的操作者必须达到的第一个里程碑是, 在初始静脉移植术和随后的延迟转导手术后, 保持静脉移植通畅。每次手术后90% 多的通畅是可取的和可实现的。可通过经皮超声评估无创通畅, 我们通常在术后5-7 天进行。在具有专利静脉的家兔中, 超声检查将显示一大血管, 在前颈部两侧有轻快的骶管血流 (图 3a)。如果任何一个静脉移植被闭塞, 将没有可检测到颅尾血流的一侧 (s) 与闭塞移植。然而, 在颈内静脉内仍会发现颅-尾血流 (图 3B)。
新的操作者必须实现的第二个里程碑是静脉移植血管内皮细胞的有效转导。在这里, 一个表达β乳糖酶的腺病毒载体用于评价内皮细胞基因转移的效率。一个新的操作员在我们的实验室转基因静脉移植与腺病毒表达β-乳糖酶 (AdnLacZ) 使用的方法描述。移植物在转导后3天收割, 切成段。部分染色有 5-溴-4-氯-3-哚-galactopyranoside (X-加仑)。腔内表面成像显示静脉移植的有效传导 (图 4A) 和不良转导 (图 4B)。为了进一步评价新的操作者的熟练程度, 转基因静脉移植物中的β-乳糖酶 mRNA 也用定量逆转录酶介导的 PCR 方法测量, 并将信号规范化到甘油磷酸盐水平。在同一静脉移植物中测定的脱氢酶 (GAPDH) mRNA。
新操作者转基因静脉移植中β-乳糖酶 mrna 的含量与静脉移植转基因的β-乳糖酶 mrna 水平没有显著差异 (图 5)。如果有经验的操作者转基因的静脉移植的 mrna 样本无法进行比较, 传感静脉移植的阴性控制静脉移植 mrna 可由非表达控制向量 (AdNull) 产生。我们发现, 有经验的操作员转基因的静脉移植中β-乳糖酶 mrna 的平均水平大约是1000倍, 高于乳糖酶 mRNA 在 AdNull 转基因移植中的背景 PCR 信号 (图 5).
图 1.右颈外静脉右颈总动脉移植与端侧吻合的位置.静脉移植 (蓝色) 缝合到颈总动脉 (红色) 在两个吻合。每次吻合时, 缝线 (白色 X) 按放置顺序编号。对于两个吻合, 缝合1缝合 arteriotomy 尾端的颈外静脉。缝合2缝合 arteriotomy 的颅骨末端到颈外静脉。缝合3被放置在吻合的侧边, 在与前两针等距的点上。缝合4被放置在吻合的内侧侧, 等距从前两针和横跨从缝合3。另外四针 (针 5-8) 放置在四现有针之间的中间。颈动脉段吻合在两端结扎3-0 丝缝合 (箭头) 和分裂 (虚线) 中间的连字。左侧移植的执行方式类似。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.颈动脉 arteriotomy 的建立和闭合.(A) 用细钳将颈总动脉膜在静脉移植附近, 并将上行牵引应用于动脉壁。这创造了一个垂直的表面, 允许弯曲的 21 G 针与血管腔体近似平行插入, 减少刺穿动脉后壁的风险。(B) arteriotomy 用7-0 聚丙烯在 X 型上缝合。第一缝合通道进入 arteriotomy 右下角的动脉腔 (1), 并在左下角出口腔 (2)。缝合然后穿过 arteriotomy。下一关将重新进入右上 (站点 3) 的流明, 并退出左上方的流明 (站点 4)。轻的牵引在缝合的末端 (末端出口从站点1和站点 4) 关闭 arteriotomy。缝合端与2平方结相连。实心蓝色圆圈表示缝合线穿透动脉壁的位置。实心蓝线指示缝线在动脉壁外的位置;虚线蓝色线表明缝合位于腔内。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.兔颈部经皮超声图像, 移植后5-7 天评价静脉移植通畅.(A) 指示在尾向颅方向血液流动的专利静脉移植 (红色) (箭头)。(B) 闭塞静脉移植。无尾血流 (将出现红色) 检测。颈内静脉 (蓝色) 与血流的颅到尾端方向被表明 (星号)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.乳糖酶转基因在静脉移植中的表达.移植后28天, 兔静脉移植术转基因20分钟的腺病毒载体, 在手术隔离静脉移植的流明内表达β-乳糖酶。静脉移植术后3天的转导和染色 5-溴-4-氯-3 哚β D-galactopyranoside。(a) 静脉段的腔内表面图像, 显示有效的转导。(B) 静脉段的腔内表面图像, 显示传导不良。刻度条 = 1.0 毫米.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 5.乳糖酶 (β-加仑) 转基因 mRNA 在静脉移植段中的表达.在兔颈动脉放置颈静脉移植术28天后, 移植物转基因的腺病毒载体表达β-乳糖酶 (AdnLacZ) 或与控制腺病毒载体不表达转基因 (AdNull).手术是由经验丰富的操作员 (外科医生 1) 或新的操作员 (外科医生 2) 完成的。静脉移植转基因与 AdnLacZ 均在转导后3天内全部收获。从移植转基因中提取的 RNA 和 AdNull, 在转导后14天进行了分析, 作为阴性对照。用定量逆转录酶介导 PCR 对β-乳糖酶 mRNA 的表达进行量化, 并对同一提取物中测定的甘油磷酸脱氢酶 mRNA 的值进行规范化, 并以任意单位 (AU) 表示。条形表示平均值;p值来自秩和测试。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本议定书的关键步骤包括麻醉的管理、抗凝、动脉/接枝静脉的手术操作以及接枝静脉的血流动力学测量。正确的麻醉管理在这一多项生存手术模型中是至关重要的, 包括两个相对较长的操作 (通常 3-3, 5 小时用于双侧静脉移植和 1.5-2.5 h 用于双边移植转导)。我们通过 nosecone 和气管插管进行麻醉, 发现插管改善了移植转导手术后的生存, 可能是因为正压通气预防肺不张和相关呼吸衰竭。家兔对插管有挑战性, 气管插管相关的创伤可能导致术后鸣。然而, 插管的挑战和并发症是一个很小的代价, 以消除大部分围手术期发病率和死亡率与静脉移植手术有关的好处。
抗凝是必不可少的, 以防止移植静脉血栓形成, 这可能发生后, 任何一个生存手术。血栓形成似乎是一个早期的事件, 因为在经皮超声检查的5-7 天内的静脉移植是专利在收获几乎总是专利。为防止第一次手术后血栓形成 (i., 静脉移植), IV. 肝素在收获第一个外颈静脉之前进行。以家兔血浆中肝素的半衰期 (1-2 小时) 为基础, 在采集对侧颈外静脉前, 再加半剂量静脉注射肝素。另外, 在单个静脉移植的两个动静脉吻合完成后, 我们用血气生理盐水将颈动脉的流明和静脉移植大约每8分钟冲洗一次。为避免移植血栓形成, 应注意不要在收获和嫁接过程中损害静脉移植, 特别是内皮细胞。这包括用手术器械温和地处理静脉, 并留下一层血管外膜脂肪组织附着在静脉。我们还管理单一剂量的局部罂粟碱到接枝颈动脉, 以防止或逆转血管痉挛, 这可能导致血栓形成。
在静脉移植手术中需要对手术技术进行细致的注意。为了避免在吻合口出血, 移植血栓, 并引入不受控制的血流动力学变量, 两个 arteriotomies 必须是适当的长度。如果 arteriotomy 太短, 静脉移植开口壁将在吻合部位多余, 造成出血的间隙。如果 arteriotomy 太长, 伸展静脉覆盖 arteriotomy 会使静脉移植壁接近接近, 使外科医生难以避免缝合对立的静脉移植墙一起 (基本上保证术后血栓)。此外, 如果静脉移植腔狭窄, 因为静脉伸展到覆盖过长的 arteriotomy, 将创建一个狭窄, 增加剪应力, 易于血栓形成33, 并有可能改变结局变量, 如新生内膜生长和血管重塑34,35。此外, 在静脉移植中应避免引入曲折, 从而导致腔内狭窄或异常流。为了帮助避免扭曲的移植, 我们总是使静脉段沿颈总动脉的腹面, 并确保没有曲折的静脉。由于变化的手术技术可能改变静脉移植的血流动力学, 因为改变的血流动力学可能会影响结果变量独立的治疗, 我们经常测量血流量和移植的直径之前的载体输液和在收割的时间。我们用这些值计算剪应力和搏动。静脉移植的血流动力学测量以外的预定范围可以排除客观的进一步分析, 减少实验变异性, 增加统计能力。
当我们开发这种方法时, 我们做了一些修改。最初, 我们尝试移植手术中的静脉移植基因转移。然而, 在这种情况下, 转基因表达几乎完全失去了3天后, 基因转移22。无论静脉段是转基因原位移植, 还是先移植静脉, 然后转基因, 转基因表达迅速丧失。只有延迟转导直到静脉移植适应了动脉循环 (我们等待到移植后28天进行基因转移, 虽然更短的延迟可能是可能的), 是快速丧失转基因表达避免22.在经历术中和术后死亡后, 我们还从 nosecone 麻醉转为气管插管麻醉进行第二次 (基因转移) 手术。此外, 在兔术后遇到明显的吸入性肺炎后, 我们开始在兔子的腹部 (不育的窗帘下) 放置一个小塑料桌。该表的位置, 以防止外科医生不小心地靠在兔子的腹部, 潜在的刺激胃食管反流和愿望。我们没有更多的期望事件后, 放置的表。然而, 由于这一位置恰好与气管插管的转变相吻合, 我们无法确定哪些干预措施是消除吸入事件的罪魁祸首。
这种方法也有局限性。在美国, 使用兔子而不是啮齿目动物, 必须遵守1966年的《实验牲畜福利法》的要求。因此, 使用兔子 (或本法所涵盖的其他动物) 的调查人员必须配备设备齐全的手术室和专家麻醉, 并提供高水平的术后监测和护理。第二个限制是需要2次手术, 以确保持续的转基因表达22。第二次手术增加了实验的成本, 使每只兔子暴露出额外的潜在手术和围手术期并发症。然而, 我们不知道任何其他基因转移方法, 实现持久的转基因表达在静脉移植。该方法的第三个局限性是, 它需要在 HDAd 载体的构建和高效 HDAd 种群的制备方面具有专门知识。许多实验室拥有第一代腺病毒、慢病毒载体和腺相关病毒 (AAV) 载体的专门知识, 但相对较少的群体有 HDAd 的经验, 通常需要建立协作以获得这种专门知识。该方法的临床适用性也可能受到限制。对于人类来说, 第二次手术会增加成本和并发症风险。此外, 与人隐静脉 (用于冠状动脉和外周搭桥手术) 相比, 兔颈外静脉有非常薄的壁。移植兔颈外静脉进入动脉循环后, 壁厚和重构可能会因静脉移植已有较厚壁而减弱。最后, 在这个模型的实验中持续长达6月, 没有一个接枝静脉发育为22的狭窄。因此, 这种方法似乎没有对导致静脉移植失败的所有生物过程建模。
最后, 该方法使用一种健壮的人血管疾病模型 (家兔) 生成接枝静脉, 转基因稳定地表达为长时间 (至少6月)22。转基因在静脉移植中的稳定表达将揭示其在正常静脉移植中的作用, 并阐明其在静脉移植基因治疗中的潜力。这种方法可以改进, 并使临床更适用于技术的发展, 允许经皮传递载体的静脉移植, 从而避免第二次手术。这些技术可能是以导管为基础的36,37, 或者他们可以结合特别准备好的载体注入到外周静脉, 然后靶向静脉移植壁, 例如由磁场38。该方法还允许测试静脉移植基因治疗 HDAd 以外的其他载体, 包括慢病毒载体和 AAV 载体以及非病毒载体。39,40,41,42
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
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