Un modelo de conejo de expresión del transgen Durable en la vena yugular a los injertos de interposición de la arteria carótida común

Este método puede responder preguntas clave sobre la patogénesis del fracaso del injerto venoso. Por ejemplo, podría identificar mediadores del fracaso del injerto y probar estrategias destinadas a prevenir el fracaso del injerto. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para lograr una expresión transgénica duradera y estable en el endotelio del injerto venoso.

Después de anestesiar a un conejo de acuerdo con el protocolo de texto, afeite al animal desde la muesca esternal hasta el borde de la mandíbula. Una vez finalizada la configuración quirúrgica, use electrocauterio para cortar la piel a lo largo de la línea media entre la muesca esternal y la mandíbula, de aproximadamente siete a nueve centímetros de longitud. A continuación, coloque pinzas para toallas para mantener abierta la incisión.

Disecciona sin rodeos debajo de la fascia a lo largo de toda la línea media. A continuación, utilice la electrocauterización para cortar la capa fascial disecada a lo largo de la línea media. A continuación, comenzando por el lado derecho, diseccione entre el músculo hioides esternal que recubre la tráquea y el músculo esternoefálico para exponer la arteria carótida común.

Luego, diseccione cuidadosamente un segmento de cuatro a cinco centímetros de la arteria carótida común y sus ramas más grandes libres de los tejidos circundantes. Use suturas de seda 5-0 para ligar las ramas más grandes de la arteria carótida común antes de cortar cada rama distal a la sutura. Después de repetir la disección en la carótida común izquierda, use pinzas de sujeción de tejido para cerrar temporalmente la capa de tejido subcutáneo.

A continuación, diseccionar la fascia superficial de la piel del lado derecho hasta exponer la vena yugular externa. Diseccionar un segmento de cuatro a cinco centímetros de la vena yugular externa y liberar sus ramas del tejido circundante. Use suturas de seda 5-0 para ligar las ramas, luego corte las ramas.

A continuación, liga la vena aislada en ambos extremos, corta el extremo craneal y enjuaga la luz con solución salina heparinizada. Para llevar a cabo el injerto venoso, utilice una pinza vascular para pinzar la arteria carótida común derecha en el extremo craneal del segmento aislado. A continuación, coloque una pinza vascular en el extremo caudal.

Ahora realice una arteriotomía caudal justo craneal a la pinza caudal de igual longitud al diámetro del extremo craneal del segmento venoso. A continuación, inserte un catéter intravenoso conectado a una jeringa de solución salina normal heparinizada a través de la arteriotomía caudal y enjuague la luz de la arteria carótida. El líquido saldrá a través de la arteriotomía.

Volviendo a la vena yugular, extirpe la vena y colóquela junto a la arteria carótica. Con puntos individuales de polipropileno 7-0 sutura el extremo caudal de la arteriotomía caudal hasta el extremo craneal del segmento venoso. A continuación, coloque una segunda sutura a 180 grados de la primera puntada para suturar el borde craneal de la arteriotomía caudal hasta el extremo craneal del segmento venoso.

Colocar un tercer punto en un punto equidistante de los dos primeros puntos en el lado lateral de la anastomosis. A continuación, coloque un cuarto punto en el lado medial de la anastomosis, equidistante de los dos primeros puntos y a través del tercer punto. Coloque cuatro puntos adicionales entre cada uno de los puntos del uno al cuatro.

Realizar la arteriotomía craneal en el lado caudal del clip distal. La distancia entre el extremo craneal de la arteriotomía craneal y el extremo caudal de la arteriotomía caudal debe ser la misma que la longitud del segmento venoso. La longitud de la arteriotomía craneal es igual al diámetro del extremo caudal del segmento venoso.

Con la vena extendida cranealmente desde la anastomosis a lo largo de la carótida, asegúrese de que la vena no esté torcida. A continuación, utilice solución salina normal heparinizada para lavar la arteria y la vena carótida a través de la arteriotomía craneal. A continuación, coloque un primer punto para suturar el extremo caudal de la arteriotomía craneal al extremo caudal del segmento venoso.

A continuación, coloque una segunda sutura a 180 grados de la primera puntada para suturar el borde craneal de la arteriotomía craneal hasta el extremo caudal del segmento venoso. Complete la anastomosis como se demostró anteriormente en el video. Suelte temporalmente la pinza craneal para permitir que el injerto de vena se llene de sangre y aplique una presión suave con una gasa seca para detener el sangrado.

Repita este paso hasta que la anastomosis ya no sangre. A continuación, retire las pinzas craneales y caudales. Use una gasa para detener cualquier sangrado adicional en las anastomosis.

Use una sutura de seda 3-0 para ligar ambos extremos del segmento de la arteria carótida común entre las anastomosis. A continuación, divida la carótida a la mitad entre las ligaduras. Se deben observar pulsaciones enérgicas en el injerto venoso.

Repita la colocación del injerto de vena en el lado izquierdo. Con una sutura PGA 5-0, cierre el tejido subcutáneo con un patrón continuo. A continuación, utiliza una sutura PGA 3-0 para cerrar la piel con un patrón intradérmico y enterrar los nudos en ambos extremos.

Realizar cuidados postoperatorios y ecografía transcutánea según el protocolo de texto. Para realizar la cirugía de transferencia de genes, aísle cuidadosamente el injerto de vena derecha, incluyendo de 1,5 a dos centímetros de la arteria carótida adyacente al injerto tanto en el lado craneal como en el caudal. Repita la disección en el lado izquierdo de la misma manera.

Use solución salina normal para llenar la cavidad de la herida quirúrgica en el lado derecho para permitir la transmisión de ondas sonoras. Conecte una sonda de flujo perivascular de dos milímetros a un medidor de flujo volumétrico y sumerja la sonda en la solución salina de la cavidad de la herida. Ajuste el caudal a cero.

Coloque la sonda de flujo alrededor de la arteria carótida, ya sea caudal o craneal al injerto de vena. A continuación, utilice un sistema electrónico de adquisición de datos para registrar los datos de la sonda de flujo. Después de inyectar heparina en el conejo a través del catéter intravenoso y enjuagarlo con solución salina, use una pinza vascular para pinzar la arteria carótida común en el extremo craneal del injerto venoso.

Y luego aplicar una segunda pinza en la carótida aproximadamente 10 milímetros caudal a la anastomosis caudal para dejar espacio para la arteriotomía. A continuación, coloque dos lazos de seda sin apretar alrededor de la arteria carótida justo caudal al injerto de vena. A continuación, con una aguja doblada de calibre 21 previamente preparada, punción de la carótida caudal al injerto y solo craneal al clip vascular caudal.

Haga avanzar la aguja en el lumen hacia adelante y hacia atrás dos veces para asegurarse de que el lumen esté claro. A continuación, retire la aguja con cuidado. Después de preparar una jeringa y un catéter intravenoso con DMEM de acuerdo con el protocolo de texto, insértelo en la arteriotomía carotídea común hasta el punto de flexión y lave la luz del injerto venoso llenándola con 0,5 mililitros de DMEM dos veces.

Retire el DMEM del injerto usando un dedo enguantado para presionar ligeramente el extremo craneal del injerto. A continuación, deslice con cuidado el dedo a lo largo del injerto hacia el extremo caudal del injerto para expulsar el contenido luminal a través de la arteriotomía. Retire la jeringa DMEM del catéter, dejando el catéter en el vaso.

Conecte la jeringa que contiene la solución antivirus, asegurándose de que no entre aire en el catéter. Mueva las ataduras de seda anudadas sin apretar por la arteria hasta que estén alrededor de la punta del catéter, pero no las apriete. Infunda 0,03 mililitros de solución antivirus, para expulsar el DMEM restante del catéter.

Luego, con un dedo, extraiga todo el líquido de la luz del injerto venoso presionando suavemente desde el cráneo hasta la caudal. Apriete los dos lazos alrededor de la arteria y la punta del catéter para sellar el lumen. A continuación, infundir la solución viral hasta que la vena se distienda.

Coloque suavemente la jeringa sobre un nido de gasa. Después de 20 minutos, use una jeringa vacía para aspirar suavemente la solución que contiene virus del injerto hasta que el vaso colapse. Retire la jeringa dejando el catéter en su lugar.

A continuación, corte y desate las suturas de seda y retire el catéter del vaso. Ahora use la sutura de polipropileno 7-0 en un patrón de X para cerrar la arteriotomía. A continuación, tire suavemente de los extremos de la sutura y átelos con dos nudos cuadrados.

Después de restaurar el flujo sanguíneo en el injerto de la vena derecha como se describe en el protocolo de texto, repita la infusión del virus en el lado izquierdo. Para recolectar los injertos transducidos, diseccione los injertos de venas libres y las arterias carótidas comunes y realice mediciones de flujo tanto en el lado izquierdo como en el derecho, como se demostró anteriormente. Utilice la sutura de seda 3-0 para ligar el cráneo de la arteria carótida común derecha al injerto.

A continuación, utilice una sutura de seda 3-0 para ligar la caudal carotídea al injerto. Extirpar el injerto de vena derecha dividiendo la arteria carótida adyacente entre cada una de las ligaduras y la anastomosis adyacente. Luego, retire el injerto de vena del conejo y use solución salina para enjuagar el lumen.

El primer hito que debe lograr un nuevo operador es la permeabilidad constante del injerto venoso después de la cirugía inicial de injerto venoso y la posterior cirugía de transducción diferida. Cuando un injerto de vena es patentado, el examen de ultrasonido revelará un vaso sanguíneo grande con un flujo sanguíneo caudal a craneal enérgico. Los injertos se cosecharon tres días después de la transducción, se cortaron en secciones y se tiñeron con X-gal.

Las imágenes faciales de las superficies luminales mostraron injertos venosos con una transducción eficiente y una transducción deficiente. Como se muestra en este gráfico, los niveles de ARNm de beta galactosidasa en los injertos venosos transducidos por el nuevo operador no fueron significativamente diferentes de los niveles de ARNm de beta galactosidasa en los injertos venosos transducidos por un operador experimentado. Al realizar este protocolo, es importante recordar invertir el injerto venoso de cráneo a caudal antes de contraer la anastomosis.

Esto es necesario para evitar la obstrucción del flujo sanguíneo por el bolo venoso. Una vez dominadas, estas cirugías se pueden completar en aproximadamente tres horas para el procedimiento de injerto de vena, dos horas para el procedimiento de transferencia de genes de injerto de vena y 45 minutos para el procedimiento de cosecha. No olvide que debido a que este protocolo requiere trabajar con vectores virales y objetos punzantes, se deben seguir los procedimientos adecuados de bioseguridad y objetos punzantes.