Summary
Une méthode est indiquée ici, pour la préparation de la matrice extracellulaire de langue (TEM) avec DÉCELLULARISATION efficace. Le TEM peut servir d’échafaudages fonctionnelles pour la reconstruction d’un modèle de carcinome épidermoïde (TSCC) langue maternelle dans des conditions de culture statique ou agité.
Abstract
Afin de construire un modèle efficace et réaliste pour langue épidermoïde carcinome (TSCC) in vitro, les méthodes ont été créés pour produire DECELLULARISE langue matrice extracellulaire (TEM) qui prévoit les échafaudages fonctionnelles TSCC construction. TEM prévoit une niche in vitro la croissance cellulaire, la différenciation et la migration cellulaire. Les microstructures de native matrice extracellulaire (ECM) et des compositions biochimiques conservées dans la matrice DECELLULARISE fournissent des créneaux spécifiques des tissus pour l’ancrage des cellules. La fabrication du TEM peut être réalisée par digestion désoxyribonucléase (DNase) accompagnée d’un graves de prétraitement organique ou inorganique. Ce protocole est facile à utiliser et assure un rendement élevé pour la DÉCELLULARISATION. Le TEM a montré favorable cytocompatibility pour cellules TSCC dans des conditions de culture statique ou agité, qui permet la construction du modèle TSCC. Un self-made bioréacteur a également été utilisé pour la condition remuée persistante pour la culture cellulaire. TSCC reconstituée à l’aide de TEM a montré les caractéristiques et les propriétés ressemblant à l’histopathologie TSCC clinique, ce qui suggère le potentiel en recherche TSCC.
Introduction
La langue a diverses fonctions importantes, comme la déglutition, articulation et dégustation. Ainsi, l’altération de la fonction de la langue a grand impact sur la qualité de vie de patients'1. La malignité plus courante dans la cavité buccale est langue carcinome spinocellulaire (TSCC), qui survient généralement chez les personnes qui boivent de l’alcool ou fument du tabac2.
Ces dernières années, petits progrès ont été accomplis dans la recherche fondamentale sur le TSCC. Le manque de recherche efficace in vitro des modèles reste un des plus grands problèmes. Ainsi, la matrice extracellulaire (ECM) s’avère pour être une solution potentielle. ECM étant une trame réseau complexe composée de constituants de la matrice hautement organisée, échafaudage matières ayant un ECM-comme la structure et la composition seraient compétentes pour la recherche sur le cancer. ECM DECELLULARISE peut parfaitement fournir la niche pour les cellules de la même origine in vitro, qui s’avère pour être le plus important avantage d’ECM.
ECM peut être gardé avec les composants cellulaires étant retirés les tissus par le biais de la DÉCELLULARISATION à l’aide de détergents et enzymes. Divers composants de l’ECM, notamment de collagène, fibronectine et laminine dans la matrice DECELLULARISE prévoient un micro-environnement natif-tissu-comme des cellules, favorisant la survie, la prolifération et la différenciation des cellules3. En outre, l’immunogénicité destinés à la transplantation peut être réduite à un niveau minimal avec l’absence des composantes cellulaires dans l’ECM.
Jusqu'à présent, les méthodes de fabrication chez ECM DECELLULARISE ont été essayées dans différents tissus et organes, tels que le coeur4,5,6,7, foie8,9,10 ,11, poumon12,13,14,15,16,17et rein18,19 , 20. Toutefois, aucune recherche pertinente n’a se trouve sur un travail semblable dans la langue au meilleur de nos connaissances.
Dans cette étude, matrice extracellulaire DECELLULARISE langue (TEM) a été fabriquée tant efficacement et à moindre coût par une série de traitement physique, chimique et enzymatique. Puis le TEM servait à récapituler TSCC in vitro, montrant une simulation appropriée pour TSCC comportement et le développement. TEM a bonne biocompatibilité, mais aussi la capacité de guider les cellules à la niche tissu-spécifique, ce qui indique que TEM mai ont un grand potentiel dans le TSCC recherche3. Le protocole présenté ici offre un choix pour les chercheurs qui étudient sur la pathogénie ou thérapies cliniques du TSCC.
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Protocol
Tous les travaux d’animaux a été effectuée conformément à la Loi sur le bien-être animal, lignes directrices et approuvé par animalier institutionnel et le Comité de l’urbanisme, de l’Université Sun Yat-sen.
1. préparation du TEM
- Exécuter des souris par dislocation cervicale et retirer les languettes à l’aide de la pince à épiler et des ciseaux chirurgicaux stériles.
- Plonger les languettes dans l’éthanol à 75 % pendant 3 min, puis mettre chaque langue dans un 1,5 mL tube Eppendorf (EP) avec 1 mL de phosphate stérile 10 mM mis en mémoire tampon solution (PBS).
Remarque : La concentration de PBS dans toutes les étapes suivantes est identique à la concentration dans cette étape. - Lyse de la cellule de congélation décongélation : geler les languettes dans les tubes EP à-80 ° C pendant 1 h et ensuite décongeler les languettes à température ambiante pendant 45 min pour 3 cycles.
- Chargez chaque langue sur un morceau de suture chirurgicale à l’aide d’une aiguille chirurgicale et enrouler l’extrémité de la suture avec un petit morceau de papier d’aluminium stérile. Effectuer l’opération dans une boîte de Petri 3,5 cm ou 6 cm contenant 75 % d’éthanol dans des conditions stériles.
Remarque : La durée de chaque morceau de suture chirurgicale adéquate est d’environ 20 cm et la taille appropriée de chaque morceau de papier d’aluminium est d’environ 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). La langue doit être chargée près de la feuille d’étain. - Rincer avec 3 mL de PBS stérile, chaque langue dans une boîte de Petri 3,5 cm ou 6 cm pendant 30 s. effectuer cette opération dans des conditions stériles.
- Laver la langue avec de l’eau ultrapure : ajoutez ampicilin dans un flacon de large-bouche avec 250 mL d’eau ultrapure stérile à une concentration finale de 90 µg/mL. Mettre les langues dans le flacon contenant une barre de remuer. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
NOTE : Jusqu'à 5 langues peuvent être mis dans la même bouteille en contrepartie de l’enroulement du fil de suture. La feuille d’étain est à la fin de la suture dans la bouteille pour empêcher la langue de glisser. Les langues doivent être placés à 2 centimètres du fond de la bouteille en ajustant la longueur de la suture restant à l’intérieur de la bouteille. Cette note est également pour obtenir la procédure 1.8, 1.10, 1.12 et 1,16. - Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 12 h.
- Laver les languettes avec NaCl : ajoutez ampicilin dans une bouteille de large-bouche avec 250 mL de stérile 1 M NaCl à une concentration finale de 90 µg/mL. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
- Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
- Cell lyse par Triton X-100 : Ajouter ampicilin à une concentration finale de 90 µg/mL dans un flacon à large ouverture avec 250 mL de stérile 2 % Triton X-100 dans du PBS. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
- Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 48 h.
- Laver la langue avec CaCl2/MgCl2: Ajouter ampicilin dans un flacon de large-bouche avec 250 mL de stérile 5 mM CaCl2/MgCl2 à une concentration finale de 90 µg/mL. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
- Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
- Digestion par la DNase : ajouter 1 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS) dans chaque tube de EP. Ajouter DNase dans HBSS respectivement à une concentration finale de 300 µM. remuer chaque langue dans chaque tube de EP, avec une partie de la suture à l’extérieur du tube. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
Remarque : Assurez-vous que la partie de la suture qui reste à l’intérieur des bouteilles dans les étapes précédentes reste également à l’intérieur du tube pour pé dans cette étape et s’assurer que la partie de la suture qui reste à l’extérieur des bouteilles dans les étapes précédentes reste également à l’extérieur du tube pour pé dans cette étape. - Incuber les languettes en EP tubes à 37 ° C pendant 24 h.
- Laver la langue avec du PBS : ajoutez ampicilin dans un flacon de large-bouche avec 250 mL de PBS stérile à une concentration finale de 90 µg/mL. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
- Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
- Conserver le TEM préparé dans du PBS stérile à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. en trois dimensions (3D) Reconstitution du TSCC
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Construction du modèle TSCC statique
- Semences 1,0 x 106 TSCC monocellules (Cal27) dans une boîte de Petri de 3,5 cm. Ajouter 3 mL de Dulbecco modifiée d’aigle moyen/F12 (DF12) contenant 10 % bovin sérum fœtal (SVF), ampicilin de 90 µg/mL et 90 µg/mL kanamycine.
- La culture des cellules Cal27 à 37 ° C pendant 2 à 3 jours. Assurez-vous que les cellules portent sur au moins 60 % zone du fond plat.
- Chargez TEM à la monocouche Cal27 dans la boîte de Pétri.
- Mettre le plat dans un incubateur à CO2 à 37 ° C pendant 28 jours.
- Actualiser le milieu de culture tous les jours pendant le processus de culture cellulaire. La concentration de CO2 dans l’incubateur est de 5 %.
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Construction de modèle TSCC brassée
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Préparation d’un self-made minibioreactor brassé
- Retirez le piston d’une seringue de 10 mL.
- Creusez un trou (diamètre de 1 cm) près de la borne inférieure de la tige et charger un bar sauté dans le trou.
- Creusez un trou (diamètre de 0,5 cm) au centre de la capsule d’une bouteille en plastique de large-bouche et mettre la tige de piston par la PAC.
- Couper la moitié d’un tube à centrifuger 50 mL et souder sur le côté extérieur du bouchon de la bouteille.
- Fixer des hameçons à la tige en encapsulant la tige avec des lignes de pêche qui sont liés à l’hameçons.
NOTE : Jusqu'à 4 hameçons peuvent être fixés à une tige. - Autoclave le self-made complexe avant utilisation.
Remarque : Ne pas stériliser la bouteille en plastique de large-bouche. Utilisez un nouveau flacon stérile de large-bouche en plastique tout en cultivant les cellules.
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Préparation d’un self-made minibioreactor brassé
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Culture cellulaire dynamique
- Semences 1,0 x 106 Cal27 cellules individuelles dans le self-made minibioreactor. Ajouter 150 mL de milieu de DF12 qui contient 10 % FBS, 90 µg/mL ampicilin et kanamycine 90 µg/mL.
- Chargez TEM à le minibioreactor à l’aide de l’hameçons fixés à la tige.
- Serrer le bouchon de la bouteille et mettre le minibioreactor sur un agitateur magnétique. Activer le minibioreactor à 200 tr/min dans un incubateur à CO2 à 37 ° C pendant 7 à 14 jours.
Remarque : La concentration de CO2 dans un incubateur à CO2 est de 5 %.
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Representative Results
Ce protocole pour la préparation du TEM s’avère pour être efficace et approprié. Le TEM a montré parfaite DÉCELLULARISATION comparée aux tissus de la langue maternelle. L’efficacité de DÉCELLULARISATION a été confirmée par l’hématoxyline-éosine (HE) coloration (Figure 1A-B). Coloration des résultats qu’il a révélé une disparition complète de la coloration des noyaux en TEM (Figure 1B). En outre, quantification contenue ADN de travaux antérieurs ont montré que l’ADN a été presque complètement retiré de TEM3. Ce protocole a également montré des rares dommages causés à l’intégrité des tissus tout en supprimant les composants cellulaires (Figure 1B).
Reconstitution 3D du TSCC à l’aide de TEM et un self-made minibioreactor (Figure 2A-B) a obtenu des résultats satisfaisants. Il a une coloration a montré que les cellules Cal27 dans le TEM présenté TSCC pathologiques caractéristiques (Figure 2-C-D). Les cellules dans des conditions de culture agité présenté single-cell migration (Figure 2C) ou migration collective (Figure 2-D) dans les zones de lésions différentes. Dans des conditions de culture statique, Cal27 cellules a également forment des structures envahissantes dans le TEM, mais il a fallu plus de temps (Figure 2E). En outre, une lignée de cellules humaines ostéosarcome U2OS a également été introduite au même système de culture brassé. Bien que les cellules U2OS puissent survivre dans le milieu de culture, ils sont introuvables dans le TEM (Figure 2F). Le TEM a montré biocompatibilité différente pour différents types de cellules cancéreuses, ce qui suggère que les cellules tumorales différentes peuvent avoir besoin de microenvironnements différents de s’épanouir.
Figure 1 : Préparation du TEM. (A) HE la coloration des langues maternelles des souris. Echelle = 100 µm. (B) HE coloration de TEM DECELLULARISE de souris. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Reconstitution du TSCC par TEM. (A) l’aperçu d’un self-made minibioreactor. (B) l’affichage de la position de TEM-chargement d’un self-made minibioreactor. (C) HE coloration de 14 jours brassé TSCC cultivée avec TEM. Phénomènes d’invasion unicellulaires sont indiquées par des flèches noires. Echelle = 50 µm. (D), il a la coloration des 14 jours brassé TSCC cultivée avec TEM. Phénomènes d’invasion collective sont indiquées par des flèches noires. Echelle = 50 µm. (E), il a la coloration des 28 jours statique cultivées TSCC avec TEM. Phénomènes d’invasion unicellulaires sont indiquées par des flèches noires. Echelle = 100 µm. (F) HE coloration des 14 jours brassé U2OS cellules cultivées avec TEM. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un protocole bien établi pour la fabrication de ECM DECELLULARISE devrait conserver la composition ECM native tout en supprimant les composants cellulaires dans les tissus presque complètement21. Malgré les protocoles actuellement déclarés DÉCELLULARISATION nécessitant une perfusion par le système vasculaire pour enlever les matériaux alvéolaires par transport convectif, agitation mécanique a été adoptée ici, connu comme une méthode simple et bon marché traditionnelle22 , 23 , 24 , 25 , 26. en outre, puisque la langue est riche en lingualis et a quelques vaisseaux vasculaires volumineuses, ce protocole est plus adapté aux tissus de la langue que les autres protocoles décrits ci-dessus.
En outre, ce protocole pour la production de TEM réalise une DÉCELLULARISATION résistance modérée appropriée, en évitant la destruction ou la dissolution de la membrane de base qui peut être causée par la forte DÉCELLULARISATION tels que sodium dodecyl sulfate) Traitement de SDS)3. En outre, le protocole aussi travaillé efficacement dans la langue du rat et le cochon (données non présentées), ce qui suggère que la méthode pourrait être utilisée couramment à langues de diverses espèces3.
Il est à noter qu’il existe certaines étapes critiques ou les détails dans ce protocole, qui pourraient directement influencer les résultats. Une étape importante est la digestion des cellules de la langue par la DNase. Si le temps de digestion n’est pas assez, ou ne fonctionne pas efficacement la DNase, serait difficilement atteint la DÉCELLULARISATION de la langue. Une autre chose qui doit être remarquée, c’est que la vitesse de rotation pour le bioréacteur ne devrait pas être trop rapide, étant donné les dommages subis par TEM. En outre, un environnement stérile pour cette opération est très important dans le protocole.
Malgré les règles strictes qui précède, le protocole pour la préparation de TEM peut être ajusté dans une certaine mesure. Laver la langue avec l’eau ultrapure ou PBS pendant quelques heures de plus que le temps qui le protocole suggère n’affecterait pas évidemment la fabrication du TEM. Toutefois, étant donné que le protocole doit presque une semaine pour préparer le TEM, il ne peut satisfaire des revendications immédiates pour TEM.
Le TEM montre de grande valeur dans le modélisme TSCC. Ainsi qu’un self-made minibioreactor, suspension Cal27 cellules peuvent s’attachent dans TEM et forme similaire structure infiltrante ressemblant à des humains TSCC histopathologie3. Cela pourrait être un modèle idéal pour la surveillance et l’enquête sur l’invasion et la métastase de TSCC in vitro. Le modèle pourrait aussi profiter des travaux sur des tests de drogue sur TSCC. Compte tenu de tout cela, le protocole présenté ici peut ont un grand potentiel en recherche TSCC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent l’appui des subventions de recherche de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31371390), le programme du projet de développement High-Tech État (2014AA020702) et le programme des sciences de Guangdong et de la technologie (2016B030231001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57-BL/6J mice | Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center | ||
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-2.5L | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218 | |
| Potassium chloride | Sangon Biotech | A100395 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BE14-GR-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sangon Biotech | A501211 | |
| 1.5 mL EP tube | Axygen | MCT-150-A | |
| Ultra-low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 3.5 cm cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| 6 cm cell culture dish | Greiner | 628160 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | V900502 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 449164 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Magnesium sulphate | Sangon Biotech | A601988 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| Surgical suture | Shanghai Jinhuan | ||
| 250 mL wide-mouth bottle | SHUNIU | 1407 | |
| Magnetic stirrer | AS ONE | 1-4602-32 | |
| CO2 incubator | SHEL LAB | SCO5A | |
| 10 mL syringe | Hunan Pingan | ||
| 50 mL centrifuge tube | Greiner | 227270 | |
| Cal27 cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Tongue squamous cell carcinoma cell line | |
| U2OS cell | Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank | Human osteosarcoma cell line | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Hepes free acid | BBI | A600264 | |
| FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| 4 °C fridge | Haier | ||
| Water purifier | ELGA | ||
| Hemocytometer | BLAU | 717805 |
References
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