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Animal doméstico proyección de imagen de neuroinflamación usando [11C] DPA-713 en un modelo murino de ictus isquémico

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DOI:

10.3791/57243

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14 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

En este artículo

Resumen

Proyección de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET) de translocador proteína 18 kDa (TSPO) proporciona un medio no invasivo para visualizar el dinámico papel de la neuroinflamación en el desarrollo y progresión de enfermedades del cerebro. Este protocolo describe autorradiografía TSPO-PET y ex vivo para la detección de neuroinflamación en un modelo murino de accidente cerebrovascular isquémico.

Resumen

Neuroinflamación es central en la cascada patológica después de accidente cerebrovascular isquémico. Métodos de proyección de imagen moleculares no invasivos tienen el potencial para proporcionar penetraciones importantes en la dinámica temporal y el papel de ciertas interacciones del neuroimmune en tiempos. Específicamente, la proyección de imagen de tomografía por emisión de positrones (PET) de translocador proteína 18 kDa (TSPO), un marcador de microglia activada y las células de linaje mieloide periféricas, proporciona un medio para detectar y rastrear neuroinflamación en vivo. Aquí, presentamos un método para cuantificar con precisión la neuroinflamación usando [11C]N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamide ([11C] DPA-713), una prometedora segunda generación TSPO-PET radiotrazador, oclusión distal de la arteria cerebral media (dMCAO) en comparación con ratones sham-funcionado. MRI fue realizado 2 días post-dMCAO cirugía para confirmar el movimiento y definir la localización del infarto y el volumen. La proyección de imagen PET/computado Tomography (CT) se realizó en 6 días post-dMCAO para captar el máximo aumento TSPO después de accidente cerebrovascular. Cuantificación de las imágenes PET se realizó para evaluar la captación de [11C] DPA-713 en el cerebro y bazo de ratones dMCAO y simulada para evaluar los niveles centrales y periféricos de la inflamación. En vivo [11C] Absorción cerebral DPA 713 fue confirmada usando ex vivo autorradiografía.

Introducción

Movimiento es la quinta causa de muerte y una causa importante de discapacidad en los Estados Unidos1. Ictus isquémico representa una abrumadora mayoría de estos casos (~ 87%), que ocurre cuando hay interrupción localizada en el flujo sanguíneo al cerebro (por ejemplo, por un coágulo de sangre o depósito graso). Posteriormente se reducen los suministros de oxígeno y nutrientes a las zonas afectadas y se inicia una compleja cascada patológica resultante en la muerte neuronal dentro del núcleo de accidente cerebrovascular (infarto) además de las áreas circundantes. Neuroinflamación es un componente crucial en el camino que conduce a este daño, con ambas células inmunes del cerebro residente (microglia) e infiltración de células inmunes periféricas (neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B y monocitos/macrófagos) pensado para contribuir a este destructiva de la cascada2,3. Macrófagos y microglia activado son centrales a esta respuesta capensis, con reportes de efectos deletéreos y beneficiosos tras Ictus isquémico2. Por lo tanto, es imperativo evaluar la contribución en vivo de estas células después de la carrera.

El PET es una poderoso 3-dimensional molecular técnica de imagen que permite la visualización de los biológico procesos en vivo mediante el uso de moléculas específicas con positrones (β +) emisión de radionucleidos como 11C, 13N, 15O y 18f el. Este método tiene muchas ventajas sobre los métodos ex vivo (p. ej., inmunohistoquímica) ya que permite la adquisición de información molecular en tiempo real, en vivo temas intactos y permite la investigación longitudinal. Animal doméstico proyección de imagen de TSPO, un marcador de microglia activada y las células de linaje mieloide periféricas, proporciona un medio para cuantificar y seguir las respuestas inmune innata de la célula dentro del cuerpo y puede ser utilizado para evaluar la inflamación después de movimiento y respuesta a la terapéutica intervenciones. TSPO, anteriormente conocido como el receptor periférico de tipo benzodiazepina, es una proteína de 18 kDa que se cree que desempeñan un papel en el transporte de colesterol y la síntesis de neuroesteroides4. Por otra parte, la evidencia sugiere que la TSPO participa en neuroinflamación y la supervivencia neuronal5,6, con informes de aumento de la expresión en muchos trastornos neurológicos que implican inflamación incluyendo carrera7, 8de demencia, la enfermedad de Parkinson9 y esclerosis múltiple10. TSPO se encuentra en las membranas mitocondriales externas y se expresa altamente en la periferia, especialmente en los tejidos asociados esteroides (e.g., glándulas) y con niveles intermedios en el corazón, los riñones y los pulmones10. Sin embargo en el cerebro saludable, TSPO niveles son bajo y restringido principalmente a glia6,11. A lesión neuronal, como el observado en movimiento, los niveles de TSPO en sistema nervioso central (SNC) aumentan considerablemente. Esta regulación al alza observada de TSPO puede explotarse a imagen neuroinflamación en vivo, con niveles de expresión proporcionando un indicador preciso de la severidad de la inflamación. Por lo tanto, el objetivo de este método es cuantificar con precisión el aporteen vivo de neuroinflamación en un modelo murino de ictus isquémico con la TSPO-PET.

Se han desarrollado múltiples trazadores TSPO para la proyección de imagen del animal doméstico de neuroinflamación. Aquí, la proyección de imagen de TSPO-PET se describe usando [11C] DPA 71312, una prometedora segunda generación tracer TSPO, que ha demostrado mayor señal a ruido y menor fijación no específica de los históricamente más usados [11C] PK11195 13 . Por ejemplo, el modelo de ratón de dMCAO de carrera fue elegido para este método14. Este modelo implica craneotomía temporal y la permanente ligadura de la arteria cerebral media distal, resultando en isquemia focal de la corteza somatosensorial. Esto es una ventaja en investigación pre-clínica cerebrovascular debido la alta reproducibilidad de daño isquémico y baja mortalidad asociada a este modelo. Hasta la fecha, estudios imagenológicos TSPO-PET todavía tienen que ser registrados en el modelo de roedores dMCAO. Sin embargo, animal doméstico proyección de imagen estudios previos utilizando el modelo de oclusión (MCAO) de la arteria cerebral media, un modelo de movimiento más intenso y variable, en ratones y ratas, han reportado expresión TSPO para incrementar del día 3 y pico por día 7 posterior al accidente cerebrovascular15, 16,17,18. Por lo tanto, se realizó un PET 6 días post-dMCAO la proyección de imagen para que coincidan con la expresión elevada de TSPO. [11C] DPA-713 la absorción en el cerebro se evaluó en ipsolateral (infartado) y hemisferios contralaterales. TSPO-PET se combinó con resonancia magnética estructural, permitiendo la delimitación precisa de infarto y contralaterales regiones de interés (ROIs). Aquí describimos basada en un atlas y un enfoque ROI basada en MRI para calcular la absorción de DPA 713 [11C]. También se evaluó la captación del radiotrazador en bazo para investigar los niveles periféricos de inflamación entre los grupos. Este método tiene el potencial para proporcionar penetraciones importantes en la dinámica espacio-temporal y el papel de las interacciones específicas neuroimmune en accidente cerebrovascular y otras enfermedades neurológicas.

Protocolo

Todos los estudios animales se llevaron a cabo según el Panel administrativo en laboratorio Animal Care (APLAC) en la Universidad de Stanford, un programa acreditado por la Asociación para la evaluación y la acreditación de laboratorio Animal Care. Antes de este procedimiento, ratones hembra de tres meses C57BL/6 intervenidos dMCAO siguiendo el procedimiento estándar y condiciones estériles14.

1. estructural MRI (2 días Post-dMCAO cirugía)

  1. Abra el software operativo (véase Tabla de materiales) y la adquisición mediante la creación de un nuevo examen. Seleccione el localizador y las secuencias de T2 de turborare en el explorador de paleta y arrastre en la ventana de examen.
  2. Asegurar las vías respiratorias y sondas para la cama de ratón usando cinta suave de calor y coloque una tira absorbente protector acolchado tanto para crear un ambiente estéril.
  3. Instale un calentador de aire a la cama de animales y encender el ventilador para que el aire caliente está en y manteniendo el ratón calentado. Utilizar un sistema automatizado de monitoreo para garantizar la temperatura corporal y tasa de respiración se mantienen en niveles adecuados para la duración de la exploración.
  4. Anestesiar el ratón en una cámara de inducción usando 3% isoflurano mantener inicialmente, luego 1-2% (2 L/min, 100% O2). Asegurar que una almohadilla de calor se enciende en la cámara de inducción para calentarse el ratón durante la inducción. Una vez anestesiados, aplique lubricante ocular al ratón para evitar la sequedad y la formación de úlceras en la córnea.
    1. Encienda el sistema de anestesia (Isoflurane el 1-2%, 2 L/min 100% O2) conectado al escáner MRI y traslado del animal a la cama de ratón.
    2. Posición del ratón cabeza propensos a en la barra de mordedura y fijar la oreja barras en su lugar, asegurándose de que no sobresalgan fuera el diámetro de la cama.
    3. Deslice la bobina de RF en la cabeza de ratón y presione la bobina y la cama en el agujero, colocar específicamente para isocentro.
    4. Adquirir el localizador para ver la posición del ratón en todas las 3 dimensiones y utilizar esta imagen para definir el volumen de turborare T2 (TE: 33 ms, TR: 2.500 ms, 2 medias, 17 rebanadas, 0.083 x 0.92 mm de resolución, tiempo total de 2 min 40 seg) adquisición. resultados de la cirugía de dMCAO en un infarto en la corteza somatosensorial14; por lo tanto, asegúrese de que esta región está cubierta en la imagen de T2-weighted.
    5. Eliminar los ratones desde el escáner y recuperar los ratones en una cámara climatizada.

2. PET/CT calibraciones y configuración del flujo de trabajo (cirugía de 6 días Post-dMCAO)

  1. Crear un flujo de imágenes en el software de escáner de funcionamiento que incluyen adquisición de atenuación de CT, 60 minutos C-11 dinámica PET adquisición (350-650 keV nivel discriminación, 3.438 ns coincidencia window), histograma (20 frames: 5 x 15 seg, min 4 x 1, 11 x 5 min, con tiempo muerto de corrección) y una reconstrucción 3DOSEM-OP (2 iteraciones, 18 subconjuntos) crear 128 x 128 x 159 imágenes con 0.776 x 0.776 x 0,96 m m tamaño de vóxel.
  2. Realizar el acondicionamiento mediante el panel de calibración TC ubicado en la esquina superior izquierda de la interfaz de fuente de rayos x. Esta calibración debe realizarse semanalmente o antes de la exploración si el sistema no se ha utilizado en la última 48 h.
  3. Realizar oscuro/luz (D/L) y el desplazamiento del centro (C/O) calibraciones.
    1. Botón de calibración de la prensa del CT (X) en la parte superior izquierda de la interfaz.
    2. Seleccione D/L C/O el archivo de la CT que va a correr, saque la cama el pórtico y ejecutar la calibración de D/L.
    3. Colocar la cama de la herramienta de calibración en el escáner y ejecutar la calibración de C/O, asegurándose de que cambiar la selección de la interfaz a la "herramienta de calibración" en lugar de "paleta 70 mm".
  4. Retire la herramienta de calibración y vuelva la cama del animal doméstico, asegurándose de que cambiar la selección de la interfaz "paleta 70 mm".
  5. Asegurar una cama imagen de ratón de 4 en la plataforma del escáner con cinta y acople el tubo de anestesia (figura 1A). Asegúrese de que isoflurano no está fluyendo a través de los tubos y que hay torceduras.
  6. Empuje la cama hacia adelante por lo que es en el centro del campo de visión (FOV), cierre la puerta de CT y obtener una vista de scout de la CT para que la cama esté en posición correcta.
  7. Realizar una "estándar" calibración del escáner PET/CT con un fantasma manufacturado interno que contienen una dosis conocida de C-11 solución como una fuente de radiación.
    1. Preparar una jeringa de 20 mL con la dosis de trazador equivalente a que a un ratón (~ 250-350 μCi/9 - 13 MBq de trazador C-11 diluido en solución salina).
    2. Registrar la actividad en el estándar usando un calibrador de dosis y tenga en cuenta el tiempo de medición.
    3. Realizar una exploración de PET/CT de la norma utilizando los mismos parámetros exactos que se utilizarán para ratones de imagen (como se describe anteriormente). Hacer esta semana para crear un factor de corrección para el escáner PET aplicar a los datos de imágenes.

3. espacio de trabajo configuración de la proyección de imagen PET/CT

  1. Crear un ambiente estéril utilizando un desinfectante viricida (véase Tabla de materiales) y colocar el acolchado absorbente protector en todas las superficies.
  2. Aseguran tanques de isoflurano y el oxígeno se llenan adecuadamente.
  3. Preparar cola vena catéteres llenando una jeringa de 1 mL (cabida con una punta de agujas 27,5 G) de cloruro de sodio 0,9% (solución salina estéril) y lavado a través de un 27,5 G, catéter de mariposa de 24 cm. Cortar las alas del catéter antes de canular para asegurarse de que no bloqueen la vista de la vena de la cola y poder con la facilidad de mover el ratón en el escáner sin desplazar el catéter.
  4. Asegurar que todo el equipo esencial se presenta en la estación de trabajo incluyendo repuestas jeringas "ras" (llenadas de solución salina estéril), lubricante de ojos, hisopos de etanol, lámparas de calor, preparado catéteres (previamente llenados con solución salina), pegamento de tejido, esparadrapo, jeringas de dosis de 0,5 mL, tijeras y un encendedor para sellar el catéter después de la exitosa colocación en la vena de la cola (figura 1B).

4. animal preparación y canulación

  1. Pesar ratones para determinar el volumen máximo permitido que se inyecta en cada ratón (es decir, volumen de trazador y cualquier solución salina debe administrada no supere el 10% del peso corporal).
  2. Anestesiar ratones en una cámara de inducción usando 3% isoflurano y se mantiene a 1-2% (2 L/min 100% O2).
  3. Aplique lubricante ocular a cada ratón y confirmar la anestesia vía reflejo pedal (pellizco del dedo del pie). Ajustar los niveles de anestesia si es necesario.
  4. Coloque el ratón sobre una cama climatizada equipada con un cono de nariz para isoflurano en 1-2% (2 L/min 100% O2).
  5. Mientras el ratón está anestesiado, realizar la canulación de la vena de la cola utilizando el siguiente protocolo:
    1. Coloque el ratón sobre su costado para exponer una de las venas laterales, mientras la cabeza permanece en el cono de nariz.
    2. Caliente la cola utilizando una lámpara de calor, teniendo cuidado de no sobrecalentarse o quemarse la cola y limpiar con un paño con alcohol para dilatar la vena y para esterilizar el sitio de inyección.
    3. Sujete la aguja con el bisel hacia arriba y alinéelo con la vena en un ángulo agudo.
    4. Suavemente aplique presión para punzar la piel y nivelar la aguja por lo que es conforme a la vena.
    5. Suavemente empuje hacia adelante unos milímetros más allá del bisel para que la aguja entra en la vena.
    6. Confirmar que el catéter está en administrar una descarga pequeña (10-20 μl) de solución salina. La solución salina debe dejar la jeringa suavemente y la vena se debe borrar. Si se observa cualquier presión de resistencia o en la espalda, es probable que el catéter no está en la vena y vuelva a intentar la canulación es recomendable. Si se observa la coagulación, uso de heparina (heparina de 1,000 unidades por solución salina mL) para instalación de la canalización y el lavado.
      Nota: Hemos valorado la canulación con y sin heparina en la cepa de ratón de interés, y puesto que no se observó la coagulación, solo solución salina fue utilizada para cánulas.
    7. Asegure el catéter a la cola utilizando una pequeña gota de pegamento de tejidos, seguido de cinta quirúrgica, para asegurar que el catéter permanece inmóvil al transferir a los ratones con el escáner.
    8. Retire la jeringa al ras del extremo del catéter y sellar el extremo con el alumbrador, el investigador no es cerca de cualquier isoflurano o etanol.
    9. Repita para los 3 ratones adicionales para que todos los ratones de 4 que se analizarán son canulados y preparados.
  6. Encender el flujo de anestesia (2,5% isoflurano, 2 L/minuto 100% O2) conectado con el PET/CT y cuidadosamente posición los ratones propensos en el cristal del escáner, asegurando los catéteres permanecen en el lugar y la cabeza de cada ratón es recta y segura dentro del cono de nariz. Cinta de la cabeza y el cuerpo de cada ratón a la cama con esparadrapo suave, asegurando la respiración no está restringido por la colocación de la cinta. Registrar la posición de cada ratón para permitir la correcta ubicación y asignación de grupo de análisis de imagen.
  7. Mantenga ratones climatizadas durante todo el procedimiento (por ejemplo, usando una lámpara de calor o sistema de bomba de aire caliente para ratones son mantenidos calientes sin sobrecalentamiento). Monitorizar frecuencia respiratoria de todos los ratones, visualmente si se utiliza un pórtico abierto o a través de un sistema de monitoreo remoto usando teclas respiratorias y alterar los niveles de anestesia cuando sea necesario.

5. CT adquisición

  1. Animales son seguros en la cama y la respiración es estable, una vez en el láser Cruz pelos y mover la exploración de la cama para que se alineen con el cerebro de todos los cuatro ratones. Hacia el cristal del escáner la posición (posición 3) de la adquisición con los cerebros de los ratones como cerca del centro del campo de visión posible.
  2. Adquirir una imagen de vista scout de los ratones para comprobar su posición (uso un 200 mm campo de visión) y ajustar la posición arrastrando el cuadro de campo visual en la interfaz si es necesario. Haga clic en "Iniciar flujo de trabajo" en el software del escáner para comenzar la exploración por TAC, asegurándose de seleccionar "Mostrar mensajes de usuario interactivo" para que la exploración del animal doméstico puede ser iniciada manualmente antes de la inyección del trazador.

6. [11C] DPA 713 dosis preparación

  1. Sintetizar [11C] DPA 713 como describió anteriormente12, asegurando que llevas apropiado PPE (equipo de protección personal) para el manejo de radioactividad, incluyendo una bata, guantes y dosímetros personales de dedo y el cuerpo. Asegúrese de cambiar guantes regularmente para evitar la contaminación radiactiva y aumentar su distancia desde la fuente radiactiva cuando sea posible.
  2. Utilizar pinzas para transferir cuidadosamente el frasco de radiosonda detrás de un escudo de plomo.
  3. Preparar jeringas de dosis de 0,5 mL por cada ratón que contiene aproximadamente 250-350 μCi/9-13 MBq en volumen de 100-200 μL para asegurar una dosis adecuada para una exploración dinámica de PET de 60 minutos (dosis administrada deben ser determinado teniendo en cuenta la vida media del isótopo y línea de tiempo del estudio de diseño, con el volumen según el peso del ratón).
  4. Medida la actividad usando un calibrador de dosis establecido en C-11, situado en proximidad cercana al sitio de canulación y registrar los tiempos de medición y la inyección para permitir la corrección de la caries. Elaboración de las dosis antes de los extremos de la CT para limitar el deterioro y asegurar el nivel deseado de la radiactividad se inyectará en cada ratón.
  5. Verificar que no hay burbujas de aire en la jeringa de dosis antes de la actividad de medición e inyección en cada ratón.

7. PET adquisición

  1. Una vez que los ratones avanzan automáticamente de CT a mascota, configurar la parte de atrás del explorador para inyección de DPA 713 [11C] (figura 1C). Coloque relleno absorbente protector sobre una repisa y asegúrese de tijeras y mechero en mano.
  2. Cortar el tubo de sellado del catéter con una tijera, compruebe líneas de catéter libres de burbujas y que la cánula todavía está dentro de la vena mediante la realización de un rubor salino de 10-20 μl. Cargar las jeringas de dosis medida de paso 6.4 en cada uno de los 4 catéteres, realizar un seguimiento de qué dosis se administró a cada ratón.
  3. Haga clic en "Aceptar" cuando la exploración del animal doméstico está lista para empezar mientras simultáneamente a partir de un temporizador de segundo 10. Tienen en la mano, dos investigadores en la parte posterior del escáner con las jeringas de dosis para inyectar todos los 4 ratones simultáneamente sobre el contador llegar a cero. Lave cada catéter con 50-100 μl de solución salina (dependiendo de la longitud del tubo del catéter — es decir, el volumen muerto) para asegurarse de que la dosis completa entra en la vena de la cola y volver a sellar el tubo una vez más con un encendedor.
  4. Medir las jeringas de dosis utilizando un calibrador de la dosis para obtener un valor de radiactividad residual (cualquier trazador en la jeringa). Tome nota de los valores y el tiempo que se registran.
  5. Una vez finalizada la exploración, Inicio la cama del animal doméstico en su posición original mediante el botón "Inicio" horizontal dentro de la propuesta el panel de control. Eliminar los ratones del escáner y retire cuidadosamente el catéter. Suavemente aplique presión al sitio de canulación para prevenir el sangrado excesivo.
  6. Medir la actividad residual en el catéter utilizando un calibrador de la dosis como se describió anteriormente.
  7. Si los ratones son recuperados asegurar esto se hace en un ambiente cálido (por ejemplo, en una caja con una almohadilla de calefacción por debajo o con un guante llenado de agua tibia) para facilitar la recuperación. Si planea eutanasia a los ratones, colocar los ratones en una cámara de inducción con isoflurano que permanecen anestesiados antes de la eutanasia mediante perfusión.
  8. Para reconstruir los datos, abra el software de manejo post-processing (véase Tabla de materiales), que automáticamente será reconstruir cada análisis con los datos del histograma que se generaron desde el archivo lst.

8. cerebro autorradiografía

  1. Antes del experimento, borrar la película digital autorradiografía, exponiéndolo a luz durante 10-15 min y no en un área libre de radiactividad hasta su uso.
  2. Preparar jeringas de dosis de 0,5 mL por cada ratón que contiene aproximadamente 1.0-1.5 mCi/37-56 MBq para asegurar una dosis adecuada de autorradiografía.
  3. Medir la radioactividad en la jeringa de dosis, utilizando un calibrador de dosis, antes de la inyección para obtener una lectura exacta de la actividad.
  4. Canule según se describió anteriormente e inyectar ratones inmediatamente en un area adecuada para la radiactividad.
  5. Retirar el catéter después de la inyección y medir la radiactividad residual.
  6. Deja los ratones en una cámara de inducción calefacción por lo que permanecen anestesiados antes de la perfusión y la eutanasia.
  7. Realizar eutanasia, mientras que los ratones son profundamente anestesiados (inhalación continua de 4% isoflurano, 2 L/min 100% O2) a través de toracotomía bilateral 30 min post [11C] DPA 713 inyección y perfusión de PBS.
    1. Abrir la cavidad abdominal y corte a través del diafragma para exponer el corazón.
    2. Inserte una aguja de infusión de mariposa catéter en el ventrículo izquierdo del corazón, y cortar la aurícula derecha y vena cava inferior.
    3. Lentamente perfusión con PBS (~ 20-30 mL) utilizando una jeringa de 20 mL.
  8. Retire con cuidado el cerebro del cráneo utilizando pinzas y tijeras.
  9. Lugar del cerebro en un molde de congelación lleno de temperatura óptimo corte líquido (OCT), haciendo que el cerebro esté nivelado y centrado en el molde, con los bulbos olfativos orientados hacia las muescas en el molde (para proporcionar puntos de referencia y orientación una vez el cerebro se retira del molde).
  10. Molde de lugar en hielo seco para 10-15 min o hasta que la OCT se vuelve opaco.
  11. Inmediatamente Coloque cada molde en el conjunto de micrótomo criostático a-18 ° C y equilibre durante 10 min antes del montaje.
  12. Retire el molde congelación y Monte el cerebro a la plataforma del micrótomo con un poco de fresco OCT como el "pegamento".
  13. Deje el cerebro montado en el micrótomo de congelación durante 2 min.
  14. Corte a través del cerebro hasta la ubicación del trazo es expuesta (es decir, ROI). Usa la imagen del Señor para situar el infarto en el cerebro de cada animal. Para dMCAO, esta debe estar constantemente en la corteza somatosensorial; sin embargo, puede variar ligeramente la longitud de la carrera.
  15. Sección la región del cerebro que abarca el infarto, colocación de 20 μm de espesor secciones en portaobjetos de vidrio marcados con el número apropiado de ratón.
  16. Abrir el cartucho de autorradiografía y forre el fondo de la cinta con una hoja de envoltura Saran. Organizar la sección hacia arriba en la parte superior del abrigo de saran en el cassette y tomar nota de la posición de cada diapositiva. Opcionalmente, tomar una foto de la colocación de la diapositiva para posterior análisis.
  17. Suavemente, coloque otra capa de abrigo de saran en la parte superior (después de esperar 2 min después de colección de la última sección del cerebro - lo que le permite secarse y adherirse a la diapositiva) y coloque con cuidado el film de autorradiografía digital (lado blanco mirando hacia abajo) encima de las diapositivas.
  18. Cierre herméticamente el cartucho y dejar en un congelador de-20 ° C, permitiendo que las secciones de decaimiento en la película por un tiempo de exposición adecuada (~ 5-10 vidas medias).
  19. Escanear la película después del tiempo de exposición utilizando a un sensor de fósforo para generar una imagen digital para su posterior análisis.

9. Análisis de imagen PET dinámica

  1. Abra el software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales) y haga clic en el icono "open data" para cargar la imagen de CT (como fuente) y el icono de "añadir datos" para cargar el PET en dinámico (como referencia).
  2. Realizar un control visual de calidad de los datos mediante el operador de series de tiempo en el menú desplegable: seleccione la referencia ("ref") y "global" y aplicar una adecuada mínima y máxima para la escala de color. Visualizar los datos dinámicos de mascota cuadro por cuadro, verificar la absorción de la radiactividad y comprobación de cualquier movimiento confunde dentro de la exploración.
  3. Crear una imagen de PET media utilizando el "operador aritmético".
    1. Elija "media seleccionada", deseleccionar "ref" y asegurar la entrada 1 "(Inp1 del), entrada 2"(Inp2 del) y estrella de entrada ("Inp *"-incluye el resto de los marcos de la PET en la exploración) son seleccionados para crear un promedio de todos los cuadros de la mascota.
    2. Ir a la pestaña de "data manager" (DM) y arrastre la imagen promedio hasta la posición de "input1" para fines de visualización. Redistribuir la escala de color haciendo clic en el cálculo automático de la herramienta "min-max".
  4. Registro de la CT para el archivo promedio de PET utilizando la función "automático 3D" en el menú desplegable de "re-orientation/registro".
    1. Seleccione "ref" y "Inp1" y elija "rígido", "rápido", registro "Inp1 a Ref". Revise el registro en todas las 3 dimensiones y ajustar manualmente si es necesario en la pestaña de "3D manual" utilizando las funciones de "traducción" y "rotación".
    2. Cuando esté satisfecho con el registro, seleccione "Inp2" y "Inp *" y se aplican a todos los marcos de PET haciendo clic en la marca de verificación. Haga clic en los archivos de CT y PET en el DM y guarde como materia prima.
  5. El cerebro de un ratón de los cultivos a la vez para el análisis del cerebro utilizando la TC como guía: seleccione "cultivo" en el menú desplegable y arrastre los límites de la imagen para recortar la cabeza del ratón debajo del médula oblonga. Reorientar las imágenes PET y CT usando la función de "reorientación 3D manual" como se describió anteriormente para que el cráneo es recto en todas las dimensiones.
  6. Carga de la imagen del Señor para el ratón (en formato DICOM) utilizando el botón "añadir datos" en la parte superior izquierda de la interfaz. Mover el Señor usando la "reorientación manual 3D" y ajuste al cráneo la imagen de CT (Asegúrese de que todas las modalidades están en la misma orientación).
  7. Dibujar el trazo de retorno de la inversión en la imagen de Señor usando la "herramienta ROI 3D".
    1. Desactivar la visualización de PET deseleccionando dentro de la pestaña de controlador visual (VC) y utilizar sólo el Señor y el CT para dibujar el ROI.
    2. Haga clic en el botón "agregar ROI" para crear un retorno de la inversión nueva y asígnele el nombre "infarto". Seleccione la "herramienta spline", click izquierdo para dibujar el borde ROI y a la derecha, haga clic en para cerrarla.
    3. Repita a través de todos los sectores que abarca la carrera, asegurándose de no capturar cualquiera de la calavera en el retorno de la inversión, con la mejor práctica que deje un espacio de voxel entre la frontera de cráneo y accidente cerebrovascular ROI.
  8. Generar un ROI contralateral mediante el volumen de infarto.
    1. Crear un nuevo retorno de la inversión y etiqueta "contralateral". Haga clic derecho sobre el ROI de infarto y seleccione "exportar". Arrastre el ROI en la posición 2 "(Inp1 del).
    2. Con sólo "Inp1" seleccionado, aplicar una tapa derecha izquierda utilizando la función de "operador" en el menú "registro de reorientación". Marque la casilla de "ROI", elija "sólo ver" y mover manualmente el nuevo retorno de la inversión a la región idéntica en el lado contralateral. Seleccione el operador de la "aritmética" y aplicar una multiplicación escalar de 2 para el nuevo ROI, permitiendo la cuantificación independiente de ROIs.
    3. Volver a la herramienta 3D de ROI. Ir a la pestaña "expertos y experimental" y haga clic en el botón "importar ROI". Seleccione el cuadro de diálogo para cargar el nuevo volumen como el ROI contralateral Inp1.
  9. Haga clic derecho sobre la imagen de PET media y descargarlo y volver a activar la mascota. Generar los resultados de absorción cuantitativa mediante el icono "exportar resultados" dentro de la herramienta 3D de ROI.
  10. Realizar análisis de cerebro dividido adicional si lo desea (es decir, automatizado ROI generación de derecho frente a las regiones del hemisferio del cerebro izquierdo usando un módulo de plugin de atlas de cerebro de ratón 3D para el software de Vivoquant).
    1. Volver a cargar las imágenes de PET/CT registradas.
    2. Importar el atlas del cerebro del ratón haciendo clic en el menú de "módulos avanzados" y seleccionar la herramienta de atlas cerebro 3D. Seleccione "todas las regiones «derecha/izquierda en la"configuración avanzada"y haga clic en"ejecutar"para importar el atlas 3D.
    3. Ajuste manualmente el atlas dentro del cerebro con el cráneo como una frontera.
    4. Vuelva a ejecutar el atlas asegurándose de que "importar ROI 3D" está activada para generar una hoja de cálculo de resultados para todos 14 ROIs de hemisferio izquierdo y derecho (médula, cerebelo, mesencéfalo, pons, corteza, hipocampo, tálamo, hipotálamo, cuerpo estriado, pálido, bulbos olfativos, cuerpo calloso y sustancia blanca).
  11. Cuantificar la absorción del trazalíneas en el bazo usando el explorador de software operativo (véase tabla de materiales).
    1. Cargar archivos de imagen PET y CT destacando en la base de datos y haciendo clic en "análisis general".
    2. Haga clic en la ficha de inscripción y registro Co imágenes PET y TAC, clic en el icono "registro rígido".
    3. Haga clic en la ficha de cuantificación del ROI, haga clic en el icono "crear ROI" y asígnele el nombre bazo.
    4. Elija la herramienta de "esfera" para extraer el bazo ROIs utilizando el archivo de CT para referencia, no haya ninguna superposición con la absorción de riñón (usando la imagen de la mascota y la señal para evitar el contagio de los riñones).
    5. Edit ROIs para mantener constantes volúmenes de retorno de la inversión entre los animales.
  12. Calcular el valor de corrección estándar para la normalización de la absorción.
    1. Cargar los datos de la PET/CT de la exploración estándar y crear un cilindro de retorno de la inversión que abarca la jeringa de 20 mL con la herramienta "ROI 3D manual".
    2. Obtener el nivel de radiactividad contenida en la norma mediante el icono de hoja de cálculo.
    3. Utilizar este resultado nCi/cc y la radiactividad registrada original para el estándar (es decir, la medición del calibrador de dosis del estándar en nCi/cc) para crear un factor de corrección para los valores de absorción de PET. Es decir, dividir la radiactividad de la norma por el calibrador de la dosis por la radioactividad calculada a partir de la imagen del animal doméstico de la norma.
  13. Utilizar las actividades de la dosis y tiempo de las mediciones a la descomposición correcta al momento de la adquisición de mascotas para todos los ratones (es decir calcular la actividad de la dosis en el inicio de la exploración del animal doméstico).
  14. Repita para los valores residuales y restar la dosis corregida de decaimiento para calcular la actividad exacta de cada animal recibido.
  15. Después de aplicar esta corrección de la caries, también se aplican la corrección estándar para asegurarse de que los datos están en el nivel de actividad adecuado. Asegúrese de que estas correcciones se aplican a los dibujados manualmente resultados ROI y atlas ROI datos relevantes del cerebro las regiones del cerebro para la ubicación de dMCAO (es decir, la corteza, hipocampo y cuerpo estriado).
  16. Calcular la %ID/g de los ROIs utilizando la siguiente ecuación: %ID/g = (radiactividad ROI en nCi/cc / dosis corregida en nCi/cc del decaimiento) x 100. Parcela %ID/g en función del tiempo utilizando el software de graficación para generar curvas de actividad de tiempo de cada retorno de la inversión.
  17. Utilizar software de escáner para visualización y figura la generación de imagen final. Normalizar las imágenes según la dosis corregida de decaimiento recibida por cada ratón en el momento de la exploración, asegurando todas las imágenes están en la misma escala de %ID/g.
    Nota: esto es necesario para permitir la comparación precisa de imágenes de los diferentes ratones y/o imágenes de los estudios realizados en días diferentes

10. Análisis de la imagen autorradiografía

  1. Abre la imagen digital (.gel archivo) en el software ImageJ. Ajustar el brillo y el contraste umbral visualmente la imagen y aplicar un color apropiado "tabla de búsqueda".
    Nota: Real más exactamente se asemeja a la escala de colores utilizada en PET.
  2. Utilice el administrador de ROI para dibujar manualmente ROIs alrededor de infarto y regiones contralaterales correspondientes.
  3. Utilice la función de medida para cuantificar la intensidad de la medias pixel de cada ROI y exportar los resultados. Parcela utilizando software estadístico.

Resultados

Ratones experimentaron MRI para verificar tiempos de éxito y el [11C] DPA 713 PET se realizó escaneando simultáneamente 4 ratones. PET, CT y Sr. imágenes fueron co registrado antes manualmente dibujo cerebro ROIs y realizar el análisis de atlas cerebro de split semi automatizado, para investigar la absorción del trazalíneas en regiones ipsolaterales y contralaterales (figura 2).

Imágenes PET/TC y las curvas tiempo actividad (actividad de radiosonda TAC como una función de tiempo) muestran mayor [11C] DPA 713 absorción en ipsolateral versus hemisferios contralaterales (figura 3A). Datos de cuantificación de imágenes dinámicas de cerebro del animal doméstico, usando suma de 50-60 min, reveló un aumento significativo en la absorción del trazalíneas (% ID/g) en el ipsilateral (infartado) en comparación con el hemisferio contralateral en dMCAO, pero no en ratones sham utilizando el manual elaborado Enfoque ROI (figura 3B). También se observó la absorción creciente en el hemisferio ipsilateral entre ratones dMCAO y farsa. No observaron diferencias significativas entre hemisferios ipsilaterales y contralaterales fueron usando el método atlas, probablemente debido al atlas ROIs ser más grande que el tamaño del infarto (generalmente restringido a la corteza somatosensorial), por lo tanto, diluir la señal. Sin embargo, se observó total absorción creciente en dMCAO en comparación con el tratamiento simulado para todos ROIs, que alinea con informes anteriores con ratones modelo MCAO, demostrando mayor expresión de TSPO en regiones fuera de infarto19. Relaciones ipsilateral contralateral se incrementaron en dMCAO versus ratones sham utilizando ambos métodos; sin embargo, esta diferencia sólo fue significativa en la corteza con el enfoque de atlas del cerebro debido a la mayor varianza en el enfoque de retorno de la inversión. Esto se puede solucionar aumentando el número de ratones de cada grupo. Cuantificación de captación de DPA 713 [11C] en bazo no mostraron diferencias significativas entre grupos (figura 4).

Resultados de la proyección de imagen de la mascota del ratón de dMCAO de la cerebral fueron confirmados por ex vivo de alta resolución digital autorradiografía (figura 5). Mayor [11C] DPA 713 absorción fue observada en el tejido infartado con insignificante señal en tejido cerebral sano circundante. Cuantificación de estas imágenes reveló ipsilateral contralateral proporciones que van desde 1.4 a 2.09 en ratones dMCAO.

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Figura 1: Escáner de PET y área de trabajo configuración. Los espacios de trabajo cubrieron en protector acolchado absorbente para crear un ambiente estéril. (A) después de calibrado, una cama de ratón 3D impreso, equipada para 4 ratones de imágenes al mismo tiempo fue asegurada en el escáner y conos de nariz de todos los 4 ratones adjunto a la anestesia. (B) equipo necesario para la proyección de imagen PET se prepararon con antelación, incluyendo catéteres de 27,5 G lleno de solución salina, lubricante ocular, hisopos de etanol, lámparas de calor, cinta quirúrgica, pegamento de tejidos, jeringas de dosis de 0.5 mL, tijeras y un mechero. (C) para la inyección de la radiosonda, coloque las jeringas de salino-ras y tijeras en la parte posterior del escáner. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: ROI ipsilateral Contralateral y hemisferio derecho/izquierdo-Split Brain Atlas proceso de análisis de imagen PET. Análisis de imagen software se utilizó para determinar la captación de trazador en ipsolaterales y contralaterales de las regiones de interés (ROIs) utilizando manualmente dibujado ROIs y un enfoque semiautomático atlas división 3D. Registro automático de PET-TAC 3D fue realizado siguió por registro manual del cerebro MRI dentro del cráneo de ratón correspondiente definido en la imagen de CT. La herramienta 3D de ROI se utiliza para dibujar manualmente ipsolateral (rojo) y contralaterales ROIs (verde) con el infarto en la resonancia magnética como referencia. El método split-brain, el atlas del cerebro de ratón izquierda/derecha-split 3D fue cargado y montado dentro del cráneo según la definición de la imagen de CT. ROIs del cerebro usados para la cuantificación en este atlas del cerebro de ratón 3D incluyeron corteza izquierda (gris oscuro), hipocampo izquierdo (Aciano Azul), estriado de izquierda (rosa profundo), Right Cortex (tomate rojo), hipocampo derecho (verde) y derecho Striatium (cian). La captación de [11C] DPA-713 en cada región se obtuvo en nCi/cc y posteriormente fue convertido a %ID/g por normalizar a la dosis de corrección de decaimiento en el tiempo de exploración para cada ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : Representante en Vivo [11C] cerebro de DPA 713 absorción en DMCAO y ratones Sham. (A) imágenes PET-TAC dinámica y TAC demuestra mayor [11C] DPA 713 absorción en la corteza ipsolateral de los ratones que experimentaron la DMCAO (n = 3) y un ligero aumento de sham (n = 3) funcionado ratones, ratones DMCAO demostrar significativamente mayor contraste inyectado dosis de porcentaje entre el infarto y el lado contralateral del cerebro (%ID/g). (B) cuantificación de PET (50-60 min Resumen) reveló la absorción significativamente mayor en el ROI ipsilateral utilizando el enfoque de retorno de la inversión y en la corteza (Ctx) utilizando el método split-brain atlas. No hubo diferencias significativas se encontraron en el hipocampo (HC) o estriado (Str). Mayor proporción ipsolateral y contralateral fueron vistos usando análisis de ambos enfoques pero sólo fue estadísticamente significativo en el Ctx utilizando el método de atlas del cerebro. * (p < 0,05), *** (p < 0,001) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Representante En Vivo [11C] DPA 713 bazo absorción en dMCAO y ratones Sham. (A) DPA-713 dinámico [11C] imágenes de PET/CT muestra bazo ROIs en dMCAO (n = 3) y simulada (n = 3) ratones. (B) resultados cuantitativos no demuestran resultados significativos en la absorción de bazo entre ratones dMCAO y farsa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 : Representante autorradiografía resultados. Imágenes de autorradiografía digital demuestran mayor [11C] DPA 713 la absorción en el ipsilateral en comparación con el hemisferio contralateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo presentado describe un método para la cuantificación de la neuroinflamación en ratones dMCAO y simulado utilizando [11C] DPA-713-PET. TSPO-PET es el biomarcador más ampliamente investigado imágenes para visualizar y medir la neuroinflamación en vivo hasta la fecha. Expresión de TSPO es upregulated en glia en el cerebro durante la inflamación, permitiendo la detección no invasiva y la cuantificación de la neuroinflamación. Por otra parte, es una técnica altamente traducible, lo que es una valiosa herramienta en investigación clínica y preclínica. Este protocolo y resultados representativos destacan la conveniencia de utilizar [11C] DPA 713 PET para detectar y monitorear alteraciones capensis en accidente cerebrovascular y otros trastornos neurológicos en vivo.

En este estudio, dMCAO la cirugía se llevó a cabo con ratones hembra de 3 meses C57BL/6. Este modelo fue elegido como da lugar a un infarto altamente reproducible restringido a la corteza somatosensorial, proporcionando un modelo de isquemia focal permanente con baja variabilidad en comparación con otros modelos de accidente cerebrovascular (p. ej., medio cerebral arterial método de oclusión (MCAO) filamento)14. Animal doméstico proyección de imagen de modelos de movimiento tiene la ventaja de que contiene una región de referencia interna en el cerebro para cada animal con ROIs en el hemisferio contralateral. Ya que habrá alguna inflamación que los resultados de la cirugía sola, es importante incluir los ratones que experimentaron la cirugía simulada en el diseño del estudio, por el que la craneotomía y manipulación de meninges sin oclusión de la arteria fue realizada. Craneotomía solo puede ocasionar la interrupción para el tejido neuronal subyacente y la introducción de patógenos hacia la respuesta inmune independiente de carrera20. Algunos inflamación después de la cirugía ficticia por lo tanto se espera y debe ser evaluada en paralelo a dMCAO para excluir la posibilidad de señal debido a la cirugía sola. Para evitar incluyendo inflamación resultante de la cirugía sin movimiento en el análisis de cohorte de dMCAO, Sr. proyección de imagen se realizarán para confirmar el desarrollo de carrera exitosa cirugía e infarto. MRI también proporciona un marco de referencia estructural, que es indispensable establecer con precisión el infarto y ROIs contralaterales. Además, procesamiento de imagen precisa incluyendo definición de ROI y registro de la imagen son necesarias para la cuantificación confiable.

Limitaciones adicionales se deben tener en cuenta cuando se trabaja con C-11 etiquetado radiotrazadores para PET y autorradiografía. Es imprescindible tener en cuenta la corta vida media (min 20,33) de C-11, con su uso restringido generalmente a la investigación de institutos con acceso ciclotrón in situ. Radiactividad apropiado transporte ruta, administración de dosis y momentos de adquisición deberán determinarse de antemano con un plan detallado preparado del flujo de trabajo del experimento para que el equipo pueda trabajar rápidamente y eficientemente. El diseño y puesta en marcha de este estudio ha sido delineado para dar cabida a la proyección de imagen de 4 ratones simultáneamente para aumentar la salida de datos que se puede obtener cuando se utiliza un trazador C-11. Si es posible, es recomendable tener todos los ratones canulados y en medio de su TC cuando el palpador C-11 llega en el centro de proyección de imagen para asegurar el decaimiento de la radiosonda mínima antes de la inyección. También mejor este protocolo paso a paso se lleva a cabo por un equipo que contiene al menos 3 investigadores para permitir la canalización rápida, medición de dosis, inyección de trazador, PET-TAC y cerebro seccionado antes de significativo decaimiento radiactivo. Requiere dos personas para llevar a cabo la iniciación de la exploración del animal doméstico y la inyección de todos los 4 ratones simultáneamente. La razón para la adquisición de la mascota antes de la inyección del principio es garantizar que la farmacocinética y dinámica de la distribución del trazador en la sangre y las regiones de interés se capturan con precisión y completamente. Muchos pasos pueden requerir entrenamiento vigoroso y práctica para asegurar la buena marcha del experimento. En particular, este protocolo depende de canulación de la vena de éxito cola de ratones C57BL/6, que puede ser difícil debido a la presente en la cola de cabello oscuro y puede llegar a ser más difíciles después de accidente cerebrovascular o si los ratones mismo la proyección de imagen en múltiples puntos del tiempo .

Otra consideración para la proyección de imagen PET incluye grabación cuidadosa de radiosonda dosis y residual actividad medidas, incluyendo la hora exacta de la medida. Esto es esencial para la corrección de la descomposición exacta de la dosis inyectada en el momento de la exploración y se utiliza para obtener una medición precisa de la absorción del trazador (es decir, % ID/g) para cada ROI. Es imprescindible conocer la cantidad exacta de la radiactividad que estaba presente en cada ratón en el momento de la exploración para garantizar el análisis de una imagen precisa. Por lo tanto, es aconsejable sincronizar los relojes en el equipo analizador y calibrador de la dosis para evitar el error al utilizar isótopos de breve duración como C-11.

Precisa cuantificación de imagen PET también puede ser limitada por la precisión del escáner y puesta a punto. Por lo tanto, para garantizar la exacta cuantificación de imágenes PET/CT, es importante llevar a cabo controles de calidad para los componentes de la CT y la PET del escáner. Controles de calidad CT incluyen acondicionado fuente de rayos x, luz/oscuridad y centro off set calibrado. Estas calibraciones miden y correcto para el ruido del sistema y debe ser realizado antes de su adquisición según lo recomendado por el fabricante del escáner. Las calibraciones deben realizarse también para el escáner PET. Típicamente se trata de una exploración "estándar / mascota fantasma", que contiene una concentración conocida de la radiactividad de la exploración. Al preparar el estándar, es mejor usar el mismo radioisótopo utilizado en el estudio, una dosis comparable a la había administrada a un ratón en un volumen similar al cuerpo de un ratón y la adquisición misma parámetros como proyección de imagen de animal. Una jeringa de 20 mL con radiosonda diluido en agua se utiliza para el estándar en este protocolo, con los posteriores resultados de la proyección de imagen PET permite calcular un factor de corrección basado en la dosis real medida por el detector de calibración. La proporción de corrección se puede aplicar a los datos de imágenes adquiridos en el experimento para asegurar la exacta cuantificación de captación del trazador en las regiones de interés en imágenes PET. Esto explica la gama de positrones del radionúclido además teniendo en cuenta cualquier actividad de fondo presente en el día de la exploración. Como el calibrador de la dosis es una parte integral de la generación de este factor de corrección, es imprescindible que este equipo también es calibrado regularmente según las directrices del fabricante.

Al realizar ex vivo autorradiografía es importante escoger un momento óptimo para la eutanasia después de la inyección, para asegurar la alta señal a fondo en regiones de interés. Treinta minutos posterior a la inyección fue elegido por autorradiografía de DPA 713 [11C] usando los datos adquiridos durante la dinámica imagen de PET -es decir, el en vivo TAC dinámico como guía, mientras que también teniendo en cuenta la corta vida media de C-11 y el tiempo involucrados para la sección y exponer el tejido cerebral después de la extracción. Teniendo en cuenta esto, se debe realizar [11C] DPA 713 autorradiografía en una cohorte independiente de ratones para permitir la inyección de una dosis mayor de DPA 713 [11C] y a 30 minutos vez punto de perfusión y a la eutanasia bajo anestesia. Realizar un pequeño en vivo estudio piloto del animal doméstico con unos 3-4 los ratones antes de realizar la autorradiografía ex vivo será útil para determinar el momento óptimo para autorradiografía. Una consideración adicional para ex vivo autorradiografía es recuperar los ratones después de la inyección o mantenerlos anestesiados hasta la eutanasia. Mantenerlos anestesiados imita las condiciones de la exploración y aseguran la cinética de distribución o excreción del radiotrazador no son alterados por la recuperación. Además, esto impide que el estrés adicional en los ratones evitando la recuperación y posterior inducción. Por último, sería una adición útil al Protocolo de ex vivo evaluar el daño regional en las rebanadas de cerebro utilizado por autorradiografía mediante inmunohistoquímica tinción (después de decaimiento radiactivo) para generar una imagen de alta resolución de la localización del infarto y volumen.

Como hay limitaciones con el uso de un trazador de C-11 basado, este protocolo puede modificarse fácilmente para el uso con un F-18 (Half-Life de 109,77 min) TSPO tracer, que puede ser más aplicable a lugares sin un ciclotrón in situ. Además, este protocolo describe el uso de un montaje de imágenes 4-ratón. Aunque este método de alto rendimiento es óptimo cuando se utiliza un trazador C-11, este protocolo puede ser modificado para los usuarios de ratón imágenes camas. Una planificación cuidadosa y el entrenamiento constante en las técnicas descritas en el presente Protocolo dará lugar a la generación de una riqueza de datos mediante [11C] DPA-713, que fácilmente puede ser aplicado a investigar el papel de la neuroinflamación en la manifestación de la enfermedad y progresión en otros modelos de roedores de los trastornos neurológicos. Por otra parte, esta técnica podría utilizarse para evaluar la respuesta en vivo a la terapéutica inmunomoduladora dirigida a microglia/macrófagos.

Divulgaciones

Los autores declaran no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el laboratorio Buckwalter (especialmente el Dr. Todd Peterson) para proporcionar el modelo de ratón y cirugías dMCAO y farsa. Además, nos gustaría agradecer a Thomas Liguori de Invicro por su asistencia técnica con VivoQuant software de análisis de imagen, el Dr. Tim Doyle, Dr. Laura Pisani, Dr. Frezghi Habte del animal pequeño SCi3 centro de Stanford para su asesoramiento de imagen y asistencia en el desarrollo de este protocolo de imagen y la instalación de radioquímica (especialmente el Dr. Jun Park) por su ayuda a la síntesis de [11C] DPA-713.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Escáner PET/CT InveonSiemens Versión4.2
Escáner de resonancia magnéticaVarian7 Telsa
Software ParaVisionBrukerversión 6.0.1Software operativo de resonancia magnética
Software VivoQuantInVicroversión 2.5Software de análisis de imágenes
Software Inveon Research Workspace SiemensVersión4.2Software operativo del escáner. Incluye microQView, el software de gestión de posprocesamiento
Calibrador de dosisCapintechCRC-15 PET
Typhoon generador de imágenes de fósforo 9410GE Healthcare8149-30-9410
Catéteres de mariposaSAI Infusion TechnologiesBFL-24Aguja de 27,5
G Jeringas de 1 mLBD
Jeringas de insulinaBD329461Jeringas de insulina de 0,5 mL con aguja
Jeringa de 20 mL Jeringa VWRBD302831BD Punta deslizante graduada
Pegamento tisularSanta Cruz Animal Healthsc-3619313 mL
Lámpara de calorFluker270025.5" lámpara de calor reptile con pinza e interruptor
0.9% solución salina estérilPfizer00409-4888-10Cloruro de sodio al 0.9% para inyección, 10 mL
Lubricante ocularWatson Rugby PV926977Lágrimas Artificiales Ungüento Lubricante para los Ojos, 1/8 oz
Hojas absorbentes Chux ThermoFisherScientific1420662 Acolchado absorbente desechable
Tijeras de irisWorld Precision Instruments503708-1211.5 cm, recta, paquete de 12
cintas quirúrgicas3M Durapore1538-0Rollo de 1/2" x 10 yardas, seda, hipoalergénico
Cama de ratón para mascotasEn casaEncendedor de cama de PET de 4 ratones
BicUDP2WMDC
IsofluranoHenry ScheinNDC 11695-6776-2Isothesia, anestésico inhalatorio, 250 mL
OxígenoPraxiarUN1072Gas comprimido
Casete de autorradiografíaCole PalmerEW-21700-34Aluminio, 8" x 10"
Película de autorradiografíaGE Life Sciences28-9564-78Almacenamiento Pantalla de fósforo BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 × 25 cm, solo pantalla
Cuchillas de micrótomoThermoFisher Scientific30-508-35MB35 Premier Desechable, ángulo de corte de 34 grados
Microtomo MicromHM 550
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-15Superfrost™ Plus Portaobjetos de microscopio
OCT líquidoVWR25608-930Formulación de glicoles y resinas solubles en agua para el corte de criostato a temperaturas de -10 °C; C (14° F) e inferiores
Moldes de congelaciónPoly sciences18646A-1Moldes de parafina desechables
Saran wrapSaran
DesinfectanteVirkon S
25700001300

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