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Artículo de método

Evaluación de la coagulación con Plasma en tejido del hígado en un modelo Animal grande en Vivo

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DOI:

10.3791/57355

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4 de agosto de 2018

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1Department of Surgery, University of Bonn, 2Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 3Department of Anesthesiology, RWTH Aachen University

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para evaluar experimentalmente la coagulación con plasma en el tejido hepático en vivo. En un modelo porcino, microcirculación es examinada por láser Doppler, profundidad de coagulación se mide histológicamente, temperatura en el sitio de coagulación por termómetro infrarrojo, cámara termográfica y conducto efecto del lacre está documentada por la presión de explosión experimentos.

Resumen

Coagulación del plasma como una forma de electrocauterización se utiliza en Cirugía hepática durante décadas para sellar la superficie de corte de hígado grande después de hepatectomy importante para prevenir las hemorragias en una etapa posterior. Mal sólo se examinan los efectos exactos de la coagulación con plasma en tejido del hígado. En el modelo porcino, los efectos de la coagulación pueden ser examinados cerca de la aplicación clínica. Una combinado Láser Doppler flowmeter y espectrofotómetro documentos la microcirculación cambia durante la coagulación en 8 mm de profundidad de tejido no invasor, proporcionando información cuantificable sobre hemostasia más allá de la impresión clínica subjetiva. La temperatura en el sitio de la coagulación se evalúa con una coagulación previa y post de termómetro infrarrojo y una cámara termográfica durante la coagulación, una medición de la temperatura del gas de la viga no es posible debido al umbral superior de los dispositivos. La profundidad de la coagulación se mide microscópicamente con hematoxilina/eosina, tinción de secciones después de la calibración con un micrómetro de objeto y le da una información exacta sobre la coagulación ajuste profundidad-relación de poder. El efecto del lacre se examina en los conductos biliares ya que no es posible para un coagulador de plasma sellar vasos sanguíneos más grandes. Realizan experimentos de presión de explosión hacia fuera en órganos explanted para descartar hipertensión relacionadas con efectos.

Introducción

Coagulación con argón plasma (APC) es un instrumento ampliamente utilizado en cirugía abdominal por más de tres décadas1,2. Es una técnica estándar para el logro de la hemostasia secundaria después comandante hepatectomy sellando el hígado de superficie para evitar hemorragias posteriores3. Coagulación del plasma es una forma especializada de electrocauterio de radiofrecuencia, que entrega la energía eléctrica a través de un arco de gas ionizado. Proporcionar hemostasia monopolar de electrotérmico, esta técnica sin contacto tiene la ventaja de evitar que el electrodo se adhiera a los tejidos4. El gas ionizado se dirige automáticamente al área de la más baja resistencia eléctrica y esté ausente cuando la resistencia aumenta debido a la desecación a otras áreas no desecados. Esto produce una profundidad limitada uniforme de coagulación5,6. Factores que influyen en el efecto de la coagulación son la activación del tiempo, la configuración del dispositivo de la coagulación y la distancia entre la sonda y el tejido. El helio es otro gas portador, que puede ser utilizado para plasma coagulación7. Clínicos recientes estudios concentrados en los resultados clínicos en lugar de hallazgos histológicos y funcionales3,8,9, mientras que estudios experimentales enfocados en vitro investigaciones10 o experimentos en órganos perfundidos aislados11.

El protocolo subyacente permite el estudio de los efectos de coagulación del plasma en un modelo animal grande cerca de la aplicación clínica utilizando equipamiento humano en cerdos: microcirculación es evaluada de forma no invasiva por un flujómetro Doppler láser y Espectrofotómetro, que es una herramienta clínica para esta indicación12,13. Cambios de temperatura durante la coagulación son monitoreados con un termómetro de infrarrojos y una cámara termográfica. La profundidad de la coagulación se mide en histológica hematoxilina/eosina secciones manchada después de la recolección de muestras de tejido. Para la comparación con otros medios de hemostasia secundaria, se realizan experimentos de presión de explosión. En contraste con técnicas previamente descritas14, estos se llevan a cabo órganos explanted para excluir la presión arterial relacionados con efectos. Además de las investigaciones descritas en los efectos locales de coagulación del plasma, pruebas de sangre estándar puede realizarse también en el modelo porcino.

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Protocolo

Se siguieron las normas regidas por la legislación alemana para los estudios en animales así como principios de laboratorio Animal Care (institutos nacionales de salud publicación ed. 8, 2011). Se concede permiso oficial de la oficina gubernamental de cuidado de animales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemania).

1. los animales

  1. Uso de cerdos hembra landrace alemán (25-30 kg de peso) alojados en jaulas abiertas.
  2. Uso de 5 animales por grupo (argón y helio).
  3. Permitir a los animales para aclimatarse a los alrededores de por lo menos una semana antes de los experimentos. Animales rápidos 24 h antes de la cirugía con acceso libre al agua.

2. anestesia

  1. Premedicate los animales con una inyección intramuscular de ketamina (15 mg/kg de peso corporal [BW]), xilacina (10 mg/kg P.C.) y atropina (0.1 mg/kg P.C.) 10 minutos antes de la inducción de la anestesia.
  2. Acceso venoso periférico se establece por la colocación de una cánula de calibre 22 en una vena de la oreja.
  3. Inducir la anestesia general por inyección i.v. de propofol 2 mg/kg de peso corporal.
  4. Coloque el animal en posición decúbito supina y realizar una incisión longitudinal de la piel en el surco yugular sobre una longitud de 2 cm. localizar la vena a través de la contundente preparación del tejido subcutáneo. Inserte la cánula, luego alambre de Seldinger.
  5. Cánula de retracción e insertar 14 Fr. catéter sobre el alambre guía. Retraiga el alambre de guía. Conectar el catéter a la extensión y fijar el catéter mediante una correa o una sutura.
  6. Saque la lengua e insertar laringoscopio recta. Utilice la punta del laringoscopio para tirar abajo la epiglotis. Inserte el tubo por las cuerdas vocales. Coloque el brazalete en la glotis e inflar.
  7. Ventilar con oxígeno al 40% en 20-26 respiraciones/min y un volumen tidal de 10 ml/kg para mantener la tensión de dióxido de carbono parcial fin-de marea entre 36 y 42 mm Hg.
  8. Mantener la anestesia con isoflurano con una concentración de 1-1.5% y fentanilo a una concentración de 3-4 μg/kg/h.
  9. Suministro de solución de lactato de Ringer a una tasa inicial de 4 mL/kg/h y aumentar después de laparotomía a una tasa de infusión constante de 8 mL/kg/h.

3. cirugía y coagulación del Plasma

  1. Coloque el animal en una posición supina sobre una mesa quirúrgica estándar.
  2. Desinfectar la piel mediante la aplicación de un desinfectante quirúrgico estándar (2-Propanol 45 g/100 g, 1-Propanol 10 g / 100g, bifenil-2-ol 0,2 g/100 g) con una esponja quirúrgica por 3 veces.
  3. Realizar una laparotomía media amplia del proceso xifoides hasta el pubis con un bisturí e instalar retractores quirúrgicos.
  4. Encienda el aparato de coagulación del plasma, abrir la botella de gas argón o helio, según el gas portador utilizado. Ajustar el flujo del gas a 3 L/min coagulación seleccione dispositivo potencia de salida deseada.
    Nota: Ambos gases nobles, argón o helio, puede utilizarse para la coagulación del plasma. Efectos de coagulación son comparables. Ver referencia7 para más detalles.
  5. Realizar coagulación del plasma en el lóbulo izquierdo del hígado como se describió anteriormente7. Usar un molde de titanio (abertura cuadrada 1 x 1 cm2) para estandarizar la zona de coagulación. Coagular durante 5 s a una distancia de la punta de prueba de 1 cm. Coagulaciones con diferentes de potencia pueden realizarse con una distancia corta entre las coagulaciones de 5 mm (figura 1).
  6. Para la cosecha del hígado, dividir todas las conexiones ligamentosas al hígado. Aislar y dividir el pedículo hepático por encima de la flexión duodenal superior dejando largas porciones de la vena porta y conducto biliar común. Dividir la vena cava por encima y por debajo del hígado y recupera el órgano.
  7. Después de la cosecha el hígado, los cerdos fueron sacrificados por administración i.v. de 0.16 g/kg BW pentobarbital.
  8. Para los experimentos de la presión de explosión, resecar la mitad del lóbulo hepático izquierdo medial con unas tijeras afiladas. Plasma-coagular el corte superficial (100W de potencia de salida) o sellar la superficie del corte con sellante de fibrina (figura 2).

4. microcirculación medición

Nota: Espectroscopia del Laser Doppler puede determinar el flujo sanguíneo en el tejido a través de la medición de la cambio de Doppler causada por el movimiento de los eritrocitos. La señal del Laser se correlaciona con el número de eritrocitos móviles. Espectroscopía Doppler láser está en uso clínico (por ejemplo medicina del trasplante) y ha sido validado varias veces15.

  1. Encienda el medidor Doppler laser y espectrofotómetro. Utilizar una sonda plana.
  2. Tomar mediciones de línea base de flujo y velocidad. Guarde o tenga en cuenta los valores.
  3. Realizar la coagulación como se describe en 3.5.
  4. Coloque la sonda plana en sitios de coagulación y medir caudal y velocidad. Una vez más, salvar o valores en cuenta.
  5. Repita para todos los ajustes de energía del dispositivo coagulador.

5. medición de la temperatura

  1. Cambiar el sistema (cámara termográfica portátil y termómetro de infrarrojos) y déjela funcionar durante al menos 1 h antes de realizar las mediciones.
  2. Ajustar el foco y ve el marco de la cámara termográfica en el sitio de la coagulación. Secuencias de infrarrojos pueden detectarse con la resolución espacial de 1024 x 768 píxeles con una resolución de temperatura mayor de 20 mK. Tener en cuenta, que la región de la coagulación y el tejido circundante — afectados por la transferencia de calor, se encuentra en medio de la vista.
    Nota: Debe incluir tantos pixeles del marco como sea posible para una óptima resolución espacial.
  3. Registrar el proceso de coagulación con el coagulador de plasma en la superficie del hígado con la cámara termográfica durante un período de 2 min.
  4. Analizar secuencias de imágenes con el software de análisis de termografía: definir regiones de interés.
    Nota: El Software calcula el curso de la temperatura media correspondiente con el tiempo.

6. coagulación profundidad medida

  1. Cosecha el lóbulo izquierdo de hígado medial con unas tijeras afiladas.
  2. Suprimir los sitios de coagulación con grosor de 1 cm. Cortar en segmentos longitudinales gruesos de 3 mm para su posterior procesamiento.
  3. Muestras de tejido de reparación a 4 ° C durante la noche con neutro 10% tamponada con formalina. Calor 2 ° C sobre el punto de fusión de la parafina y embed rebanadas. Proceso durante la noche.
  4. Realizar coloración de hematoxilina/eosina.
    1. Desparafinizar e hidratar los tejidos sumergiendo posteriormente en 2 x xileno, 100% de etanol (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, desionizada de H2O 2 minutos.
    2. Mancha de la muestra de tejido con solución de hematoxilina de Meyer durante 3 minutos.
    3. Ahora enjuague en agua corriente durante 5 minutos.
    4. Teñir el tejido con solución de eosina durante 3 minutos.
    5. Enjuague 2 x EtOH 95% y luego xileno durante 3 minutos. Monte con el medio de montaje estándar.
  5. Encender el sistema (conectado microscopio cámara, software de imágenes). Ver todas las secciones con 40 aumentos.
  6. Tomar una imagen de un micrómetro de objeto en un aumento de 40 X. Pulse recalibrar el botón en la ventana de objetivos. Seleccione calibración manual. Trace una línea en la imagen del micrómetro de 100 μm. Enter 0,1 mm en el cuadro de diálogo y pulse OK.
  7. Seleccionar la longitud de la vista > Análisis de controles > anotaciones y medidas de la ventana. Medida de la superficie del hígado al margen de la coagulación con el ratón. Exportación o nota el resultado. Repita la medición en otra ubicación en la diapositiva misma.
    Nota: Profundidad de coagulación puede diferenciarse fácilmente del tejido normal del hígado por el margen agudo entre los cordones de hepatocitos normales y la zona de necrosis con citoplasma contraído, núcleos picnóticos y zonas de hemorragia.
  8. Calcular el promedio de dos mediciones.

7. medición de la presión de explosión

  1. Encender el sistema (bombas automáticas, medidor de presión). Preparar las muestras del hígado según el paso 3.7.
    Nota: Use dos bombas paralelo conectadas a través de una llave de 3 vías. La presión máxima de 1.500 mm Hg no puede obtenerse con una sola bomba.
  2. Aislamiento de la vena porta, arteria hepática común y conducto biliar con tijeras en el pedículo háptico. Sujetar la vena porta con un fórceps de overholt y ligan con una sutura de monofilamento 4-0. Abrazadera de la arteria hepática común un fórceps de overholt y ligan con una sutura de monofilamento 4-0.
  3. Insertar catéter Ch-16 en el conducto biliar común y ligan con una sutura de seda 2-0. Conectar el catéter a las bombas automáticas, instalar llave de 3 vías con medidor de presión (figura 3).
  4. Llene la jeringa de perfusión con solución salina.
  5. Inicio bombas automáticas con una tasa de entrega de 99 mL/h.
  6. Vigilar el hígado cortado metros superficie y presión de salida y registro de presión de estallido.
    Nota: Para fácil reconocimiento de fugas, azul patente puede añadirse a solución salina (azul patente 2 mL + solución salina 18 mL). Es más fácil observar la presión de explosión por notar el tiempo de pérdida de presión en el medidor de presión.

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Resultados

Microcirculación: Utilizando el dispositivo de diagnóstico para la hemostasia después de coagulación del plasma se puede demostrar por los cambios de la microcirculación. Sangre capilar flujo (muestra como unidades arbitrarias (UA)) disminuye desde un valor basal de 142.7 ± 76.08 AU ± 57.78 49.57 AU en 25 W dispositivo de potencia de salida, a 48,5 ± 7,26 AU en 50 W y a 5,04 ± 1.31 AU 100 W (figura 4).

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Discusión

Modelos de roedores para la cirugía hepática se establecen para un tiempo de16. Sin embargo, los modelos animales grandes ofrecen ciertas ventajas: ningún equipo de microcirugía se necesita como equipo operativo estándar para los seres humanos puede ser aplicado, las técnicas quirúrgicas son comparables al uso clínico y métodos de evaluación clínica estándar puede transferido a los experimentos. Por ejemplo, se puede realizar exámenes clínicos estándar sin la necesidad de métodos de ensayo de labo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Xilacina 20 mg/mLVetoquinol GmbHXylapan
Ketamina 100 mg/mLCeva GmbHCeva Ketamina Inyección
Atropina 100 mg / 10 mLDr. Franz Kö hler Chemie GmbHAtropinsulfat Kö hler 100mg Amp.
PropofolFresenius Kabi GmbHPropofol 1% MCT Fresenius
FentaniloKG Rotexmedica GmbHFentanilo 0,5mg Rotexmedica
IsofluranoAbbot GmbHForene 100% (V/V) 250 mL
Solución de lactato de RingerBaxter Deutschland GmbHsodio 131 mmol/l, potasio 5 mmol/l, calcio 2 mmol/l, cloruro 111 mmol/l, lactato 29 mmol/l
Desincomentante quirúrgicoSchü LKE & Mayr GmbHKodan Tinktur forte gefä rbt 1l 104804
Microscopio motorizadoNikon Instruments EuropeEclipse TE2000-E
microscópicaNikon Instruments EuropeDigitalsight DS-Qi1Mc
Software de imagenNikon Instruments EuropeNIS elements Vers. 4.40
Coagulador de plasmaSö ring GmbHCPC-1000
Gas argónLinde AGArgon 4.8 
Gas helioLinde AGHelio 4.8
O2CLEA Medizintechnik GmbHO2C Versión 1212con sonda LF-2 o LF-3
Termómetro infrarrojoVoltcraftVOLTCRAFT IR 260-8S
Cámara termográficaInfraTec GmbHVarioCAM HD head 820
Software de análisis termográficoInfraTec GmbHIRBIS 3
Solución de hematoxilina de MayerMerck 1.09249
electrónicaGMH 3161
Jeringa de perfusión, 50 mLB. Braun Melsungen AGREF 8728810 F
Línea de perfusores, Tipo IV Estándar, PVC Cerradura LuerB. Braun Melsungen AGREF 8722960
Llave de paso de 3 vías, Dicofix C35CB. Braun Melsungen AGREF 16494 C
Silk 2-0. 3 métricosResorbaREF H5F
Vicryl 4-0 SutupakEthiconV1224H
NaCl 0.9 %B. Braun Melsungen AG
Cámara Solución de eosina VWR International GmbH Merck 1.09844 Rollerpump Masterflex L/S easy Load Cole-Parmer Instrument Company modelo 7518-10 Perfusorpump B. Braun Melsungen AG Perfusor secura FT Medidor de presión digital Greisinger

Referencias

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