Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Abstract

Hücre dışı matriks sertlik hücresel davranış, işlev ve kader genel olarak etkilemek için bilinen birden çok çevre mekanik uyaranlara kapsar. Her ne kadar giderek daha fazla yapışık hücre tipleri yanıt matris sertlik için karakterize, bakteriyel enfeksiyon hücreleri yatkınlık bağlıdır üzerinde matris sertlik yapışık olarak büyük ölçüde bilinmeyen nasıl bakteriyel enfeksiyon üzerinde etkisidir biyomekanik konak hücre. Bu hücrelerin bulunduğu matris sertliği konak endotel hücreleri duyarlılık bir bakteriyel enfeksiyona bağlıdır ve konağın enfeksiyon bakteri hücreleri-ecek değişmek onların biyomekanik öngörmekteyiz. Bu iki hipotezler test etmek için endotel hücreleri modeli ev sahipliği yapan ve Listeria Monositogenez bir model patojen kullanılmıştır. Roman çok iyi biçim tahlil geliştirerek, gösterdiğimiz matris sertlik etkisi enfeksiyon L. Monositogenez tarafından endotel hücrelerinin kantitatif akış sitometresi ve mikroskopi tarafından takip immunostaining ile değerlendirilebilir. Buna ek olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi kullanılarak, ana bilgisayar endotel hücre biyomekanik olarak L. Monositogenez enfeksiyon etkisini ele. Hücreleri, onların hücre dışı matriks biyomekanik Hofstede anlama yolunda önemli bir adım olan bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre, doku ilgili mekanik etkisi analizi için önerilen yöntem sağlar ve patojen bakteriler. Bu yöntem aynı zamanda paralel olarak her deney birçok çoğaltır gerçekleştirmek önemli olduğu için hücre biyomekanik ve yanıt-e doğru yüzey sertliği çalışmalar diğer türleri çok çeşitli geçerlidir.

Introduction

En hayvan dokularında komşu hücreleri ve hücre dışı matriks (ECM) eklemek genellikle yapisan hücrelerdir. Anchorage onların ECM hücrelerin çoğalması ve hayatta kalma1,2hücre için hücre hareketliliği değişen birçok hücresel süreçler için önemlidir. ECM hücresel anchorage ECM kompozisyon ve sertlik üzerinde bağlıdır. Dinamik olarak yeniden düzenleyerek kendi sitoiskeleti, buna karşılık eleştirel alter hücre biyomekanik ve işlevleri3,4,5,6 hücre-ECM ve hücre-hücre yapışıklıklar hücreleri ikinci değişikliklere yanıt . ECM sertlik alanı (yani, anatomik konumu), zaman (yani, yaşlanma) ve patofizyolojik işlemleri (Örneğin, damar sertliği, kanser, enfeksiyon, vb) değişebilir. Örneğin, yaygın olarak bu endotel kabul edildikten bulunan hücreleri daha sert-yumuşak matrisler ile karşılaştırıldığında artan kuvvetleri onların ECM ve birbirlerine uygulamak ve artan hareketliliği ve nükleer silahların yayılmasına karşı7,8sergilemek. Aynı şekilde, daha sert matrisler üzerinde ikamet eden fibroblastlar yüksek contractile kuvvetleri onların ECM vermek ve artan nükleer silahların yayılmasına karşı hareketliliği ve ECM üretimi9,10,11göster. Hücre mekaniği ve ECM sertlik yanıt kapsamlı için çeşitli hücre tiplerinin, yapisan konak hücreleri arasındaki ilişki incelenmiştir onların ECM ve bakteriyel enfeksiyonlar sertliği hala büyük ölçüde bilinmemektedir.

ECM sertlik bakteri konak hücre etkileşimleri rol çalışmaya, L. Monositogenez (Lm) modeli patojen seçildi. LM sistemik enfeksiyon çeşitli memeli ev sahibi olarak neden olabilir her yerde bir gıda kaynaklı bakteri var. Bu fakültatif intraselüler patojen Bağırsak epitel vasküler endothelia farklı türde çaprazlayan tarafından uzak organlara taşıyabilirsiniz. Kan - beyin bariyerini ihlal, Lm menenjit neden olabilir ve plasenta haçlar, o kendiliğinden kürtaj12,13neden olabilir. LM farklı konak hücre tipleri bulaşabilir ve çok farklı patojenik stratejileri kullanarak yapabilirsiniz. LM enfeksiyonu çoğunlukla epitel hücreleri, bağlamında daha az nasıl Lm-ebilmek bulaştırmak hakkında bilinen iken ve yan yol endotel hücreleri kan damarları14,15,16lümen astar çalışılmıştır. Ayrıca, hala nasıl Lm'ın yetenek bu konak hücreleri istila ve sonra yayıldı endotel hücreleri bulunduğu ECM sertliği gelen büyük ölçüde bilinmeyen 's. LM ve birkaç ek bakteriyel türler (yani, Rickettsia'nin parkeri) onlar için her ikisi de enfekte hücreleri onların sitoplazma istila ve hücre-hücre yayma17 kolaylaştırmak ev sahibi aktin sitoiskeleti yararlanmak , 18 , 19. bu ana bilgisayar aktin polimerizasyon yolları ile müdahale etmek ve onların ileri itiş16,20kolaylaştırmak aktin kuyruklu yıldız kuyrukları üretmek için sağlayan proteinler ifade aracılığıyla ulaşmak. Enfeksiyon sonucu olarak, dinamik olarak hala tam karakterize, potansiyel olarak onların ECM ve her sarfetmek fiziksel güçleri de dahil olmak üzere ana bilgisayar hücreleri biyomekanik etkileyen bir şekilde yeniden düzenlemek ana hücrenin aktin sitoiskeleti ihtiyacı diğer. Bu işlemleri incelemek için insan mikrovasküler endotel hücreleri (HMEC-1) modeli konak hücreleri üç nedenden dolayı seçilmiştir: 1. endotel hücreleri son derece mechanosensitive onlar sürekli fiziksel ipuçları21; değişen için sunulur olarak bilinmektedir 2. lm endotel hücreleri enfekte için istihdam stratejileri hala büyük ölçüde bilinmeyen22vardır; ve 3. HMEC-1 bir ölümsüzleştirdi hücre hattı ve bu nedenle, kolaylıkla kültürlü ve genetik manipülasyon için tabi.

Konak hücre bakteriyel enfeksiyon hücreleri cam veya önemli ölçüde çoğu hücreleri12,14,23fizyolojik ECM sert polistren yüzeylerde tohum tarafından okudu vitro çoğunlukla olmuştur. Enfeksiyon seribaşı olan sertlik fizyolojik ilgili bir matris hücre incelemek ve ECM sertlik hücreleri enfeksiyon üzerinde rolü bakteriyel patojenler tarafından aydınlatmak için ince imalatı dayalı yenilikçi bir yaklaşımla takip Çok iyi plakaları tunable sertlik microbead gömülü polyacrylamide hydrogels. Önerilen yaklaşım yenilik çok iyi biçimi nedeniyle aynı anda birden çok koşul izleme sağlar ve yüzeylerde inşa edilir belirli biçimi nedeniyle bir çok teknik ile uyumlu olduğunu yatıyor. HMEC-1 hücreleri bu protein kaplı hydrogels tohumlari ve içselleştirilmesi floresan olmak veya yapısal floresan olan farklı Lm suşları ile enfekte. ECM sertlik enfeksiyon duyarlılık ana bilgisayar HMEC-1 hücre üzerinde rolü akış sitometresi tarafından değerlendirilmiştir. Ayrıca, immunostaining ve floresan mikroskopi yapışan ve içselleştirilmiş bakteriler arasında ayırt etmek için kullanılmıştır. Son olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi (TFM) başarıyla Lm enfeksiyon konak endotel hücreleri sarfetmek çekiş stresleri üzerinde etkisi onların matrisler enfeksiyon sırasında tanımlamak için gerçekleştirildi. Sunulan tahlil daha fazla çalışmalar ECM sertlik etkisi enfeksiyon duyarlılık yapisan hücre farklı hücre hatları veya patojenler kullanarak etkinleştirmek için kolayca değiştirilebilir.

Protocol

1. üretim ince iki katmanlı Polyacrylamide (PA) Hydrogels çok iyi plakaları

  1. Amonyum Persülfat (APS) 10 g/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için distile ultrasaf suda çözülür. Aliquot ve mağaza kısa süreli kullanım (3 hafta) için 4 ° C'de çözüm.
    Not: Yukarıdaki çözüm hidrojel imalat öncesinde hazır olun.
  2. 24-iyi yemekler cam aktivasyonu
    1. (Bkz. Tablo reçetesi) 13 mm çap kuyu ile 24-şey cam alt plakalar için 1 h 500 µL iyi oda sıcaklığında başına 2 M NaOH ile kuluçkaya.
    2. Kuyu 1 durulama Ultrasaf Su ile x ve %2 (3-Aminopropyl) triethoxysilane 500 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) % 95 etanol her iyi 5 dakikadır.
    3. Wells 1 x tekrar su ile durulayın ve 30 dk. durulama için kuyu 1 500 µL % 0.5 oxazolidin, her şey için Ekle x su ile ve kapak ile 60 ˚C, kurulanın.

Figure 1
Resim 1 : Bakteriyel enfeksiyon tahlil değişen sertlik ince iki katmanlı floresan boncuk gömülü polyacrylamide (PA) hydrogels üzerinde ikamet eden konak hücre. A. cam coverslips kimyasal olarak hidrojel eki etkinleştirmek için değiştirildi. B. PA karışımları 3.6 µL cam dipleri yatırılır. C. karışım polimerizasyon etkinleştirmek için 12 mm dairesel cam coverslip ile kaplıdır. D. coverslip bir iğne şırınga kaldırılır. E. PA çözüm lastikteki ile 2.4 µL üzerinde alt katmanı eklenir ve dairesel cam coverslip ile şapkalı. F. bir arabellek kuyuda eklenir ve coverslip kaldırılır. G. UV ışınlama 1 h için sterilizasyon sağlar. H. Sulfo SANPAH içeren bir çözüm, o zaman UV altında 10 dk. beniçin yerleştirilen jelleri, tarihinde eklenmiştir. Hydrogels bir arabellek ile yıkanır ve sonra bir gecede kollajen ı. Jile inkübe. Hidrojel hücre medya ile equilibrated. K. konak hücreleri tohumlari. L. LM bakteri çözüme eklenir ve enfeksiyon Santrifüjü yolu ile eşitlenir. M. 1 h sonrası enfeksiyon bakteri çözümdeki uzakta yıkanır ve bir antibiyotik ile desteklenen medya eklenir. N. 4 h sonrası enfeksiyon Lm (JAT985) Floresanda başlar. O. HMEC-1 hücreleri onların matris ilişkisi kesildi ve çözümler akış sitometresi ölçümleri gerçekleştirmek için tüpler için transfer edilir. Not gün ve testin her adımı için yaklaşık kez ayrıca belirtilir. Bu rakam Bastounis ve Theriot59değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Polyacrylamide hidrojel imalat
    Not: Bkz. Şekil 1.
    1. 3-%10 % 40 hisse senedi akrilamid çözüm içeren sulu çözümler hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve 0,06 - % %2 0.6 stok BIS-akrilamid çözüm (tunable sertlik 0.6 arasında değişen hydrogels üretimi için Malzemeler tablobkz:) kPa 70 kPa için. Bkz. Tablo 1.
      1. 0.6 kPa hydrogels için % 3 akrilamid %0,045 BIS-akrilamid ile karıştırın. 3 kPa hydrogels için % 5 akrilamid %0.074 BIS-akrilamid ile karıştırın. 10 kPa hydrogels için % 10 akrilamid %0.075 BIS-akrilamid ile karıştırın. 20 kPa hydrogels için % 8 akrilamid %0.195 BIS-akrilamid ile karıştırın. 70 kPa hydrogels için % 10 akrilamid % 0.45 BIS-akrilamid ile karıştırın.
        Not: arzu PA hidrojel sertlik elde daha fazla bilgi başka bir yerde24,25,26,27bulunabilir.
    2. İki sulu çözümler her arzu hidrojel sertlik için hazırlayın. Çözüm 1 olmak hazırlamak boncuk-alerjik ve çözüm %0,03 0,1 µm çapı floresan mikro-(bkz: Malzemeler tablo) boncuk içerecek şekilde 2.
    3. Degas çözümleri 1 ve 2 15dk sağmak için vakum makineler tarafından polimerizasyon çözümler etkisizleştirmek için bilinen oksijen ortadan kaldırmak için.
    4. %0,6 %0,43 tetramethylethylenediamine (TEMED) ve 10 g/mL stok APS çözüm çözüm polimerizasyon başlatma etkinleştirmek için 1 olarak ekleyin. Hızlı hareket.
    5. Her şey 24-iyi yemeğin ortasına doğru çözüm 1 3.6 µL ekleyin (bkz. Adım 1.2 onun hazırlanması için).
    6. Hemen wells 12 mm tedavi edilmezse dairesel coverslips ile kapak ve çözüm 1 tam olarak polymerizes için 20 dakika oturmak izin.
    7. Yavaşça bir şırınga iğnesi coverslips kaldırılmasını kolaylaştırmak için onun ucunda küçük bir kanca oluşturulacak bir yüzeye dokunun. Şırınga iğne kullanarak coverslips kaldır.
    8. Eklemek ve %0,43 %0,6 10 g/mL stok APS çözüm TEMED çözüm 2. İlk katman üzerine karışımı 2.4 µL 24-iyi yemek her kuyuya Kasası.
    9. Çözüm 2 12 mm dairesel cam coverslips ile kapağı, yavaşça aşağı doğru ikinci katman kalınlığı emin olmak için bir çift forseps kullanarak basarak en az düzeydedir. Çözüm için 20 dk polimerize 2 atalım.
    10. 50 mM HEPES pH 7.5 500 µL her kuyuları için ekleyin ve cam coverslips şırınga iğne ve forseps ile kaldırın.
  2. Sterilizasyon, kollajen-kaplama ve polyacrylamide hydrogels denge
    1. UV-sterilizasyon izin vermek için maruz doku kültürü başlıklı 1 h için hydrogels.
    2. Hazırlamak bir karışımı %0,5 ağırlık/hacim sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, Tablo malzemelerigörmek) % 1 DMSO ve 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Bu çözümün 200 µL hydrogels üst yüzeyine ekleyin. Hızlı, oyunculuk sergilemek onlara için UV (302 nm) onları harekete geçirmek için 10 dakika için.
    4. Hydrogels iki kez 50 mM HEPES pH 1 mL ile yıkayın 7,5 =. Tekrar herhangi bir aşırı crosslinker emin olmak için gerekirse kaldırılır.
    5. Protein-kat 200 µL 0.25 mg/mL fare ile hydrogels kuyruk kollajen ben ( Tablo malzemelerigörmek), HEPES 50 mM. Üstte, oda sıcaklığında gecede kollajen çözümle hydrogels kuluçkaya.
      Not: su kaybı/buharlaşma önlemek için bir ikincil çevreleme çok iyi tabak yerleştirin ve doku çevreleme iç çevre suya batırılmış temizlik laboratuvar ekleyin.
    6. Bir epifluorescence veya confocal mikroskop 40 X amacı ile hydrogels kalınlığını ölçmek için kullanın. Bunu (cam yüzey nerede) z pozisyonlar alt yerini belirleyerek işe ve uçak (floresan boncuk yoğunluğu en yüksek olduğu yer) hidrojel top. Sonra yüksekliği belirlemek için z pozisyonlar çıkarmak.
      Not: Biz bir ters epifluorescence mikroskobu ve 40 X amaç sayısal diyafram 0.65 ile hydrogels kalınlığını ölçmek için kullanılır. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ölçümleri, (bkz: Şekil 2) hydrogels tam sertliği onaylamak için bu noktada da gerçekleştirilebilir.
    7. Hydrogels faizi hücrelerinin tohum önce medya 1 mL hydrogels ekleyin ve onları denge sağlamak için 1 h 30 dk 37 ˚C, kuluçkaya.
      Not: Bu medya nerede modeli konak hücreleri (HMEC-1) (bkz: Adım 2.1 Ayrıntılar için) kültürlü çünkü biz MCDB-131 tam ortama eklenen.

Figure 2
Resim 2: PA hidrojel sertlik ve boncuk dağıtım AFM ölçümleri. A. veri göstermek beklenen Young katsayısı (sertlik ölçüsü) PA hydrogels, akrilamid miktarı göz önüne alındığında ve BIS-akrilamid Young katsayısı AFM ile ölçülen karşı kullanılan (N = 5-6). Yatay çubuklar ortalama tasvir. Çünkü hydrogels çok yumuşak ve AFM ucuna yapıştırılan 0.6 kPa hydrogels sertliği ölçülen değil. B. Bu aşama görüntü konfluent HMEC-1 hücre ve boncuk karşılık gelen görüntü yumuşak 3 kPa-PA hidrojel en üst yüzeyinde gömülü. HMEC-1 numaralı seribaşı 4 x 105 hücre başına iyi bir konsantrasyon, 24 h için. C. bu görüntü Şekil 2B olarak ama sert 70-kPa PA Hidrojel üzerinde ikamet eden hücreler için aynıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. insan mikrovasküler endotel hücre kültür ve Hydrogels tohum

  1. Kültür HMEC-1 (insan, mikrovasküler endotel) MCDB-131 hücrelerde tam takıma % 10 fetal Sığır serum, epidermal büyüme faktörü 10 ng/mL, 1 µg/mL hidrokortizon ve 2 mM L-glutamin (bkz: malzemeler tablo ile MCDB-131 ortamı içeren ortam ).
  2. Hücreleri geçiş 40 kadar tutmak ve konfluent kültürler 1:6 her 3-4 gün ayrıldı.
  3. Bir gün önce deneme, kültür gemilerinin % 0.25 tripsin/EDTA kullanarak hücrelerden bağlantısını kesin. İlk yıkama hücreleri ve kültür gemileri 1 x ile steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ve % 0.25 tripsin/EDTA (100-mm çanak veya 75 cm flask, 60 mm çanak veya 25 cm şişe başına 1 mL başına 2 mL), uygun miktarda şişesi 5-10 dk 37 ° C'de kuluçka ekleyin onların substrat hücrelerden dekolmanı izin vermek için.
  4. Tripsin MCDB-131 tam ortam, damlalıklı yavaşça hücre kümeleri kadar kırmaya ve çözüm konik santrifüj tüpüne görüntülenmemesini istediğiniz hacmi ekleyerek etkisiz hale getirin.
  5. Yavaşça hücre hücreleri eşit olarak dağıtılır ve sonra çözüm 20 µL almak emin olmak için çözüm girdap ve çok nazikçe bir cam hemasitometre coverslip altında iki odaları doldurun.
  6. Çözüm için 500 x g, 10 min Santrifüjü kullanarak konik santrifüj tüpü bulunan hücre aşağı cips.
  7. 10 dk bekleme süresi sırasında bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Mikroskop kullanma, 10 X amacı ile hemasitometre kılavuz çizgileri odaklanmak ve sonra hücreleri bir 1 mm x 1 mm kare sayısını saymak için bir el taksitli sayacını kullanın.
  8. Hemasitometre başka bir 1 x 1 mm kareye hareket ettirin, içindeki hücreleri saymak ve sonra iki kez daha tekrarlayın. Dört ölçüm ortalamasını hesaplamak ve sonra ortalama 10 tarafından çarpın4. Son fiyat uygun hücre/mL centrifuged hücre süspansiyon sayısıdır.
  9. Konik santrifüj tüpü dışında sıvı hücre Pelet değil bozulur sağlarken kaldırın. MCDB-131 tam medya 4 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon, hücrelerde resuspend.
  10. Tohum ilk hangi ile hydrogels inkübe medya kaldırma ve hücre süspansiyon 1 mL her hidrojel ekleyerek hydrogels uzaklaştırılmış hücrelerde.

3. enfeksiyon L. Monositogenez ile insan mikrovasküler endotel hücrelerinin

  1. Ön hazırlık
    Not: aşağıdaki çözümleri önceden hazırlayın.
    1. Streptomisin, kloramfenikol ve gentamisin hisse senetleri
      1. 50 mg/mL streptomisin streptomisin sülfat 0.5 gr ağırlığında ve Ultrasaf Su tamamen 10 mL eriterek hisse senedi çözümleri hazırlayın.
      2. 7.5 mg/mL kloramfenikol kloramfenikol 75 mg tartma ve % 100 etanol tamamen 10 mL eriterek hisse senedi çözümleri hazırlayın.
      3. 20 mg/mL gentamisin Gentamisin sülfat 0.2 gram ağırlığında ve Ultrasaf Su tamamen 10 mL eriterek hisse senedi çözümleri hazırlayın.
      4. Filtre sterilize-tüm hisse senedi çözümler 0.2 µm şırınga filtre ile ve uzun süreli kullanımı (1-2 ay) için-20 ° C'de depolayabilirsiniz.
    2. Beyin kalp infüzyon (BHI) medya ve ağar kaplamalar
      1. İki 1-L şişe bulun ve manyetik heyecan bar her şişesi içinde ekleyin.
      2. BHI medya için bir şişeye 37 g BHI tozu ekleyin ve 1 L. Mix kadar Ultrasaf Su çözüm şiddetle toz eriyene kadar manyetik heyecan tabağa şişeye koyarak ekleyin.
      3. BHI agar plakalar için 37 g BHI toz ve Toz agar 15 g ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ikinci balonun içinde ve 1 L. Mix kadar Ultrasaf Su çözüm şiddetle toz eriyene kadar manyetik heyecan tabağa şişeye koyarak ekleyin.
      4. Şişe kapakları çok sıkı vida ve basınçlı kap ayarlama veya basınçlı kap'ın özelliklerine göre sıvı kullanarak çözümler.
      5. Çözüm otoklav kaldırın, sonra agar-BHI çözüm ile 55 ° c sakin 1 L şişeye BHI medyada steril tutuluyorsa, için kullanılabilmesi için bir ay kadar.
      6. Bakteri agar-BHI tabak hazırlamak, ilk antibiyotikler, uygunsa BHI ve agar (bağlı olarak yetiştirilmeye bakteri suşları) içeren şişeye ekleyin. Kısa bir süre şişeye hızlı karıştırma sağlamak için manyetik heyecan tabağa koy.
        Not: burada kullanılan antibiyotikler kullanılan Lm suşları özgüdür, ancak gerekli antibiyotik-ebilmek var olmak kullanılmış BHI agar levha. 10403S Lm suşları streptomisin için dayanıklı olduğu için biz 200 µg/mL ve kloramfenikol 7.5 µg/mL konsantrasyonu konsantrasyon streptomisin ekledi. Bu suşların olmuştur Kloramfenikol Asetiltransferaz açık okuma çerçevesi, dolayısıyla içeren bir plazmid ile Kloramfenikol direniş Birleşik.
      7. Karışımı 10 cm polistren bakteri kültürü tabak (tabak başına yaklaşık 20 mL) dökün. Baloncuklar kurtulmak için üst yüzey plakaların kısaca alev. Serin plakaları gecede, oda sıcaklığında.
      8. Ertesi gün, Kuru plakalarının ve onları 4 ° C'de depolayın
  2. Enfeksiyon L. Monositogenez ile insan mikrovasküler endotel hücrelerinin
    1. Üç gün önce enfeksiyon, çizgi Şampiyonlar Ligi dışarı süzün (-80 ° C'de depolanan) gliserol stoktan kullanılmak üzere 7.5 µg/mL kloramfenikol ve 200 µg/mL streptomisin, uygunsa içeren BHI agar tabağa.
      Not: bir vahşi-türü veya yapısal Floresan (için immunostaining JAT1045 kullanılan) ifade veya floresan ActA organizatörü (için akış sitometresi veya çekiş kuvveti mikroskopisi JAT983 veya JAT985 altında ifade mutant, zorlanma dışarı çizgili olabilir kullanılan)22.
    2. Ayrık koloniler (1-2 gün) oluşur kadar tabak 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Enfeksiyon, önceki gün istenen zorlanma gecede 150 devirde BHI medya kloramfenikol (uygunsa) 7.5 µg/mL ile 30 ° C'de sallıyorum büyümek.
      1. 15 mL konik santrifüj tüpü BHI medyada yer 5 mL 7,5 µg/mL kloramfenikol (uygunsa) ekleyin ve sonra steril bir 10 µL ucu kullanarak agar plaka bir koloni aşılamak.
    4. Ertesi gün, enfeksiyon, hemen önce bakteri çözüm 600 optik yoğunluğunu ölçmek örnek 1:5; sulandrarak tarafından nm (OD600) BHI içeren bir küvet yalnız boş hizmet etmek için kullan.
    5. Bir OD600 0.1 için gecede kültür sulandırmak ve, bakteri log fazı büyüme ulaşmak izin vermek için BHI medya kloramfenikol (uygunsa) 7.5 µg/mL ile 30 ° c 2 h için sallayarak kuluçkaya.
    6. OD600 0.2 - olması bekleniyor bakteriyel çözüm ölçmek 0,3. OD600 yüksekse, 0,2 için - seyreltik 0,3 ile BHI yalnız.
    7. Bakteriyel çözüm 1 mL microcentrifuge tüpüne götür. 4 dakika oda sıcaklığında Santrifüjü kullanarak 2.000 x g de aşağı spin. Süpernatant kaldırmak ve bakteriyel Pelet doku kültürü-grade PBS, doku kültürü başlıklı 1 ml resuspend. Onları aşağı vasıl 2.000 x g oda sıcaklığında 4 dk iplik tarafından iki kez daha fazla bakteri yıkayın. Süpernatant kaldırmak ve PBS 1 mL bakterilerde resuspend.
    8. 10-50 µL PBS içinde 1 mL MCDB-131 tam medya için enfeksiyon (MOI; çokluğu ile resuspended bakteri karıştırılarak enfeksiyon karışımı hazırlayın yani, konak hücre başına bakteri sayısı) konak hücre veya 10 bakteri konak hücre başına ücret yaklaşık 50 bakteri.
    9. Medya 24-şey kaplamalar, hydrogels veya hücreleri bozmaya değil dikkatli kuyulardan kaldırın. Hücreleri 1 yıkama x 1 mL MCDB-131 ile tam medya ve her şey için bakteri 1 mL ekleyin.
    10. MOI belirlenmesi için bazı enfeksiyon karışımı (en az 100 µL) tutmak (bkz. Adım 3.3).
    11. Kapağı ile plaka kapak ve tabakları kaçağı önlemek için polietilen gıda film ile sarın. Tabakları santrifüje yerleştirin ve örnekleri istila eşitlemek için 200 x g, 10 min için spin. Tabakları doku kültürü kuluçka makinesi taşımak ve onları 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
    12. Örnekleri 4 yıkama x MCDB-131 ile tam medya ve doku kültürü kuluçka makinesi taşıyın. Ek bir 30 dk sonra 20 µg/mL ile gentamisin desteklenen medya ile ortamı değiştirin.
  3. Enfeksiyon (MOI) çokluğu belirlenmesi
    1. Sırasında ilk 30 dk kuluçka konak hücre bakteri ile 10 kat seri dilutions MOI belirlemek için enfeksiyon karışımı hazırlayın. 1 x PBS (10-1 seyreltme) 900 µL ile 100 µL enfeksiyon karışımı karıştırarak 10 kat dilutions olun. Sonra 10-1 seyreltme 100 µL PBS (10-2 seyreltme) 900 µL ile karıştırın.
    2. 10-5 seyreltme elde kadar devam edin.
      Not: Tüm çözümleri de sulandrarak onları önce karışık olması gerekir ve taze temiz pipet ipuçları her adımda kullanılmalıdır.
    3. Dilutions yapıldıktan sonra 10-2 - (uygunsa) BHI/agar/kloramfenikol/streptomisin plakaların Merkezi'nde 10-5 dilutions 100 µL yerleştirin.
    4. Cam Pipet üzerinden bir dağıtıcı bir kanca oluşturmak için pipet eğmek için ateş kullanarak yapın. Pipet sterilizasyon için % 100 etanol içinde daldırma ve etanol ile bir alev sonra yakmak.
    5. Yayıcı soğuduktan sonra homojen plakaları 10-5 seyreltme başlayan ve daha yoğun karışımları için hareketli bakteriyel dilutions yayıldı. Plakayı baş aşağı 37 ° C'de 2 gün kuluçkaya.
    6. Koloni yoğunluğu bağlı olarak, koloniler 10-3 ve 10-4 veya 10-4 ve 10-5 seyreltme tabak sayısını belirleyin. MOI aşağıdaki gibi hesaplar:
      eklendi kolonileri × seyreltme faktörü ÷ birimin ilk numara µL başına CFU sayısı =
      sayısı CFU bakteri Mix iyi başına µL × birim başına iyi başına CFU sayısı =
      hücre başına iyi de × birim başına CFU sayısı = bakteri hücre başına sayısı
      Not: CFU koloni kurma anlamına gelir birimleri.
    7. Son MOIs elde etmek için MOIs iki tabak üzerinden ortalama.

4. konak hücre hücre dışı matriks sertlik enfeksiyon bağımlı duyarlılık ölçmek için akış sitometresi

  1. Collagenase 5 mg tartmak ve bir 15 mL konik santrifüj tüpü yerleştirin. 10 mL % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve iyice karıştırın.
  2. 8 h sonrası enfeksiyon, medya 24-şey plaka kuyulardan kaldırmak ve kuyu 1 yıkama x doku kültürü PBS ile. PBS kuyulardan kaldırın ve her şey için 200 µL tripsin-EDTA/collagenase karışımı ekleyin. Bu hücrelerin tam dekolmanı izin vermek 10 min için doku kültürü kuluçka yerleştirin.
  3. Her şey ve damlalıklı karışımı 8 x yukarı ve aşağı için taze bir pipet kullanın. Hücreleri zarar vermemesi için nazik ol. Tam ortam 200 µL tripsin nötralize etmek için her şey için ekleyin.
  4. 35-µm hücre süzgeç kap ile 5 mL polistren tüp içine 400-µL hücre çözümü her iyi transfer ( Tablo malzemelerigörmek).
  5. Örnek başına 10.000-20.000 hücre akış sitometresi tarafından analiz. Akış Sitometresi aracılığıyla veri toplama gerçekleştirmek ve ilgili ticari olarak mevcut yazılım kullanarak iyi başına enfekte hücreleri yüzdesini belirlemek. Hücre sayısı dağılımı toplu kapı için yan scatter araziler karşı ileri dağılım kullanın.
    Not: Bu tek hücre analizi sağlamak ve enkaz veya hücre birini veya üçüz kardeşler ortadan kaldırmak.
    1. Denetim bulaşmamış hücreleri floresan sinyalini ölçmek ve enfekte hücreleri autofluorescence hariç nüfusu kapısı.

5. Immunostaining ekstrasellüler bakteri, mikroskobu ve görüntü işleme

Not: Bu yaklaşım ECM-sertlik bağımlı bakteriyel yapışma bakteriyel içselleştirilmesi (istilası) ana bilgisayarlar içinde karşı ana hücre yüzeyine birbirinden ayırmak için takip eder.

Figure 4
Şekil 4 : Lm-enfekte HMEC-1 Immunostaining hücreleri istila karşı bakteriyel yapışma ayırt etmek için farklı sertlik hydrogels bulunan. Bu resimleri fark immunostaining Agösterilen temsil edici bir örnek göster. hücre çekirdeği (DAPI), B. tüm bakteriler (GFP) ve C. dış bakteri (Alexa-546). HMEC-1 hücreleri üzerinde yumuşak 3-kPa hidrojel konut. Okları, yalnızca yeşil kanal üzerinde gösterilir Bu yüzden içselleştirilmiş var bakteriler üzerine getirin. Veri D-F başvurmak için N = 20 resimleri için yumuşak 3-kPa ve sert 70-kPa hydrogels ve Dgöstermek üzerinde ikamet eden enfekte HMEC-1 hücreleri ele geçirdi. çekirdek başına toplam bakteri; E. içselleştirilmiş bakteri başına çekirdek; ve F. Invasion verimliliği (Toplam bakteri için içselleştirilmiş bakteri oranı). Yatay çubuklar data'nın ortalama tasvir. P-değeri hesaplanmıştır non-parametrik Wilcoxon sırası Sum testi ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. HMEC-1 hücreleri enfekte JAT1045 ile 30 dk sonrası enfeksiyon, yıkama (Lm yapısal yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eden) medya ile 4 x.
  2. Dördüncü yıkama sonra 1 mg/ml 1 µL Höchst boya ile 1 mL MCDB-131 tam medya mix ve hücre çekirdeği leke için her şey için ekleyin. 10 dk için doku kültürü kuluçka hücreleri yerleştirin.
  3. Hücreleri 1 yıkama x PBS ile. Oda sıcaklığı2820 dk fark immunostaining için bir sigara permeabilizing sabitleştirici ile düzeltmek.
    Not: Sabitleştirici 0.32 M sukroz, 10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA ve % 4 formaldehit (elektron mikroskobu grade) içerir.
  4. Hücreleri 1 yıkama x PBS ile. Örnekleri %5 Sığır serum albümin ile 30 dk için blok ( Tablo malzemelerigörmek) PBS içinde.
  5. Örnekleri ile bir anti-Lm 1 h için kuluçkayabirincil antikor (bkz: Malzemeler tablo) seyreltilmiş 1: %100 2 BSA içeren PBS içinde.
  6. PBS 3 örnekleri yıkama x ve sonra onları bir AlexaFluor-546 ile 1 h için kuluçkaya keçi-anti-tavşan ikincil antikor %1:250 2 BSA içeren PBS içinde seyreltilmiş ( Tablo malzemelerigörmek). Örnekleri 3 yıkama PBS x. Örnekleri 1 mL PBS görüntüleme için saklayın.
  7. Görüntü ve koşul başına 1.000'den fazla hücreleri çözümleyebilirsiniz.
    1. Disk görüntüsü için bir ters epifluorescence mikroskobu ile CCD kamera kullanmak, ( Tablo malzemelerigörmek) ve 40 X hava planı florit hava amacı 0.6 sayısal diyafram (NA) ile bir.
      Not: Güç % 25'e ayarlanır ve çekim hızı 100 Bayan için mCherry için kullanılan mikroskop filtreler vardır 470/525 nm, GFP 530/645 nm ve DAPI 395/460 nm, uyarma ve emisyon için sırasıyla. Kullandığımız mikroskop bir açık kaynak mikroskobu yazılım paketi29tarafından kontrol ediliyordu.
    2. Fark immunostaining için yapışık olarak tek tek hücreleri ile ilişkili tüm 'yeşil' bakteri say. 'Yeşil' ve 'kırmızı' (nedeniyle antikor bağlama) olarak sigara içselleştirilmiş bakteri say.
      Not: Biz özel bir komut dosyası ve CellC yazılım çalıştırarak çekirdek sayısı tanımlanır (bkz. Tablo reçetesi) bakteri30numaralandırılmasına için.

6. çok iyi çekiş kuvvet mikroskobu ve Monolayer stres mikroskobu

Figure 5
Şekil 5: Lm-enfekte HMEC-1 hücreleri üzerinde onların ECM enfeksiyon sırasında sarfetmek çekiş güçleri büyüklüğünü azaltmak. B deformasyon alanda gösterilir faz görüntü paneli A gösterir, C çekiş stres alan ve D şovları 20-kPa Hidrojel üzerinde ikamet eden hastalık bulaşmamış tek HMEC-1 hücreleri hücre içi gerilim alanlarını gösterir. Deformasyon Renk çubukları haritalar (µm), çekiş stres (Pa) haritalar ve hücre içi gerilimi haritalar (nNµm-1) ısı haritaları üst bölümü gösterilir. Üç temsilcisi zaman puan sütunları göstermek: 3, 8 ve 18 s sonrası enfeksiyon. E-H. Paneller A-D olarak ama Lm 300 bir MOI ile enfekte hücreler için aynı. Bakteri (kırmızı kanalı) görüntülerini hücreleri faz görüntülerde üst üste. TFM kayıtları aynı anda birden çok kuyu Imaging tarafından yapılmıştır. PIV pencere boyutu 32 piksel 16 bir çakışma ile yapıldı. Ölçek çubuğu 32 µm var. Bu rakam Bastounis ve Theriot59değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. 24-şey tabakta PA hydrogels hazırlamak (bkz. Adım 1). Tohum HMEC-1 (bkz. Adım 2) hücreleri ve onlarla JAT983 açıklandığı gibi yukarıdaki (bkz. Adım 3) bulaştırmak.
  2. Live-mikroskobu orta iyi'nın L-15% 10 fetal Sığır serum, epidermal büyüme faktörü 10 ng/mL ve 1 μg/mL hidrokortizon ilave tarafından hazırlayın.
    Not: ekstra MCDB-131 medya durumunda olduğu gibi eklemek gerekli değildir L-15 zaten 2 mM L-glutamin, içerir.
  3. 4 h sonrası enfeksiyon (içselleştirilmiş JAT983 Floresanda başladığında) 1 mg/ml 1 μL Höchst boya ile 1 mL L-15 tam medya mix ve hücre çekirdeği leke için her şey için ekleyin. 10 dk için doku kültürü kuluçka hücreleri yerleştirin ve sonra her bir kuyu 1 mL 20 µg/mL ile gentamisin takıma L-15 tam medya ile L-15 tam ortamı değiştirin.
  4. Kapak kapak ve yer içinde mikroskop'ın çevre odası ( Tablo malzemelerigörmek) equilibrated için 37 ˚C ile plaka.
    Not: görüntüsü için bir ters epifluorescence mikroskobu ile CCD kamera kullanmak, ( Tablo malzemelerigörmek) ve 40 hava planı florit hava amaç X 0,6 ile a na
  5. Çok kanallı hızlandırılmış görüntüleri floresan boncuk ve floresan bakteri ve faz kontrast görüntüler ana hücrelerinin her 10 min 4-12 h için edinme.
    Not: görüntüleme için güç % 25'e ve çekim hızı 100 Bayan için mCherry ve GFP için kullanılan mikroskop filtreleri (uyarma/emisyon) 470/525 nm ve 530/645 nm anılan sıraya göre.
  6. Kaydın sonunda, 500 µL % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), su her Wells ekleyin.
    Not: Hücreleri hidrojel ayrılacaktır ve elastik olduğundan hidrojel undeformed başlangıç durumuna döndürür.
  7. Hidrojel görüntüsünü alıp referans undeformed görüntü olarak kullanmak.
  8. Hidrojel iki boyutlu deformasyon, her an hızlandırılmış serisi her görüntü undeformed hidrojel başvuru yansıması ile karşılaştırarak parçacık İmaj Velosimetri (PIV)31, kullanarak süre belirleyin. Deney bağlı olarak üst üste ve uygun pencere boyutlarını kullanın.
    Not: Windows 32 piksel 16 piksel bir çakışma ile kullanılır.
  9. Hücreleri başka bir yerde32,33açıklandığı gibi hidrojel sarfetmek 2D çekiş stresleri hesaplayın.
  10. Çekiş stresleri monolayer gerginliği daha önce açıklandığı gibi34 PA hidrojel olan monolayer üzerinde yarattığı mukabele kuvvetleri tabi ince elastik tabağı mekanik denge denklemi çözerek hesaplamak bir ölçülen çekiş stresleri imzalanacak karşısında.
    Not: Ek bilgileri 1konusuna bakın.

7. kantitatif hızlandırılmış mikroskobu değerlendirin Extracellular-matris-sertlik bağımlı L. Monositogenez yayılması ile endotel hücreleri için

Figure 6
Şekil 6: hızlandırılmış nicel mikroskobu veri türlerini Lm yayma yoluyla HMEC-1 monolayers numaralı seribaşı yüzeyler üzerinde 3-kPa ve 70-kPa sertlik ile. A. bu paneli iki temsilcisi enfeksiyon foci 0, 200, 400 ile 600 dk görüntülerden görüntülenmeye devam eder. HMEC-1 cep monolayers faz kanal gösteriyor ve hücre içi Lm kırmızı kanal gösteriyor (bkz. adım 7 iletişim kuralı). B. Bu panel enfeksiyon odağı bir fonksiyonu olarak çizilen kapsayan dışbükey hull alanını gösterir. 3-kPa koşulu (kırmızı) odak alan büyüyor 70-kPa daha hızlı (yeşil). C. enfeksiyon foci 3-kPa PA yüzeyler üzerinde tohumlari HMEC-1 monolayers (kırmızı) büyüyen ve 70-kPa (yeşil) sertlik temsilcisi için zamanın bir fonksiyonu olarak enfeksiyon odağı kenarına ortasından mesafeyi radyal üzerindeki bu panel gösterir. Radyal hız (dr/dt) 70-kPa koşul için bifazik ama 3-kPa koşul için sabittir. D. radyal hız on bağımsız enfeksiyon foci ilk 200 dk için bu verileri gösterir. Kırmızı (3-kPa) ve yeşil (70-kPa) veri noktaları önceki panellerinde açıklanan iki resimde yamaçları tasvir. Yatay çubuklar data'nın ortalama tasvir. P-değeri hesaplanmıştır non-parametrik Wilcoxon sırası Sum testi ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. 24-şey tabakta PA hydrogels hazırlamak (bkz. Adım 1), (bkz: Adım 2) HMEC-1 hücreleri tohum ve gece JAT983 kültürler (bkz: Adım 3yukarıda) açıklandığı gibi büyür.
  2. Enfeksiyon, günün bakteriyel Pelet mL MCDB-131 tam medya başına 10 µL karıştırılarak enfeksiyon karışımı hazırlayın. Dikkatli bir şekilde medya 24-şey plakaları kuyulardan kaldırın ve her şey için 1,9 mL MCDB-131 tam ortam ve bakteriyel Mix 0.1 mL ekleyin.
    Not: Bu tahlil kullanılan alt MOI tek bir bakteri konak hücre istila başlatmak yayılma olayları analiz etmek gereklidir.
  3. Kapağı ile plaka kapak ve kaçağı önlemek için plastik bir şal ile kapatın. Tabakları santrifüje yerleştirin ve örnekleri istila eşitlemek için 200 x g, 10 min için spin.
  4. Tabakları doku kültürü kuluçka makinesi taşımak ve 5 min için kuluçkaya.
  5. Örnekleri 4 yıkama x ile kitle iletişim araçları ve doku kültürü kuluçka taşıyın. Bir ek 5-7 dakika sonra 20 µg/mL ile gentamisin desteklenen medya ile ortamı değiştirin.
  6. Açmak ve mTagRFP ifade açık okuma çerçevesi35sürücü actA organizatörü izin vermek için ek bir 5 h kuluçka plaka kuluçkaya.
  7. Live-mikroskobu orta iyi'nın L-15% 10 fetal Sığır serum, epidermal büyüme faktörü 10 ng/mL ve 1 µg/mL hidrokortizon ilave tarafından hazırlayın.
    Not: ekstra MCDB-131 medya durumunda olduğu gibi eklemek gerekli değildir L-15 zaten 2 mM L-glutamin, içerir.
  8. Mix 1 μL 1 mg/ml Höchst L-15 tam ortam 1 mL ile boya ve hücre çekirdeği leke için her şey için ekleyin. 10 dk için doku kültürü kuluçka hücreleri yerleştirin ve sonra her bir kuyu 1 mL 20 µg/mL ile gentamisin takıma L-15 tam medya ile L-15 tam ortamı değiştirin. Kapak kapak ve yer içinde mikroskop'ın çevre odası ( Tablo malzemelerigörmek) equilibrated için 37 ˚C ile plaka.
    Not: bir ters epifluorescence mikroskobu ile CCD kamera görüntüleme için kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek) ve 20 hava planı florit hava amaç X 0.75 ile a na Güç % 50'ye ve çekim hızı 50 Bayan için mCherry için kullanılan mikroskop filtreleri 470/525 nm uyarma ve emisyon için sırasıyla.
  9. Sertlik hydrogels değişen çoklu konumlarını nasıl Lm HMEC-1 monolayers yayılır izlemek için bir otomatik odaklama özelliğini kullanarak her 5 dk seribaşı görüntü.
    Not: CO2 sırasında görüntüsü kullanmak gerekli değildir L-15 HEPES ile tampon.

Representative Results

HMEC-1 hücre ECM sertlik bağımlı duyarlılık Lm enfeksiyon:
Değişen sertlik PA hydrogels, tüm yüzeyi kaplı kollajen ile ben, çok iyi cam alt tabakalarına Adım 1 Protokolü'nün içinde açıklandığı gibi inşa edilmiştir (bkz. Şekil 1). AFM ölçümleri gerçekleştirilen26,27 daha önce açıklandığı gibi hydrogels tam sertliği onaylamak için (bkz: Şekil 2). Son çalışmalar endotel hücre membran yerel uyumluluk 70 kPa (Örneğin, aort)36,37,38için, 1 kPa (Örneğin, beyin dokusu) arasında olabilir göstermiştir 39 , 40. bu nedenle, HMEC-1 hücreleri ile aşağıdaki sertlik matrisler üzerinde ikamet eden enfeksiyon test etmek seçti: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa ve 70 kPa. Her hidrojel sertlik için altı hydrogels sonuçları tekrarlanabilirlik değerlendirmek için fabrikasyon.

Akış Sitometresi ECM sertlik bağımlı duyarlılık HMEC-1 hücre Lm enfeksiyon değerlendirmek için kullanılan (bkz. Şekil 3). HMEC-1 hücreleri hücre içi bakteriler tek (bakınız Şekil 1 L - 1N) algılanmasını sağlayan bir floresan marker içselleştirilmesi (actAp::mTagRFP), sonra ifade eden bir Lm gerilme (JAT985) ile bulaşmış. JAT985 da ActA ActA aktin kuyruklu yıldız kuyrukları ve sonraki bakteriyel yayılması oluşumu için gerekli olduğundan hücre hücre yayılan bakteri devre dışı bırakılması, yoksun. 7 - 8 h sonrası enfeksiyon, HMEC-1 hücreleri enfeksiyon akış sitometresi kullanarak değerlendirildi. Tek hücre analizi sağlamak için hücre sayısı dağılımı toplu yan dağılım çizim karşı ileri kullanarak geçişli ve sonra ikinci bir perdeleme adım autofluorescence sergi hücreleri dışlamak için gerçekleştirildi (bkz: Şekil 3A - 3 C ). Şekil 3 ' te tasvir ilk sonuçlar HMEC-1 enfeksiyonu Lm ile yaklaşık iki kat olduğunu göstermek için yumuşak 0.6 kPa hydrogels üzerinde bulunan hücreleri ile karşılaştırıldığında sert 70 kPa hydrogels bulunan HMEC-1 hücreleri daha büyük (bkz: Şekil 3B - 3D). sert yumuşak matrisler ile karşılaştırıldığında bulunan HMEC-1 hücrelerinin artan Lm enfeksiyon duyarlılık nedeniyle olabilir: 1. HMEC-1; üzerine Lm yapışma arttı 2. artan Lm işgal içine HMEC-1; ya da 3. ikisini birlikte yukarıdaki meydana gelen. Hangi hipotez tutar sınamak için HMEC-1 hücreleri (3 kPa) yumuşak ve sert (70 kPa) hydrogels numaralı seribaşı ve yapısal Lm ifade GFP ile enfekte (bkz. Şekil 4A - 4 C). Örnekleri kısa bir süre sonra enfeksiyon tespit edildi ve dış (yapışan) bakteriler antikorları ile lekeli. Nicel mikroskobu kullanarak, önemli ölçüde daha fazla bakteri konak hücreleri sert yumuşak jeller (bkz. Şekil 4D) karşılaştırıldığında çalıştırabilen zaman HMEC-1'e bağlı kalarak vardır bulundu. Akış Sitometresi verilerle tutarlı, önemli ölçüde daha fazla bakteri vardır ne zaman sert yumuşak jeller (bkz. Şekil 4E) karşılaştırıldığında üzerinde konak hücreleri ikamet HMEC-1 tarafından içselleştirilmiş. Ancak, HMEC-1 hücrelere Lm (bakteri içselleştirilmiş/toplam bakteri sayısı) işgali verimliliği benzer yüzey sertliği ne olursa olsun (bkz. Şekil 4F).

Çekiş kuvveti mikroskopisi Lm-enfekte HMEC-1 hücre:
LM enfeksiyon HMEC-1 hücre enfekte konak hücreleri kendi bariyer bütünlüğünü etkileyen ek onların ECM ya da birbirlerine, gücünü de dahil olmak üzere, biyomekanik değişiklik. Bu durumda hücre-ECM çekiş güçleri ve hücre içi tensional kuvvetleri hesaplamak için Monolayer stres mikroskobu41 hesaplamak için çekiş kuvveti mikroskopisi32 kullanarak olabilir olup olmadığını değerlendirmek istedi. Şekil 5 deformasyon alanı, çekiş stres alan ve farklı zaman puan sonrası enfeksiyon, 20-kPa hydrogels bulunan HMEC-1 hücrelerinin hücre içi gerginlik alan haritalar gösteriyor. Rakamlar 5A - 5 D bakın bulaşmamış kontrol HMEC-1 hücrelere rakamlar 5E süre - 5 H bakın enfeksiyon 300 bakteri/hücreye eşit çokluğu, Lm ile enfekte HMEC-1 hücrelere. Bu hastalık bulaşmamış tek kontrol hücreleri için görülmektedir değil ise bu ön çalışma enfekte HMEC-1 hücreleri Lm, bir enfeksiyonla süresince büyüklüğü onların hücre-ECM ve hücre içi gerilmeler azaltmak öneriyor.

ECM sertlik bağımlı Lm yayma HMEC-1 monolayers arasında:
Hızlandırılmış mikroskobu etkisini araştırmak için kullanılan Lm yayma yoluyla HMEC-1 monolayers üzerinde matris sertlik vardır. LM monolayer yayılır gibi bir odak zaman (bkz: Şekil 6A ve Video Şekil 1 ve 2) bir fonksiyonu büyür enfeksiyon bakteri oluşturun. Enfeksiyon odağı alan bir dışbükey hull, bakteri42etrafında noktalar kümesi kapsayan en küçük dışbükey Çokgen çizim tarafından ölçüldü. L. Monositogenez hücre hücre yayılmış bir monolayer konak hücre aracılığıyla verimliliğini ölçmek için alan hiçbir standart ölçü olduğunu. Formanın verimliliği değerlendirmek için bazı ana hücreleri bir enfeksiyon odağı41yılında sayılır ve başkaları el ile enfeksiyon ana hücreleri43grup etrafında çizilmiş sınırları var. L. Monositogenez yayılan verimliliğini ölçmek için otomatik, tutarlı ve hesaplama açısından ucuz bir işlem olduğundan bakteri bir dışbükey çokgen çizmek seçtik. Böylece, o (bkz: Şekil 6B ve Video Şekil 1 ve 2) 3 kPa matrisler üzerinde seribaşı karşılaştırıldığında 70 kPa hydrogels üzerine tohumlari HMEC-1 hücrelerindeki enfeksiyon odağı alanındaki hafif bir düşüş bulduk. Enfeksiyon odağı büyüme oranı belirlemek için radyal mesafe bir fonksiyonu olarak enfeksiyon odağı alan kare kökünü alarak ve bu pi ile bölme çizildi. Bu matematiksel dönüşüm enfeksiyon odağı şekli kabaca dairesel44olduğunu varsayar. Odak büyüme hızını ölçmek için (yani, yamaç) her iki 3 ve 70 kPa matrisler için radyal mesafe değişim oranı ölçüldü. Bu yaklaşım enfeksiyon odağı daha hızlı ve tekdüze 3-kPa matrisler tohumlari HMEC-1 hücrelerdeki büyüdü aydınlatılmamıştır. Ancak, odak önemli ölçüde yavaş (ilk 200 dk) ve biraz daha yavaş (200-600 dk) (bkz. Şekil 6C) 70-kPa matrisler numaralı seribaşı hücreleri büyüdü. Nitekim, enfeksiyon odağı, ortalama olarak daha yavaş 70-kPa matrisler, özellikle ilk 200 dk sırasında iki kat büyüdü daha fazla veri çözümlemesi onaylandı (bkz. Şekil 6D).

Figure 3
Şekil 3 : Lm işgali HMEC-1 hücre ECM sertlik bağımlı duyarlılık ölçülen akış sitometresi kullanarak .  HMEC-1 hücreleri Lm (JAT985) ile enfekte ve enfeksiyon akış sitometresi tarafından analiz edildi. A. Bu panel ileri dağılım çizim temsilcisi HMEC-1 hücreler tek bir kuyudan geliyor için karşı tarafı gösterir. Toplu dağıtım hücre (solda) enkaz dışlamak ve birini kardeşler veya üçüz kardeşler (sağda) hücre için geçişi ile seçildi. B. HMEC-1 üzerinde yumuşak 0.6 kPa kaplama için bu grafik hücre başına Lm floresan yoğunluğu logaritması histogramını gösterir. C. bu grafik HMEC-1 sert 70 kPa hydrogels üzerinde kaplama için hücre başına Lm floresan yoğunluğu logaritması histogramını gösterir. Çubuk grafikler için N = 4-6 çoğaltır farklı renklerle gösterilir. Bulaşmamış kontrol hücreleri histogram mordur. Ne bulaşmışsa tanımlamak için kullanılan kapı kırmızı renkte gösterilir. MOI 100 ve enfeksiyon biçilen 8 h sonrası enfeksiyon. D. veri göstermek enfekte HMEC-1 hücreleri hidrojel sertlik karşı yüzdesi (N = 5). Yatay çubuklar data'nın ortalama tasvir. P-değeri hesaplanmıştır non-parametrik Wilcoxon sırası Sum testi ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video Figure 1
Video Şekil 1: hücre içi Lm (kırmızı kanalı) HMEC-1 hücre monolayer (faz) yoluyla yayılması numaralı seribaşı 3-kPa substrat. Hücreleri iyi'nın L-15 ortam içinde yansıma (% 10 FBS, gentamisin 20 µg/mL) bir çevre odası 37 ˚C equilibrated iç. Görüntüleri her 5 dk toplanmıştır. Bu videoyu izlemek için buraya tıklayın 15 kare/s lütfen film hızıdır. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video Figure 2
Video resim 2: hücre içi Lm (kırmızı kanalı) HMEC-1 hücre monolayer (faz) yoluyla yayılması numaralı seribaşı 70-kPa substrat. Hücreleri iyi'nın L-15 ortam içinde yansıma (% 10 FBS, gentamisin 20 µg/mL) iç çevre bir odası equilibrated 37 ° C'ye Görüntüleri her 5 dk toplanmıştır. Bu videoyu izlemek için buraya tıklayın 15 kare/s lütfen film hızıdır. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Young katsayısı (E, kPa) Akrilamid % (üzerinden % 40 hisse senedi) Bisacrylamide % (' % 2'stok)
0,6 3 0,045
3 5 0.075
10 10 0.075
20 8 0.195
70 10 0,45

Tablo 1. Polyacrylamide (PA) hydrogels değişen sertlik, kompozisyonu. Bu tabloda, hisse senedi % 40 akrilamid çözüm yüzdesi ve yüzdesini stok % 2 bis-akrilamid çözüm verilen sertlik (Young katsayısı, E) elde etmek için farklı sütunlarında belirtilmiştir.

Supplemental Material
Ek malzeme 1. Hesaplama hesaplanan çekiş gerilmeler hücre içi gerginliği. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Discussion

Hücreleri sadece da böylece etkileyen kritik hücre fonksiyonları ve davranışları45,46gen ifade ve protein faaliyetlerini, hücre morfolojisi etkileyen fiziksel çevre, yardımlar çeşitli hissedebiliyorum. Hücre ECM sertliği giderek hareket, farklılaşma, yayılması ve sonuçta hücre kader47,48,49önemli bir modülatör teşekkür ederiz. Hücreler ve onların ECM arasındaki karmaşık biyomekanik etkileşim anlamada birçok son gelişmeler rağmen az şey bilinmektedir hakkında nasıl çevre sertlik hücreleri duyarlılık bakteriyel enfeksiyona etkiler. Bu tür çalışmaları kolaylaştırmak için biz polyacrylamide hydrogels enfeksiyon deneyleri50ile uyumlu olan tunable sertlik, köklü imalatı dayalı bu roman çok iyi tahlil geliştirilmiştir. Geleneksel olarak, hücre doku kültüründe bir bakteriyel enfeksiyon cam veya yaklaşık 1-3 büyüklük en yapışık hücreleri8,51doğal ECM ağır olan polistren yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Burada açıklanan tahlil yeni karayolları fizyolojik ilgili çevre sertlik rejimi etkileşimlerde bakteri-host incelenmesi etkinleştirerek açılır.

Sunulan testin kavram kanıtı için HMEC-1 hücreleri modeli yapisan konak hücreleri ve Lm bir modeli bakteriyel patojen olarak olarak seçilmiştir. Ancak, tahlil için daha fazla çalışmaları durumunda uygun şekilde genişletilebilir. Bu tür çalışmalar farklı memeli yapisan ana hücre tiplerinin enfeksiyon bakteri ve virüsler de dahil olmak üzere ek patojenlerin içerebilir. Bu özel tahlil için jeller protein kaplı kollajen ile ben, ama ana hücre türüne bağlı olarak, ek faiz hidrojel ana hücrelerinin kolaylaştırmak için farklı ECM protein-kaplama, laminin veya fibronektin, gibi kullanmak mümkündür 52. konak hücre türüne göre değişir bir ek dikkate belirlenmesi için hidrojel sertlik aralığı olur. Sertlik aralığı belirli bir ana hücre tipi için fizyolojik ilgili nedir ve ne kadar iyi bir monolayer verilen sertlik hidrojel. şekillendirme barındıran verdiği bağlı olmalıdır Benzer şekilde, muayene olmak istediğiniz modeli patojen bağlı olarak hafif değişiklikler burada açıklanan enfeksiyon tahlil uygulanması gerekebilir.

Üretim polyacrylamide hydrogels24,50,53 bazı benzersiz özellikleri yatıyor için önceki yöntemleri ile karşılaştırıldığında tahlil yenilik önerilen enfeksiyon tahlil içine entegre. İlk olarak, hydrogels çok iyi cam alt levha, aynı anda birden çok koşul tarama sağlayan yanı sıra belirli yordamları Otomasyonu inşa edilir. Birden çok koşul aynı zamanda veya böyle bir yaklaşım, sonucunu konak hücre geçit ve ana bilgisayarlara bulaştırmak için eklendi bakteri kesin sayısı gibi faktörler tarafından etkilenmiş olabilir bu yana birden fazla çoğaltır çok önemli inceleyerek kontrolü, hangi sık sık değiştirmek bağımsız denemeler arasında. Ek bir benzersiz özelliği bu testin hydrogels yüksekliği yaklaşık 40 µm, hangi geleneksel mikroskobu kullanarak görüntüye ince olması. Biz başarıyla hem canlı cep mikroskobu ve hücre fiksasyon ve yüksek arka plan floresans tanıtımı olmadan görüntüleme tarafından takip immunostaining gerçekleştirebilirsiniz gösterdi. Son olarak, hydrogels ile bir tek odak düzlem sınırlı floresan lastikteki gömülü üst bir iki kat yapılır. Bu öznitelik görüntüleme sırasında müdahale odak ışık olacak sağlar. Boncuk varlığı onlar üniforma ve geliştirmek belgili tanımlık ifa TFM ve MSM24,32,41sağlamak için jeller yüzey topografyası muayene sağlar. TFM ve MSM, sırasıyla sertlik matrisler değişen üzerinde ikamet eden hücrelerin hücre-ECM ve hücre-hücre kuvvetleri hesaplamak mümkündür. Bu roman tahlil kullanarak, aynı anda her iki çevre sertlik ve enfeksiyon katkı karşılaştırarak fiziksel kuvvetlerin böyle ölçümleri yapmak mümkündür. Böyle bir yaklaşım, mekanik onun ders boyunca belirlenen ana bilgisayar cep telefonundan etkisi enfeksiyon kapmış. Ayrıca, hücre hücre içi stresleri evrimi MSM kullanılarak hesaplanabilir ve monolayer bariyer bütünlüğünü bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Son olarak, çok iyi tahlil doğası göz önüne alındığında, farmakolojik ve genetik tedirginlikler konak hücre mekaniği ve enfeksiyon arasındaki karmaşık etkileşim daha derinlemesine araştırmak için bir bakteriyel enfeksiyon ile aynı anda tanıtmak mümkün.

Doğal sınırlama tekniğin etkisi substrat sertlik yatıyor bir tane hücre proliferasyon oranı üzerinde olabilir. Tipik olarak, enfeksiyon deneyleri, konak hücre yoğunluğu farklı koşullar altında aynı olduğundan emin olmak ihtiyacımız var. Hücre yoğunluğu tek başına ana enfeksiyona yatkınlık üzerinde bir etkisi olabilir çünkü. Konak hücreleri kullanılan HMEC-1 hücreleri ne zaman hydrogels 24 h için numaralı seribaşı numarasına önemli bir fark gösterme. Ancak, farklı hücre tipleri fark yayılmasına bağlı olarak enfeksiyon studies önyargı hidrojel sertlik, sergi. Hücreleri monolayers oluşturmaz veya üzerinde de hydrogels, belirli hücre tipleri çok yumuşak matrisler (Örneğin, insan göbek kordonu endotel hücreleri veya Madin-Darby köpek böbrek seribaşı oluşur gibi eklemek değil benzer şekilde, enfeksiyon önyargı ortaya çıkabilir epitel hücreleri seribaşı 0,6-kPa hydrogels54,55üzerinde). Patojenler ile ilgili olarak bazı bakteriler (Örneğin, Borrelia burdgorferi) üzerine ekleyebilirsiniz ev sahipliği hücreleri ve onları işgal ama aynı zamanda onları transmigrate56. Biz henüz bu tahlil patojen hicret çalışmaları için çalışmaya devam eder, ancak bu mümkün görünüyor, endotel hücreleri PA hydrogels üzerinde tohumlari transmigrating nötrofil önceki çalışmalar57başarılı bir şekilde çalışması için dokümante edilmiş test etmedim. Akrilamid ve BIS-akrilamid24,25,26 uygun konsantrasyonlarda karıştırılarak verilen Young katsayısı polyacrylamide hydrogels üretmek nasıl gösteren çalışmalar yapılan bir çok olmuştur ,27. Ancak, özellikle bir değişen sertlik hydrogels üzerinde ikamet eden hücreler TFM deneyler yapmak istediği zaman, AFM veya diğer girinti teknikleri58ile hydrogels beklenen sertliği doğrulamak önemlidir. Beklenen değer hafif sapmalar kullanılan farklı bir çözücü veya yaşlı akrilamid hisse senedi çözümünü nedeniyle ortaya çıkabilir veya yolu AFM tarafından gerçekleştirilen (Örneğin, AFM uç şekli) ölçüleri vardır. Son olarak, burada sunulan yaklaşım konak hücreleri daha gerçekçi ve fizyolojik olarak ilgili 3D senaryodan farklı olabilir 2D matrisler üzerinde tohum üzerinde temel alır. Ancak, 3D jelleri tunable sertlik ile üretim, onları konak hücreleri ile tohum ve sonra onları patojenler ile bulaşmasını hala kapsar bazı teknik sorunlar. Yine de, biz yakın gelecekte biz enfeksiyon bir 3D ortamda çalışmak için geçerli tahlil uzatmak mümkün olacağını tahmin.

Ön sonuçlar ile birlikte açıklanan protokol sağlar bu roman tahlil enfeksiyon yapisan konak hücre patojen bakteriler nicel bir moda ve bir çok daha fazlası ile çalışmak için son derece yararlı bir araç olabilir kanıt özetlemek gerekirse, fizyolojik olarak ilgili ortamı daha önceden incelenecek. Tahlil akış sitometresi, immunostaining gibi bir çok teknik performansı ile uyumlu olmasıdır hydrogels önerilen kurulum yatıyor polyacrylamide imalatı güç ışık mikroskobu tarafından takip ve çekiş kuvvet mikroskobu. Tahlil patojenler, biz her iki tarafından patojenleri ana bilgisayarları enfekte stratejileri çözülüyor ve gelişimini kolaylaştıran önemli bir etkiye sahip olacaktır tahmin göre farklı yapisan ana hücre tiplerinin enfeksiyon ile ilgili çalışmalar için kullanılabilir. enfeksiyonlara karşı tedavi müdahaleler.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

M. teşekkür ederiz altbilgi, R. Lamason, M. Rengaranjan ve üyeleri, tartışmalar ve deneysel destek için Theriot Lab. Bu eser gelişmiş çalışma (F.E.O.), Stanford Yüksek Lisans Bursu (F.E.O.) ve Amerikan Kalp Derneği (E.E.B.) için NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam bursu tarafından desteklenmiştir. Akış Sitometresi Stanford paylaşılan FACS tesisinde gerçekleştirildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 137 yapışık memeli hücreleri bakteriyel enfeksiyon endotel akış sitometresi çekiş kuvveti mikroskopisi polyacrylamide hydrogels immunostaining yüzey sertliği
Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter