Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

El objetivo general de esta metodología es permitir la caracterización del efecto de la rigidez de la matriz extracelular sobre la infección bacteriana de las células adherentes de una manera altamente cuantitativa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo emergente de la biomecánica huésped-patógeno, como cuál es el papel de las fuerzas mecánicas en la modulación de la susceptibilidad a la infección bacteriana de las células huésped. Esta técnica ayuda a crear secuencias de video de lapso de tiempo de alta resolución mientras se proyectan simultáneamente múltiples condiciones y se automatizan ciertos procedimientos.

Para llevar a cabo la activación del vidrio de las placas de 24 pocillos, agregue 500 microlitros de hidróxido de sodio tumalo por pocillo de 13 milímetros de diámetro e incube las placas a temperatura ambiente durante una hora. Deseche el hidróxido de sodio y use agua ultrapura para enjuagar los pozos una vez. A continuación, añada 500 microlitros de trietoxisilano al dos por ciento en etanol al 95 por ciento a cada pocillo e incube durante cinco minutos.

Con agua, enjuague los pozos una vez. A continuación, añada 500 microlitros de glutaraldehído al 0,5% a cada pocillo e incube las placas durante 30 minutos. Después de enjuagar una vez con agua, seque las placas a 60 grados centígrados sin tapa.

Para fabricar hidrogeles de rigidez ajustable, prepare soluciones acuosas que contengan del 3 al 10 por ciento de una solución de acrilamida al 40 por ciento y del 06 al 6 por ciento de una solución de bis-acrilamida al dos por ciento, dependiendo de la rigidez deseada del hidrogel. Después de esto, agregue el agua. Para cada rigidez, la Solución Uno no contiene cordones, mientras que la Solución Dos contiene microesferas fluorescentes del 03%0,1 micrómetros.

Desgasifique las soluciones uno y dos al vacío durante 15 minutos para eliminar el oxígeno que inhibirá la polimerización. Luego, mientras actúa rápidamente, agregue 0.43% TEMED y 0.6% de la solución APS de 10 gramos por mililitro a la Solución Uno. Añade 3,6 microlitros de la solución en el centro de cada pocillo del plato de 24 pocillos.

Use inmediatamente cubreobjetos circulares de 12 milímetros para cubrir los pocillos y deje reposar la solución durante 20 minutos para que se polimerice por completo. Golpee suavemente la aguja de una jeringa sobre una superficie dura para crear un pequeño gancho en su punta para facilitar la extracción de los cubreobjetos, luego use la aguja para levantar los cubreobjetos. A continuación, agregue 0.43% TEMED y 0.6% de la solución APS de 10 gramos por mililitro a la Solución Dos.

A continuación, deposite 2,4 microlitros de la mezcla encima de los cubreobjetos circulares de 12 milímetros. Coloque los cubreobjetos circulares con una gota de Solución Dos encima de la primera capa de poliacrilamida y use pinzas para presionar suavemente hacia abajo para asegurarse de que el grosor de la segunda capa sea mínimo. A continuación, deje que la Solución Dos polimerice durante 20 minutos.

Agregue 500 microlitros de 50 milimolares HEPES pH 7.5 a cada uno de los pocillos y use la aguja de la jeringa y las pinzas para quitar los deslizamientos de la cubierta de vidrio. Para esterilizar los hidrogeles, colóquelos en una campana de cultivo de tejidos y exponga a los rayos UV durante una hora. Ahora, prepare una mezcla de 0.5%peso-por-volumen de Sulfo-SANPAH y 1% de DMSO y 50 milimolares HEPES pH 7.5.

Agregue 200 microlitros de la solución a la superficie superior de los hidrogeles. Luego, trabajando rápidamente, exponerlos a 302 nanómetros UV durante 10 minutos para activarlos. Utilice un mililitro de 50 milimolares HEPES pH 7.5 para lavar los hidrogeles dos veces, repitiendo si es necesario para eliminar cualquier exceso de reticulante.

Cubra los hidrogeles con 200 microlitros de colágeno I de cola de rata de 0,25 miligramos por mililitro y HEPES de 50 milimolares. Incubar los hidrogeles con el colágeno a temperatura ambiente durante la noche. Antes de sembrar las células de interés en los hidrogeles, agregue un mililitro de medio y equilibre a 37 grados centígrados durante una hora.

Para sembrar células endoteliales microvasculares humanas, después de cultivar y preparar una suspensión celular de acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio de los hidrogeles y luego agregue un mililitro de suspensión celular a cada pocillo. Después de preparar un cultivo nocturno de L. monocytogenes de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo de microcentrífuga y hágalo girar a 2.000 veces g a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Después de usar PBS de grado de cultivo de tejidos para lavar el pellet dos veces, use un mililitro de PBS para volver a suspender el pellet.

Prepare la mezcla de infección combinando 10 o 50 microlitros de la suspensión bacteriana con un mililitro de MCDB 131 medio completo para una multiplicidad de infección, o MOI, de aproximadamente 50 bacterias por célula huésped o 10 bacterias por célula huésped. Retire el medio de los pocillos de las placas de 24 pocillos, teniendo cuidado de no alterar los hidrogeles o las células. Use un mililitro de MCDB 131 full medium para lavar las células una vez, luego agregue un mililitro de las bacterias a cada pocillo.

Coloque la tapa en los platos y envuélvalos con una envoltura de polietileno para alimentos para evitar fugas. Centrifugar las placas a 2.000 veces g durante 10 minutos para sincronizar la invasión, luego incubar los cultivos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Con MCDB 131 full medium, lave las muestras cuatro veces y devuélvalas a la incubadora de cultivo de tejidos.

Después de 30 minutos adicionales, reemplace el medio con MCDB 131 medio completo suplementado con 20 microgramos por mililitro de gentamicina. Para llevar a cabo la citometría de flujo, ocho horas después de la infección, se retira el medio de los pocillos de la placa de 24 pocillos y se utiliza PBS de cultivo de tejidos para lavar los pocillos una vez. Después de la eliminación del PBS, agregue 200 microlitros de mezcla de tripsina EDTA colagenasa a cada pocillo.

Coloque la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 10 minutos para permitir el desprendimiento completo de las células. Después de pipetear suavemente cada pocillo ocho veces, agregue 200 microlitros de medio completo para neutralizar la tripsina. Transfiera los 400 microlitros de solución celular de cada pocillo a un tubo de poliestireno de cinco mililitros con una tapa de filtro de celdas de 35 micrómetros.

Análisis de las muestras por citometría de flujo. Después de sembrar células HMEC-1 en hidrogeles de Pa y tratar con gentamicina de acuerdo con el protocolo de texto, incube la placa durante cinco horas para permitir que el promotor de ActA se encienda e impulse la expresión del marco de lectura abierto mTagRFP. Cuatro horas después de la infección, mezcle un microlitro de un miligramo por mililitro de colorante Hoechst con un mililitro de medio L-15 completo y agréguelo a cada pocillo para teñir los núcleos.

Después de incubar las células durante 10 minutos, reemplace el medio con un mililitro de medio completo L-15 suplementado con 20 microgramos por mililitro de gentamicina. Visualice múltiples posiciones cada cinco minutos utilizando una función de enfoque automático para monitorear cómo se propagan las bacterias LM a través de monocapas HMEC-1 sembradas en hidrogeles de rigidez variable. Como se informa en este gráfico, se realizaron mediciones de AFM para confirmar la rigidez exacta de los hidrogeles de Pa preparados utilizando el protocolo de este video.

Aquí, las células HMEC-1 en matrices de diferente rigidez fueron infectadas con una cepa LM que expresa un marcador fluorescente después de la internalización que solo permite la detección de bacterias intracelulares. Las células se comprimieron utilizando el diagrama de dispersión de avance contra lado y un segundo paso de compuerta excluyó las células que exhibían autofluorescencia. El análisis de citometría de flujo reveló que la infección por LM fue aproximadamente dos veces mayor en los hidrogeles rígidos de 70 kilopascales frente a los de 0,6 kilopascales.

Para probar si el aumento de la adherencia de LM a HMEC-1 y el aumento de la invasión de LM a HMEC-1, o ambos, eran responsables del aumento de la susceptibilidad a la infección poco después de la infección con LM que expresa constitucionalmente GFP, se fijaron las células de HMEC-1 y las bacterias adheridas se tiñeron con anticuerpos. Como se muestra aquí, había significativamente más bacterias adheridas a HMEC-1 cuando las células huésped residen en geles rígidos en comparación con los geles blandos. De acuerdo con los datos de citometría de flujo, hay significativamente más bacterias internalizadas por HMEC-1 cuando las células huésped residen en geles rígidos en comparación con los geles blandos.

Una vez dominado, este ensayo se puede realizar en aproximadamente tres días, ya que se requieren largos pasos de incubación entre ellos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser lo más estéril posible para garantizar que los hidrogeles y las células huésped estén libres de contaminación. Siguiendo este procedimiento, también se pueden incorporar otros métodos, como la microscopía de fuerza atómica, para responder a preguntas como cómo cambia la rigidez de las células huésped tras la infección y si este efecto depende de la rigidez de la matriz.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mecanobiología exploraran el papel de las interacciones biomecánicas entre la célula huésped y el patógeno mediante el uso de diferentes células huésped, como las células epiteliales, y diferentes patógenos bacterianos, como Rickettsia parkeri. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar hidrogeles de rigidez sintonizable en placas de pocillos múltiples y cómo realizar el ensayo de infección. No olvide que trabajar con bacterias patógenas puede ser peligroso.

Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones, como insertar barreras entre el sitio de entrada y el patógeno, así como evitar la generación de aerosoles mientras se realiza este procedimiento.