Un modelo del cerrado-pecho para inducir constricción aórtica transversal en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de constricción aórtica transversal (TAC) a través de una toracotomía lateral. Esta técnica es un procedimiento quirúrgico mínimamente invasivo, cerrado pecho con el objetivo de simular la sobrecarga de presión y la insuficiencia cardíaca en ratones utilizando la configuración estándar de laboratorio de TAC.

Resumen

Investigación en hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca con frecuencia se basa en modelos de ratón de sobrecarga de presión inducidos por la TAC. El procedimiento estándar consiste en realizar una toracotomía parcial para visualizar el arco aórtico transversal. Sin embargo, el trauma quirúrgico causado por la toracotomía en pecho abierto modelos cambia la fisiología respiratoria como las costillas están disecadas y salió sueltas tras cierre de pecho. Para evitar esto, hemos establecido un acercamiento como mínimo invasor, cerrado pecho vía toracotomía lateral. Aquí nos acercamos a arco aórtico mediante el espacio intercostal 2^nd sin entrar en las cavidades del pecho, dejando el ratón con una lesión menos traumática para recuperarse. Realizamos esta operación usando configuración de laboratorio estándar para procedimientos de pecho abierto TAC con tasas de supervivencia igual. Aparte de mantener patrones de respiración fisiológica debido a lo cerrado del pecho, los ratones parecen beneficiarse, mostrando una recuperación rápida, como la técnica menos invasiva para facilitar un proceso curativo rápido y para reducir la respuesta inmune después de un traumatismo.

Introducción

Modelos de ratón se utilizan a menudo para mímico enfermedades humanas¹. Constricción aórtica transversal (TAC) se utiliza para inducir sobrecarga de presión y ventricular izquierdo hipertrofia². El modelo de TAC de tórax abierto en ratones fue validado por Rockman et al. ³ y el procedimiento quirúrgico es descrito en detalle por DeAlmeida et al. ⁴. anillamiento de la aorta transversa es más favorable en comparación con constricción aórtica abdominal debido a una porción más grande de la circulación puede compensar los efectos negativos de este último procedimiento².

Las bandas de la aorta transversa conduce a un aumento de la presión arterial en la aorta ascendente y la arteria braquiocéfala pero deja suficiente perfusión de los órganos a través de los vasos distales (es decir, la arteria carótida común izquierda, subclavia izquierda arteria y aorta descendente). Esto conduce a una mayor poscarga cardiaca y una tensión de la pared cardiaca elevada. La tensión de la pared disminuye posteriormente debido al engrosamiento de la fibra⁵. El cambio crónico en la hemodinámica cardiaca produce dilatación del ventrículo izquierdo y la adaptación. De esta manera la TAC crea un modelo reproducible de la hipertrofia cardiaca, llevando eventualmente a insuficiencia cardíaca.

El procedimiento estándar para TAC según lo descrito por DeAlmeide et al. ⁴ acerca del arco aórtico mediante una toracotomía superior parcial mediante disección de las costillas o el esternón y entrar en el mediastino y la cavidad pleural. Esto permite una buena visión de arco aórtico y sus ramas laterales. Por desgracia, no pueden ser reatadas las costillas disecadas, que deja flotar libremente y alterando la dinámica de la respiración.

Por lo tanto, establecimos un acercamiento como mínimo invasor del cerrado-pecho al arco aórtico mediante un abordaje lateral a través del espacio intercostal 2^nd . La mayor ventaja de este modelo es la capacidad de realizar TAC sin cortar incluso a través de las costillas. El trauma quirúrgico se limita a la incisión de la piel y la disección de los músculos intercostales. Este procedimiento minimiza el trauma en sí mismo y ayuda a mantener la estabilidad adecuada del pecho.

Aquí describimos un procedimiento paso a paso detallado para realizar la cirugía de la TAC en ratones sin realizar el total o la toracotomía superior. Doppler de alta frecuencia fue utilizado para asegurar el éxito de TAC como describió anteriormente ^6,7.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité de ética de animales experimentación LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374). Generalmente, este procedimiento se realiza en ratones adultos > 10 semanas de edad. Sin embargo, es posible realizar esta cirugía en animales más jóvenes así. Herramientas quirúrgicas deben ser esterilizados antes de su uso y todas las medidas deben realizarse bajo condiciones asépticas.

1. inducción de la anestesia y la intubación

1. Inyectar la buprenorfina 0.1 μg/g de peso corporal por vía intraperitoneal para aliviar el dolor. Repetir las inyecciones intraperitoneales de 0.1 mg/kg de buprenorfina cada 8 h para los próximos tres días después de la cirugía.
2. Para la inducción, coloque el ratón en una caja de inducción de la anestesia que está conectada con el vaporizador a 3,0% de Vol de isoflurano con un flujo de oxígeno de 1 L/min.
3. Asegúrese de narcosis profunda induciendo un estímulo táctil.
   Nota: Aumento de Vol % de isoflurano hasta un 5%, si no de la inducción de la anestesia o narcosis no es lo suficientemente profundo.
4. Pellizcar la cola del ratón para asegurar la ausencia de reflejo. En caso de ausencia total de reflejos, pesan el ratón para la configuración óptima del ventilador (ver 1.12).
5. Mueva el ratón a una mesa de operaciones de control de temperatura para mantener una temperatura corporal de 37 ° C durante todo el procedimiento.
6. Coloque la punta del ratón en un cono de plástico que está conectado a la caja de inducción de la anestesia para mantener narcosis.
7. Fijar los incisivos superiores del ratón con una sutura de nylon. Para fijar las extremidades con una cinta adhesiva.
8. Aplique presión en la pata trasera con la punta de las pinzas para asegurar una narcosis adecuada otra vez. En la ausencia de un reflejo de retirada continúe con los pasos siguientes.
   Nota: Aumentar volumen % de isoflurano si falla de la inducción de la anestesia o narcosis no es lo suficientemente profundo y esperar a que la ausencia del reflejo de retirada.
9. Coloque lubricante oftálmico estéril sobre la córnea para evitar la desecación bajo anestesia.
10. Lubrique la sonda rectal para evitar trauma rectal. Inserte una sonda de temperatura rectal para asegurar una temperatura de 37 ° C.
11. Depilarse la garganta y el pecho superior con crema depilatoria según las instrucciones del fabricante. Limpie la crema después de 1 minuto. Si es necesario, repita este paso hasta el éxito.
    Nota: Utilice torundas con punta de algodón en caso de sangrado.
12. Limpiar la zona depilada con etanol al 70%. Luego aplique povidona-yodo para la desinfección de la piel 3 veces y al menos 3 minutos.
13. Ajuste el ventilador a parámetros fisiológicos. Establecer la frecuencia respiratoria a 150/min y volúmenes de marea a 8-10 μl/g de peso corporal (BW).
14. Poner en un nuevo par de guantes estériles. Coloque el ratón debajo de un microscopio quirúrgico y colocar un paño estéril fenestrado sobre el ratón.
15. Haga una incisión en la piel en la línea media unos 3 mm debajo de la mandíbula hasta la costilla 2^nd . Identificar la línea media y los tejidos conectivos de la glándula submaxilar. Luego use fórceps intracapsular ángulo suavemente dividen la glándula en la línea media sin rodeos con dos pinzas y explorar el músculo traqueal.
16. Preparar la tráquea suavemente tirando de los músculos para traqueal aparte sin rodeos con fórceps intracapsular.
17. Tire de la lengua con unas pinzas para alisar la garganta para las condiciones de intubación fácil y suavemente inserte una cánula de intubación (1.2mm OD) dentro de la tráquea. Confirmar la intubación por la visualización directa del tubo dentro de la tráquea y comprobando el movimiento adecuado del pecho.
18. Ajustar la concentración de isoflurano tras la intubación para isoflurano 2% con un flujo de 1.0 L/min y 100% O₂.
    Nota: Si no deje de movimientos respiratorios o ratones de inicio móviles, primero aumenta la frecuencia respiratoria hasta 180/min. Si es necesario, aumentar la concentración de isoflurano hasta 3,5% secundario hasta que el ratón deja de respirar por cuenta propia. Evaluar pérdidas o inadecuado llenado del vaporizador como los problemas más comunes.
19. Como alternativa, realizar intubación como se sugiere en los siguientes pasos de la sub.
    1. Coloque el ratón sobre una mesa en un ángulo de 60°.
    2. Para fijar las extremidades del ratón con cinta adhesiva y reclinar la cabeza.
    3. Coloque una fuente de luz fría directamente sobre la piel por encima de la laringe.
    4. Tire suavemente la lengua con unas pinzas para visualizar las cuerdas vocales.
    5. Inserte un tubo de plástico de una cánula IV (24 G) a través de las cuerdas vocales y conecte el tubo de plástico a los ajustes del ventilador.
    6. Conecte el ventilador a la cánula para confirmar la intubación por movimientos de pecho synchrone.
       Nota: Si no deje de movimientos respiratorios o ratones de inicio móviles, primero aumenta la frecuencia respiratoria hasta 180 por minuto. Si es necesario, incrementar secundariamente la concentración de isoflurano hasta un 3,5% hasta que el ratón deja de respirar por cuenta propia. Evaluar fugas ó inadecuado llenado del vaporizador como los problemas más probables.

2. medición Doppler preoperatorio

1. Preparar ambas arterias carótidas que endecha adjunto a la tráquea tirando suavemente el tejido fino conectivo aparte con el fórceps.
2. Coloque la punta de la sonda MHz Doppler 20 con algún gel de ultrasonido estéril a la derecha y la arteria carótida izquierda en un ángulo inferior a 45°.
3. Gire lentamente la sonda se mueve lateral y medial para encontrar una señal Doppler e inclinar la punta de prueba para optimizar la señal.
4. Utiliza un software de Doppler para visualizar y almacenar velocidades de flujo en las arterias carótidas comunes derecha e izquierdas en un ordenador.

3. toracotomía

1. Utilizar un conjunto de guantes estériles para cada ratón individual para prevenir infecciones del sitio quirúrgico.
2. Ampliar la incisión de piel hasta el espacio intercostal 2^nd con una tijera.
3. Identificar visualmente el espacio intercostal 2^nd contando las costillas y luego penetrar sin rodeos este espacio con el fórceps intracapsular.
   Nota: La 1 costilla^st se encuentra debajo de la clavícula y por lo tanto no es visible porque el espacio intercostal 2^nd se encuentra entre la primera costilla visible (es decir, 2^nd costilla) y la costilla 3^rd .
4. Abra el espacio intercostal 2^nd con la ayuda de puntas de pinzas y coloque los retractores.
5. Ajustar los retractores con una banda de goma atada a la mesa de operaciones para tener una visión clara del timo.
6. En caso de sangrado una punta de algodón y presiona sobre los vasos superficiales por 2 min.

4. las bandas de la Aorta transversa

1. Ajuste la ampliación a 200% para identificar la línea media y los tejidos conectivos. Luego uso acodada pinzas para dividir suavemente el timo. Eliminar tejido graso hasta el arco aórtico se puede ver claramente.
2. Preparar un túnel con ángulo atar fórceps bajo la aorta transversal entre la arteria braquiocéfala y de la arteria carótida común izquierda (ver figura 1). Sujete el extremo de una sutura 6.0 con la ayuda de Pinzas finas y pase el hilo debajo del arco aórtico.
3. Tomar el hilo con la segunda pinza desde el otro lado del arco.
4. Corte un pedazo largo de 3 mm el largo de una 27 G para utilizar la aguja como un el espaciador para ligadura de TAC para los ratones un peso comprendido entre 19-25 g peso y una aguja de 26 G como un espaciador para los ratones > 25 g BW.
5. Con cuidado coloque al separador paralelo a la aorta transversa.
6. Preparar un nudo doble suelto en el espaciador y garantizar la óptima colocación del espaciador en paralelo a la aorta. Entonces el primer tiro de lazo y realizar rápidamente un segundo tiro contrario. Retire al espaciador con prontitud.
7. Para realizar simulacro ratones de control, seguir el mismo protocolo omitiendo la ligadura de la aorta.
8. Cerrar el espacio intercostal 2^nd con una sutura de polipropileno 6.0. Preste especial atención a los vasos subclavios cuando la ligadura.
9. Sutura de la piel mediante una sutura de polipropileno 6.0 en un patrón de sutura continua.

5. confirmación de ligadura acertada de la Aorta transversa

1. Colocar una sonda de MHz Doppler 20 en ambos lados del cuello en un ángulo de 45° en la sección 2.
2. Las velocidades de flujo en cada lado del documento.
   Nota: Un TAC exitoso puede ser validado por la velocidad de flujo Doppler como se muestra en la figura 2. Un cociente de la velocidad de flujo de 4-10 entre la arteria carótida derecha e izquierda generalmente garantiza adecuada TAC (ver figura 2).

6. cosecha de corazón

1. Inducen narcosis según pasos 1.2. y 1.3.
2. Coloque el ratón en una cámara de eutanasia y ajustar el flujo de dióxido de carbono para desplazar 10-30% del volumen/minuto.
3. Para fijar el ratón sobre una mesa de cirugía. Abrir el abdomen con tijeras y cosecha de sangre de la vena cava inferior con una cánula para su posterior análisis.
4. Cortar el diafragma y el hueso esternal con tijeras fuertes y quitar el corazón.
5. Remueva todo arterial y tejido conectivo antes de pesar el corazón.
6. Separa el ventrículo derecho y el septo del ventrículo izquierdo y pesan ambas muestras.
7. Congelación de ambas muestras de tejido en nitrógeno líquido.

Resultados

Un TAC éxito garantiza la inducción de sobrecarga de presión y la hipertrofia ventricular izquierda. Una validación especial de sobrecarga de presión se logra mediante la medición de la velocidad de flujo Doppler como se muestra en la figura 2. Mientras que la velocidad de flujo arterial preoperatoria es igual en ambas arterias carótidas, TAC provoca una velocidad aumentada de sangre en la arteria carótida derecha debido a la presión elevada en el ventrículo ...

Discusión

El inicio rápido de la hipertensión arterial debido a la TAC diferencia de hipertrofia clínicamente relevante causada por estenosis aórtica o hipertensión. Sin embargo, el uso de modelos animales pequeños para inducir insuficiencia cardíaca tiene muchas ventajas y es, por tanto, elegido por muchos investigadores¹¹. Este modelo de pecho cerrado mejora los modelos ya existentes de la técnica quirúrgica para inducir constricción aórtica transversal en ratones⁴.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Catéter de presión-volumen	Millar Instruments, EE. UU.	SPR-839
Ventilador de ratón	Harvard Apparatus GmbH, Alemania	Minivent - TYPE 845
Ventilador de ratón	Harvard Apparatus GmbH, Alemania	Conexión en Y con cánula de intubación OD 1,2 mm 73-2844
Vaporizador	Drä ger Medical AG&CO. KG, Alemania	19.3 Isofluran-Vaporizer (una versión más reciente está disponible bajo el número de catálogo  D-877-2010)
Microscopio	Leica Microsystems, Alemania	MZ 7.5
Fuente de luz	Schott AG, Alemania	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, EE. UU	Sutura de polipropileno BV-1 9,3 mm Sutura 3/8c	para cirugía
Seraflex	Serag Wiessner, Alemania	USP 5/0 schwarz;   IC108000	Sutura para constricción
Mesas de operaciones controladas por homeotermia	Harvard Apparatus GmbH, Alemania	Typ 872/3 HT con soporte de trípode y controlador homeotérmico Tipo 874; 73-4233
Sonda rectal flexible	Harvard Apparatus GmbH, Alemania	1,6 mm de diámetro exterior; 55-7021
Instrumento de visualización de señales Doppler Indus	Instruments, EE. UU.	Estación de trabajo de procesamiento de señales Doppler (DSWP) con módulo
Pinza intracapsular Arruga Altomed	, Reino Unido	A5400
Sonda Doppler	Indus Instruments, EE. UU	20MHz Sonda
Jaffe Retractor de tapa	Altomed, Reino Unido	A3513

. Doppler pulsado de 20 MHz. montada en tubo