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Artículo de método

Resección guiada por la imagen de Glioblastoma e implantación intracraneal de andamios sembrado células madre terapéuticas

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DOI:

10.3791/57452

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16 de julio de 2018

 ,  ,  , 
1Division of Pharmacoengineering and Molecular Pharmaceutics, UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Búsqueda de tumor terapéuticas las células madre mesenquimales (MSCs) muestran promesa como tratamiento para el glioblastoma invasor. El trasplante óptimo consiste en entrega de MSCs en la cavidad de resección de tumor en andamios. Aquí, preclínicas técnicas para estudio de tratamiento de MSC de glioblastoma se proporcionan como: resección tumoral guiada por la imagen; implantación de semillas MSC andamios; y seguimiento de la terapia postoperatoria.

Resumen

Glioblastoma (GBM), el cáncer cerebral primario más común y más agresivo, lleva una vida útil de 12 a 15 meses. La corta esperanza de vida es en parte debida a la incapacidad del tratamiento actual, que consiste en la resección quirúrgica seguida de radiación y quimioterapia, para eliminar focos de tumor invasor. Tratamiento de estos focos puede mejorarse con tumoricida humano las células madre mesenquimales (MSCs). MSCs presentan tropismo tumoral potentes y pueden diseñarse para proteínas terapéuticas expresa que matan las células del tumor. Los avances en modelos preclínicos indican que la resección quirúrgica induce la prematura pérdida MSC y reduce la eficacia terapéutica. Eficacia del tratamiento de MSC puede mejorarse mediante siembra de MSCs en un andamio poly(lactic acid) biodegradable (PLA). Entrega MSC en la cavidad de resección quirúrgica en un andamio PLA restaura retención celular, la persistencia y la matanza de tumor. Para estudiar los efectos de la implantación de semillas MSC PLA en GBM, es necesario un exacto modelo preclínico. Aquí proporcionamos un protocolo quirúrgico preclínico para la resección tumoral guiada por la imagen de GBM en ratones inmune-deficientes seguida por la implantación de semillas MSC andamio. MSCs están diseñados con construcciones lentivirales constitutivamente expresan y secretan terapéutica relacionadas con el TNFα inducen apoptosis ligando (TRAIL) así como la proteína verde fluorescente (GFP) para permitir el seguimiento fluorescente. Del mismo modo, las células del tumor U87 están diseñadas mCherry expresa y luciferasa de la luciérnaga, proporcionando fluorescente doble/luminiscente de seguimiento. Mientras que actualmente utiliza para la investigación de células madre mediado entrega de la terapéutica, este protocolo podría modificarse para investigar el impacto de la resección quirúrgica en otras intervenciones GBM.

Introducción

Glioblastoma (GBM) es el cáncer cerebral primario más común en adultos, con una triste supervivencia media de sólo 12-15 meses1,2,3,4,5. La supervivencia no ha mejorado significativamente desde 2005 cuando era el estándar clínico actual de máxima resección quirúrgica seguida de radiación y quimioterapia temozolomida concomitante y adyuvante de6,7. Este tratamiento proporciona a los pacientes con un alivio temporal de los síntomas, estándar de tratamiento invariablemente resulta en recurrencia como focos de cáncer invasor evaden resección y están protegidos por la barrera blood - brain (BBB) de terapias sistémicas. Estrategias que tienen como objetivo focos de tumor invasor mientras que eludir el BBB se necesitan urgentemente para obtener tracción contra esta agresiva y debilitante enfermedad.

Humanos las células madre mesenquimales (MSCs) prometen como droga vectores para GBM debido a su tumor nativo tropismo8,9. MSCs poseen receptores para y migrar hacia factores solubles que secretan los tumores, incluyendo el factor derivado de las células stromal 1α (SDF-1α), matriz metaloproteinasa-1 (MMP-1) y monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) entre otros10, 11 , 12 , 13. Ingeniería MSCs para expresar y secretar fármacos citotóxicos les permite aprovecharse como vehículos de entrega de drogas tumor-autoguiado hacia el blanco. MSCs ingeniería avanzar hacia focos de tumor invasor y proporcionan proteínas terapéuticas. Este enfoque ha demostrado viabilidad en una variedad de preclínica GBM modelos9,14. Sin embargo, la gran mayoría de estos modelos no incluyen la resección quirúrgica a pesar de la relevancia clínica de este componente. Los emergentes estudios con nuevos modelos de la resección revelaron que el retiro quirúrgico del tumor reduce la persistencia de las células madre que se inyectan directamente en la cavidad quirúrgica15. Pérdida de viabilidad resultó en menor eficacia, probablemente debido a disminuciones en la dosis y duración de medicamentos entregados a los focos de tumor invasor.

Para aumentar la viabilidad de la célula de vástago y el suministro de medicamentos, MSCs pueden ser sembradas en los andamios antes de la implantación. En este protocolo, biocompatible y reabsorbible electrospun nanofibras poly(lactic acid) (PLA) se utiliza como andamio para MSCs. PLA se flexiona y se adapta a la forma de la cavidad de resección al implante, que maximiza la cobertura terapéutica y minimiza la distancia MSCs debe viajar para llegar a las células del tumor. MSCs permanecen en el andamio durante la implantación y luego migran fuera del andamio hacia las células del tumor después de la implantación16,17. MSCs y los fármacos citotóxicos llevan entonces se acumulan en los focos de tumor. La entrega de droga citotóxica al tumor requiere MSC viabilidad y persistencia, los cuales son ayudados por la implantación en andamios.

En este procedimiento, se usan vectores lentivirales para inducir la expresión estable de fluorescentes (en vitro ) y bioluminiscente (en vivo ) marcadores en líneas de cáncer y células madre. La línea humana de GBM U87 está infectada con mCherry y firefly luciferase (U87 mCh-Fl) y el no-terapéuticos MSCs con GFP y renilla LUCIFERASA (MSC GFP-Rluc). La variante terapéutica de MSCs express relacionadas con el TNFα apoptosis induciendo ligand (MSC-TRAIL). CAMINO, una proteína secretada constitutivamente, se une a cerca de receptores de muerte de cáncer de las células e inicia la apoptosis caspase-mediado18.

Presentamos un protocolo para preclínica imagen guiada GBM resección quirúrgica y la implantación de semillas MSC andamios. En Resumen, ratones desnudos reciben una craneotomía seguida tres días más tarde por inyección stereotactic ortotópico de U87 mCh-Fl para establecer el tumor primario. El tumor engrafted crece durante un período de aproximadamente una semana. Andamios PLA se siembran con MSCs 48 h antes de la cirugía de resección. El tumor es resecado entonces bajo dirección de fluorescente, y el andamio de carga MSC se implanta en la cavidad de resección. Supervivencia de carga y el ratón de tumor luego seguimiento postoperatorio con bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen. Una línea de tiempo de estos procedimientos se proporciona a continuación (figura 1).

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Figura 1: línea de tiempo de los procedimientos de. Ratones al principio reciben una ventana craneal (día 0). Después de un período de recuperación de tres días, los tumores son implantados (día 3) y crecer durante aproximadamente una semana. Andamios se siembran con MSCs (día 8) dos días antes del procedimiento de implantación y resección de tumor (día 10). Progresión del tumor y la eficacia terapéutica se evalúan vía post-operatorio después de eso la proyección de imagen (día 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de North Carolina en Chapel Hill.

Nota: Este procedimiento se realiza en ratones con una craneotomía abierta, como una versión modificada del Protocolo por Mostany y Cailliau Portera19 en donde se descarta el tejido óseo que se extrae quirúrgicamente, dejando el cerebro accesible para el establecimiento y eventual resección de tumores GBM. Después de la craneotomía, tumores se establecen mediante implantación estereotáctica como se describe en Ozawa y James20. Implante de 1 x 105 U87 células Fl mCh en las siguientes coordenadas stereotactic (en mm de bregma): (2.5, 0, -0.5).

1. célula cultura y preparación de andamios

Nota: Los andamios deben estar preparados 48 h antes de la implantación en ratones. Los volúmenes siguientes se suministran por el andamio. Multiplicar las cantidades según sea necesario para andamios adicionales.

  1. Trocear los andamios PLA resección cavidad de tamaño (aproximadamente 2 x 2 mm). Los andamios se pueden cortar a mano con tijeras o utilizando una perforadora para repetibilidad.
  2. Esterilización por inmersión en etanol al 70% durante 15 min, seguido de inmersión en PBS. Colocar andamios en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina mientras prepara las células para la siembra.
  3. Levante el MSCs cultivadas con 0.05% tripsina (3-5 mL en un matraz T75). Incubar a 37 ° C durante 5 minutos, asegúrese de que las células han levantado, luego añadir 7-10 mL DMEM al matraz de inactivación de la tripsina.
  4. Transferir contenido del matraz a un tubo de centrífuga de 15 mL. Contar las células usando un hemocitómetro. 5 x 105 MSCs para cada andamio mediante centrifugación a 100 x g por 5 min de la pelotilla.
  5. Aspirar el sobrenadante y resuspender MSCs en 5 μl DMEM 5 x 105 células.
  6. Preparar los andamios para siembra acariciando los seco.
    1. Saque un andamio inmersión DMEM con pinzas y Coloque temporalmente en la tapa de la placa de la pozo 6. Levante el soporte de la tapa, dejando una gota de exceso DMEM.
    2. Coloque el andamio en la tapa otra vez en un lugar nuevo y seco. Repetir 3 - 5 veces, luego colocar el andamio parcialmente secado en una placa de 6 pozos nuevos para la siembra. Repita para cada andamio.
      Nota: Un andamio parcialmente secado proporciona celular óptima siembra resultados. Si el andamio está demasiado húmedo, las células Deslice el andamio y se adhieren a la placa bien abajo. Si el andamio está demasiado seco, la gota no se Esparza sobre el andamio entero, dando por resultado la distribución pobre de la célula inicial.
  7. Usando una pipeta, mezclar suavemente el frasco de células madre para homogeneizar la suspensión como algunas células pueden haber colocado en la parte inferior.
  8. Lentamente con una pipeta 2.5 μl mezclado suspensión MSC directamente sobre el andamio, creando una gota pequeña en la parte superior del andamio.
  9. Añadir 300 μL de DMEM a los bordes de cada pozo. Esto evitará la rápida evaporación de la gota de la célula. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos, permitiendo a las células a conectar al andamio.
  10. Con pinzas, con cuidado Voltee los andamios en la placa de la pozo. Suspensión de semilla 2.5 μl mezclado MSC (esto resulta en un total de 5 x 105 células sembradas por andamio). Incubar a 37 ° C durante 30 minutos, permitiendo a las células a conectar al andamio.
  11. Cubrir los andamios en DMEM mediante la adición de 2 mL en cada pocillo de la placa de 6 pozos. Levante suavemente los andamios para permitir medios fluya debajo de ellos. Incubar a 37 ° C en este estado durante 48 h antes de la cirugía de implantación.
  12. Revisar los andamios después de 24 h y agregar o cambiar los medios de comunicación si se observa excesiva evaporación o por decoloración debido al desequilibrio del pH.

2. guiada por fluorescencia de la resección y la implantación de andamio

Nota: Esterilizar todas las herramientas antes de inicializar la cirugía. Administrar analgesia profiláctica como se indica en el protocolo institucional de IACUC.

  1. Coloque el marco estereotáxicas en el escenario de un estereomicroscopio de disección de la fluorescencia.
  2. Anestesiar el ratón debajo de isoflurano inhalado en una cámara de inducción. Una vez anestesiados, asegure el ratón en el marco estereotáxicas con suministro de anestesia inhalada continua a través de un adaptador de cono de nariz del isoflurano. Mantener la temperatura corporal con una almohadilla térmica o sonda.
    Nota: 4-5% isoflurano es adecuado para la inducción y 2-3% es conveniente para el mantenimiento, pero esto debe ser adaptado y monitoreado para cada ratón.
  3. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para prevenir la resequedad de la córnea. Esterilizar el sitio de la incisión del cuero cabelludo con una serie de alcohol tres y tres toallitas de betadine.
  4. Pruebe el dedo pizca reflejo en cada extremidad y confirmar respuesta negativa para asegurar adecuada anestesia. Asegurar un ritmo respiratorio constante a aproximadamente 55-65 respiraciones por minuto.
  5. Con unas pinzas, pellizcar y levantar suavemente el cuero cabelludo. Hacer una incisión lineal rostral caudal de la línea media con tijeras quirúrgicas. Regar el sitio de la incisión con PBS y quitar la grasa subdérmica con un aplicador de punta de algodón en un movimiento de cepillado circular. Colocar la piel, que es totalmente visible la ventana craneal previamente establecidos.
  6. Pinchar suavemente la dura sólo interior a las fronteras de la ventana craneal utilizando una aguja de 18 G. Repita hasta que la incisión recorre completamente el interior de la ventana.
  7. Quitar la dura de peeling lejos con pinzas finas, revelando el parénquima subyacente y tumor.
  8. Localizar el tumor de mCh-Fl U87 apagando la luces de la habitación y encender el modo fluorescencia de Estereomicroscopio. Preparar para la resección por cargar una pipeta de 1-200 μL en el extremo de la tubería de una bomba de vacío.
  9. Encienda la bomba de vacío. Resecar el tumor aspirando suavemente tejido fluorescente hasta que no quede señal. Apague la bomba de vacío y deseche la punta de la pipeta. Activar la fluorescencia fuera y la sala de luces de nuevo.
    Nota: Para controlar el sangrado, irrigar con PBS frío y aplique presión constante con un aplicador de punta de algodón. En casos más severos, la cavidad de resección puede también ser temporalmente embalada con un agente hemostático como se quita después de que el sangrado se ha detenido seguido de otro riego de PBS.
  10. Inmediatamente antes de la implantación, sumerja lentamente un andamio PLA MSC-sembrado en PBS para eliminar no deseados de los medios de comunicación y componentes asociados. El andamio del implante en la cavidad de resección. Si es necesario, añadir 1 fibrinógeno de μl (67-106 mg/mL), seguido por la trombina μL 1 (625 400 U/mL) para garantizar el andamio en su lugar.
  11. Con la dura y la aleta de hueso desde la ventana craneal ya descartados, selle la herida simplemente por el cierre de la piel y la aplicación de pegamento quirúrgico. Quitar el animal de anestésico inhalado y permiten para recuperar en una superficie caliente.
  12. Ratón una vez ambulatorio, retorno a la jaula. Administrar analgésicos en horario aprobado por el IACUC. Repita el procedimiento para cada ratón.

3. postoperatorio proyección de imagen

  1. Usando la jeringa de insulina 28 G, inyectar a ratones con D-luciferin (150 mg/kg intraperitoneal).
  2. Esperar 10 minutos. Esto permitirá que el luciferin circular por todo el cuerpo y reaccionar con las células de cáncer expresan luciferasa en el cerebro para obtener la expresión de pico.
  3. Bajo anestesia isoflurano (según lo mencionado previamente), imagen de ratones en un sistema (BLI) para visualizar los tumores de la proyección de imagen de bioluminiscencia. Variar los tiempos de exposición necesarios (segundos a minutos) dependiendo del tamaño del tumor.
  4. Repita el procedimiento por imágenes según sea necesario para determinar la cinética de crecimiento del tumor. Seguir controlar la salud animal.
    Nota: Las MSCs terapéuticos constitutivamente expresará camino, matando a las células cancerosas y suprime el crecimiento total del tumor. Cada 2-5 días la proyección de imagen proporciona suficiente frecuencia para este propósito.
  5. Cuando se hayan cumplido los extremos previamente descritas en el protocolo IACUC, sacrificar ratones por perfusión de transcardial y recoger los tejidos para su análisis.

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Resultados

Las células del tumor U87 fueron manipuladas mCherry expresa y luciferasa de luciérnaga (U87 mCh-Fl) antes de la inyección y para permitir la resección guiada por imágenes y bioluminiscencia seguimiento (figura 2A-C). Células madre eran semejantemente diseñadas con diagnóstico GFP-Rluc (MSC-GFP) o GFP-ensayo terapéutico (MSC-TRAIL) y sembradas en los andamios PLA para confirmar la fijación y proliferación (Figura 2D

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Discusión

Cirugía puede completarse normalmente dentro de 30 minutos por ratón, dado que los siguientes puntos se toman en cuenta para maximizar la precisión y evitar errores de tiempo. En primer lugar, asegúrese de que el ratón esté colocado correctamente en el instrumento estereotáxicas antes de iniciar el procedimiento. Movimientos no deseados de la cabeza limita la precisión quirúrgica de la craneotomía, ubicación de la implantación del tumor y el grado de resección del tumor. Antes de la resección, quitar completamente la por...

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Divulgaciones

Los doctores Sheets, Bagó y Hingtgen tienen equidad en la terapéutica de Halcón que ha licenciado los aspectos de la célula de vástago y andamio tecnología de UNC Chapel Hill.

Agradecimientos

Los autores reconocen las contribuciones editoriales del Dr. Kathryn Pietrosimone. PLA los andamios fueron fabricados por el laboratorio del Dr. Elizabeth Loboa en North Carolina State University. Este trabajo fue apoyado por el fondo de investigación de cáncer de Universidad de la UNC Lineberger centro integral del cáncer la UNC traslacional y clínica Instituto de Ciencias (KL2TR001109, UL1TR001111).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solo para instrumento estereotáxico de ratónStoelting51730Mantiene una posición estable de la cabeza durante la cirugía
Microscopio estereoscópico de disección de fluorescenciaLeicaM165 FC Permite la obtención de imágenes en tiempo real del tumor durante la resección
Sistema de inyector estereotáxico integrado motorizado (ISI)Stoelting53315Permite una inyección precisa en el volumen y la velocidad de inyección de células tumorales
Adhesivo tisularVetbond 3M1469Pegamento quirúrgico para cerrar heridas cutáneas
Lágrimas artificialesAkorn664268 Evita que los ojos se sequen durante la cirugía
Webcol preparaciones con alcoholCovidien6818Esterilizar el sitio de la incisión
Exfoliante quirúrgico BetadinePurdue Fredick Company6761815117Esterilizar el sitio de la incisión
Aplicadores con punta de algodónFisherbrand23-400-115 Herramienta decirugía
Sistema de aspiración E-vacArgosEV310Bomba de vacío utilizada para resecar tumores
Fibrinógeno y trombina extraídos de TISSEELBaxterPara asegurar temporalmente el andamio en la cavidad de resección
IVIS Kinetic sistema óptico de imagen in vivoCaliper Life ScienceBioluminiscente imager
D-Luciferin sal de potasioPerkinElmer122799Agente de imagen in vivo

Referencias

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