Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.
Abstract
פרוטאזות יש כמה פונקציות ביולוגיות, כולל הפעלה/איון חלבון ועיכול המזון. המזהה פרוטאז ירידה לפרטים חשוב לחשוף פרוטאז פונקציה. השיטה המוצעת במחקר זה קובע פרוטאז ירידה לפרטים על ידי מדידת משקל מולקולרי של סובסטרטים ייחודי באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF). סובסטרטים מכילים iminobiotin, בעוד האתר cleaved מורכב חומצות אמינו, מרווח מורכב פוליאתילן גליקול. המצע cleaved יפיק משקל מולקולרי ייחודי בעזרת של חומצת אמינו cleaved. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי זה יכול להתבצע בסיר אחד באמצעות דגימות גולמי, הוא גם מתאים להערכת מספר דוגמאות. במאמר זה, אנו מתארים שיטה ניסיונית פשוטה ממוטבת עם דגימות שחולצו מן העכבר רקמת הריאה, כולל רקמות החילוץ, השמה של סובסטרטים עיכול לתוך דגימות, טיהור של סובסטרטים העיכול בתנאים שונים pH , או מידה של משקל מולקולרי של סובסטרטים באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת זיהוי היחודיות פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף, אשר יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות.
Introduction
פרוטאזות לווסת תהליכים פיזיולוגיים על ידי ביקוע חלבונים, הייזום של פעילות פרוטאז לתשמיש, המיקומים מוסדר1. לכן חשוב לזהות את הביטוי ואת הפעילות של רקמות שמווסתים באופן מקומי, וכן לפתח שיטה לגילוי פרוטאזות. פעולת השירות המוצע במחקר זה שמטרתו לזהות ירידה לפרטים פרוטאז במקביל גילוי פרוטאזות.
ישנן כמה שיטות לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים. שיטת azocasein הינו ידוע בשל השימוש בו הגילוי של פרוטאזות2 . מוגבלת יכולתו להשיג עוד מידע Zymography הוא שיטה לזיהוי פרוטאז מקיפה אחרת זה יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של פרוטאזות3, אבל זה לא יכול לשמש כדי לבחון המצע ירידה לפרטים. ירידה לפרטים פרוטאז יכול להיקבע על ידי מבחני spectrometric, באמצעות סובסטרטים כגון p-nitroanilide4, מבחני fluorometric, באמצעות קומרין סובסטרטים5 או מבחני פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6. שיטות אלה מאפשרות זיהוי חד-ירידה לפרטים של סובסטרטים הכלול לבאר בודדת. במחקר הנוכחי, יחודיות פרוטאז של רקמות תמציות נבדק בתנאים שונים, כמו תמציות אלה מכילים פרוטאזות מרובים. פרוטאז פעילות מוסדר על ידי מספר גורמים, כולל ה-pH, קואנזימים, prosthetic קבוצות של יון כוח. לאחרונה, שיטות מבוססות פרוטאומיקס שימשו לזיהוי פרוטאז ירידה לפרטים; לדוגמה, שיטת שדווחו על-ידי Biniossek et al. 7 משתמש את פרוטאום כדי לקבוע ירידה לפרטים המצע אפילו בתמציות גולמי ומאפשר נחישות מדויק של הפעילות המחשוף של פרוטאזות לזהות רצפים מרובים של חומצת אמינו8. עם זאת, שיטה זו אינו מתאים לניתוח של דוגמאות רבות. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשר עיבוד סימולטני של דגימות מרובות ושימוש של Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה לניתוח מדגם מקלה על זיהוי מהיר וקל של cleaved מצעים.
מאמר זה מתאר שיטה להעריך ירידה לפרטים פרוטאז באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף כדי למדוד את המשקל המולקולרי של מצעים ייחודי. הצורות מולקולרית של מצעים cleaved, יחד עם משקולות מולקולרית התיאורטי שלהם, מוצגים באיור 1 ושל טבלה 1. מחקרים קודמים השתמשו סובסטרטים המכיל מפרידי polyglycine וביוטין9; עם זאת, אלה סובסטרטים מתגברת כי ייתכן ביקע את רצף polyglycine על ידי אנזימים לזהות את רצף גליצין. בנוסף, בזיקה גבוהה בין אבידין ביוטין עלול להוביל קצב החלמה נמוכים. כדי לשפר את החסרונות האלה, במחקר זה שאנו מסונתז מצע ייחודי, אשר הולחן של פוליאתילן גליקול (PEG), iminobiotin, חומצת אמינו שיכול לזהות את האתר המחשוף (איור 1). להפלות בין חומצות אמינו של משקולות מולקולרי דומה, D-סרין נוסף בין חומצת אמינו ביותר באתר cleaved את מרווח פג.
N-מסוף של המצע סומן עם iminobiotin, המאפשרת טיהור זיקה מדגימות גולמי. השימוש iminobiotin במקום ביוטין הוא קריטי; ביוטין יש זיקה חזקה עם אבידין, דבר המתבטא המחירים נמוך השחזור של התווית על-ידי ביוטין מצעים מ שרף אבידין, בזמן אהדה של iminobiotin אבידין יכולים להשתנות על ידי ה-pH. התווית על-ידי Iminobiotin סובסטרטים יהיה לאגד אבידין בתנאים לעיל pH 9, בעוד אבידין משחרר התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים בתנאים להלן pH 4. לכן, iminobiotin שימש לטיהור זיקה10. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים באמצעות מצעים ייחודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים ניסויים בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה פרמצבטיקה ניהון וביצע בהתאם להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של האוניברסיטה פרמצבטיקה ניהון. הפרוטוקול הותאם עבור רקמות תמציות נגזר ICR עכברים. עכברים ICR נרכשו מ ניפון SLC בע מ (שיזוקה, יפן)
1. הכנת המצע התווית על-ידי Iminobiotin
המצע עובר סינתזה מוצק-שלב באמצעות קבוצה 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-מוגן חומצות אמינו כמפורט להלן11. השתמש בטבלה 2 כדי לקבוע המתחם-Fmoc נעשה שימוש, בהתאם להזמנה חומצת אמינו שלב של סינתזה.
- סיפוריכם 0.2 גר' Fmoc-NH-סאל שרף עם 10 מ"ל של N, N-dimethylformamide (DMF) בעמודה סינתזה.
- הוסף 5 מ של 30% פיפרידין DMF. רוק הפתרון עבור 10 דקות לדבוק Fmoc-הקבוצה.
-
בדוק Fmoc מחשוף עם החומצה trinitrobenzenesulfonic (TNBS) מבחן12: צינור TNBS DMF ו 10 µL של diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 מ מ2 מבחנה, ואז העברת כמות קטנה של שרף הזכוכית להוסיף 10 µL של 1%. שרף ביקע Fmoc לפתח צבע כתום.
- חזור על שלבים 1.2-1.3 אם התוצאה היא שלילית.
- לשטוף את השרף שלוש פעמים עם 5 מיליליטר DMF.
-
הוסף 5 מ של DMF המכיל mmol 0.3 של המתחם Fmoc המפורטים בטבלה מס ' 2 (החל מהמתחם נעשה שימוש בשלב 1), 0.3 mmol של O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 0.3 mmol של 1- הידרוקסי-1H-benzotriazole, monohydrate (HOBt) ו- 0.6 mmol של diisopropylethylamine (DIPEA). רוק הפתרון למשך 30 דקות לשלב זאת עם השרף.
- בדוק שלב זה עם הבדיקה TNBS. אם התוצאה היא חיובית, משמעות התגובה לא התקדם במידה מספקת, יש לחזור על שלב זה.
- לשטוף את השרף שלוש פעמים עם 5 מיליליטר DMF.
- חזור על התגובה התארכות מאת וחזור על שלבים 1.2-1.6, שינוי Fmoc-המתחם בשימוש בשלב 1.5 על פי בטבלה 2.
- להוסיף 1 מ"ל של מים 2.5%, 1% triisopropylsilane (TIS), ו- 2.5% ethanedithiol (EDT) בחומצה trifluoroacetic כדי לדבוק פפטידים מקבוצות שרף והגנה. רוק הפתרון עבור 60 דקות.
- לסנן, ולאסוף את פילטרט של צינור 50-mL.
- להוסיף 40 מ"ל אתנול diethyl קר, חנות בן לילה ב-20 ° C.
- צנטריפוגה g 4,000 x ב-20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לאסוף את גלולה.
- השתמש של desiccator עבור 3 שעות כדי להסיר את דיאתיל אתר.
- להוסיף 1 מ"ל של 50% acetonitrile מים, לפזר את פפטידים גולמי. Lyophilize הפתרון כדי להסיר חומצה trifluoroacetic. חזור על פעולה זו מספר פעמים.
-
לטהר את פפטידים משתמש בעמודה מחסנית סי18.
- הפעל את השרף בעמודה מחסנית סי18 באמצעות 3 מ"ל של acetonitrile (לחצן מצוקה).
- Equilibrate עם 5 מיליליטר 5% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H2O.
- לטעון את peptides סינתטי גס לתוך העמודה מחסנית סי18.
- לשטוף עם 10 מ"ל של 5% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H2O.
- Elute את הדגימות עם 3 מ"ל של 60% לחצן מצוקה, 0.1% TFA H2O.
-
בדוק את פפטידים על ידי מדידת משקל מולקולרי שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF.
- פיפטה 1 µL של eluent על צלחת היעד. מיד להוסיף רוויה α-cyano-4-hydroxycinnamic תמיסה חומצית (CHCA) ב- 50% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%
- יצירת גביש את התערובת על-ידי air-drying.
- רוכשים ספקטרה המונית של דוגמאות על פי הפרוטוקול של היצרן מכשיר.
- להגדיר באופן ידני MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כדי חיובית לשקף מצב.
- לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות CHCA, bradykinin קטע 1-7 (משקל מולקולרי monoisotopic = 756.3997 Da), ו אנגיוטנסין II (monoisotopic משקל מולקולרי = 1,045.5423 Da).
- לרכוש את ספקטרום המונית של peptides סינתטי ולאחר מכן להעריך על-ידי השוואתה עם משקל מולקולרי תיאורטי.
2. הכנת תמציות רקמות
- עזים ומתנגד זכר ICR עכברים בתוך תא שאיפה איזופלוריין ואמת הרדמה עומק באמצעות הבוהן צביטה. המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
- בעזרת מספריים, עושים חתך בבטן קו האמצע באמצעות הרחבת העור עד הסרעפת.
- לחתוך דרך הסרעפת ולאסוף את כל רקמת הריאה. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות.
- לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם סליין באגירה טריס כקרח 50 מ מ (pH 7.4).
- שוקלים את רקמות ואת העברת כ 100 מ ג של רקמות שפופרת זכוכית2 12 x 75 מ מ.
- הוסף mL 0.3 המאגר החילוץ (50 מ מ טריס-מאגר, pH 7.4, המכיל 0.1% פולי (oxyethylene) octylphenyl אתר).
-
Homogenize הדגימות רקמת הריאה באמצעות מהמגן ערבוב.
- מגניב הדגימות על קרח.
- Homogenize את הדגימות-20,000 סל ד ל 30 s בבלנדר. חזור על שלב זה עד הדגימות הומוגנית לחלוטין.
הערה: לא homogenize עבור יותר מ 1 דקה ללא הרף, על מנת למנוע עלייה בטמפרטורה.
- העברת 1,000 µL של homogenate צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 10,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
- העברת µL 500 של תגובת שיקוע צינור פלסטיק 1.5 מ.
- השתמש µL 10 המדגם כדי לקבוע ריכוז חלבון, שימוש בשיטות כגון bicinchoninic חומצה (BCA) או בשיטה Coomassie מבריק כחול (CBB).
- למניעת קיפאון, להוסיף 80% גליצרול הדגימות עבור ריכוז סופי של 50% גליצרול.
- לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.
3. העיכול של מצעים בשנת המודל פרוטאז ותמציות רקמות
-
להוסיף 10 µL של 0.1 µg µL של N-tosyl-L-פנילאלנין chloromethyl קטון (TPCK)-טריפסין, 0.1 µg µL של Staphylococcus aureus V8 פרוטאז או µg 10/µL של רקמת תמציות לתוך µL 890 של מאגר לעיכול.
- כדי להבהיר את ההבדל בין ירידה לפרטים פרוטאז בהתאם רמת החומציות, השתמש מאגרי להתאים ל- pH 3, 5, 7 ו- 9. ההרכב של המאגר עיכול מוצג בטבלה3.
- לבצע את פקד שליליים באמצעות פרוטאז לא פעיל בתמציות רקמות, שהוכנו על ידי דגירה מים רותחים (או חימום ב 100 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
- להוסיף 10 µL של סובסטרטים התווית על-ידי iminobiotin (מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), הריכוז הסופי = 100 µL pmol/10).
- תקופת דגירה של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס לעכל את התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים.
- לאחר דגירה, לעצור את העיכול של מצעים עם מים רותחים (או על ידי חימום ב 100 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
- Centrifuge של סובסטרטים מתעכל למשך 5 דקות ב 10,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
- להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש.
4. טיהור של המצע התווית על-ידי Iminobiotin
-
להוסיף µL 50 streptavidin 50% sepharose החרוזים 1 מ' טריס-buffer (pH 9) המכיל 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl אתר.
- השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח כי הפתרון הוא סביב ה-pH 9. אם ה-pH של התמיסה נמוכה, להתאים אותו כ ה-pH 9 על-ידי הוספת 1 מ' טריס-buffer (pH 9) המכיל 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl אתר. שלב זה חשוב, כפי שהוא כרוך קשירה של המצע התווית על-ידי iminobiotin כדי streptavidin.
- דגירה בין לילה ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב כדי לאגד את התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים streptavidin. החרוזים צריכים להישאר מושהה במהלך הדגירה.
- צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג'י x ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
-
לשטוף את החרוזים חמש פעמים כדלקמן:
- להוסיף 1,000 µL של חיץ לשטוף (50 מ מ טריס-buffer, pH 9) החרוזים.
- רחץ 10 דקות ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב. החרוזים צריכים להישאר מושהה במהלך הדגירה.
- צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- g x 10,000 ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.
-
להוסיף 100 µL של 0.2% חומצה trifluoroacetic החרוזים.
- השתמש בנייר בדיקת pH כדי להבטיח כי הפתרון הוא מתחת pH 2. אם ה-pH של התמיסה גבוה, להתאים את רמת החומציות אל מתחת 2 על-ידי הוספת חומצה trifluoroacetic 1%.
- תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין רציפה על גלגל מסובב.
- צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- g x 10,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.
5. לטעום והכנה לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF ספקטרומטר מסה)
הערה: כל הפתרונות בשלבים הבאים צריכים להיות מוכנים עם ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC)-מים רצף-כיתה כיתה או חומצת אמינו.
- פיפטה 500 µL של acetonitrile על גבי שרף סי18 כדי להפעיל אותו. הסר את acetonitrile משומשים. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- Equilibrate שרף סי18 עם 100 µL של 0.1% חומצה trifluoroacetic. להסיר את eluent. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- כדי לטעון את הדגימות, לאגד את הדגימות שרף באמצעות פיפטה.
- לשטוף את השרף עם 20 µL של 0.1% חומצה trifluoroacetic. חזור על שלב זה חמש פעמים.
- Elute את הדגימות עם 3 µL של 60% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%. Pipette את eluent על צלחת היעד עבור ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. מיד להוסיף רוויה α-cyano-4-hydroxycinnamic תמיסה חומצית (CHCA) ב- 50% acetonitrile בחומצה trifluoroacetic 0.1%.
- יצירת גביש את התערובת על-ידי air-drying.
-
רוכשים ספקטרה המונית של דוגמאות על פי הפרוטוקול של יצרן כלי.
- להגדיר באופן ידני MALDI-TOF ספקטרומטר מסה כדי חיובית לשקף מצב.
- לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות CHCA, bradykinin קטע 1-7 (משקל מולקולרי monoisotopic = 756.3997 Da), ו אנגיוטנסין II (monoisotopic משקל מולקולרי = 1,045.5423 Da).
- רוכשים את ספקטרום המונית של דגימות, הקדשת תשומת לב ספקטרום המונית בין 700 ל 900 Da עבור הטופס cleaved של סובסטרטים התווית על-ידי ביוטין.
- לזהות את הפסגות שזוהו באמצעות טבלה 1. זיהוי של משקל מולקולרי המתאים מציין המחשוף ב C-הסופית של חומצת אמינו רלוונטי ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של השיטה לזיהוי היחודיות פרוטאז על ידי מודל פרוטאז
היעילות של מערכת זו הוערך באמצעות TPCK-טריפסין ו- V8 פרוטאז, specificities המצע אשר התקבלו. TPCK-טריפסין, V8 פרוטאז הוערך כדי לבקע את רצף חומצות אמיניות בטרמינל-C של משקעי ליזין, ארגינין, על הצד carboxy של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית משקעים, בהתאמה. טבלה 1 מציגה את המשקל המולקולרי תיאורטי של המצע, מתעכל שברי ביקע על ידי פרוטאזות ספציפיים. המצע העיכול באמצעות TPCK-טריפסין הפיק cleaved שברים, שניים מהם יכול להתגלות 839.81 דה, דה 796.76 (איור 2 א). משקולות מולקולרית של קטעים אלה קובצו בקנה אחד עם משקולות מולקולרית תיאורטי של השברים ביקע ממסוף-C של ליזין, ארגינין, בהתאמה. בנוסף, פרוטאז V8 המרה קודמן סובסטרטים לטופס cleaved, עם משקולות מולקולרית של 769.78 דה, דה 755.62 (איור 2B), אשר מתאימים תאורטית מ/z של חומצה גלוטמית וחומצה אספרטית, בהתאמה. תוצאות אלה מציינים כי בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות בהצלחה ירידה לפרטים פרוטאז עם MALDI-TOF ספקטרומטר מסה.
הערכה היחודיות המצע ברמות pH שונים באמצעות העכבר ריאות תמציות
אחד היתרונות של שיטה זו היה כי מספר רב של דוגמאות ניתן לעבד בו זמנית. מחקר זה הראה כי ירידה לפרטים המצע שונה על פי רמת החומציות (איור 3). בתנאים חומציים (איור 3B; pH 5), המשקל המולקולרי של קטע cleaved היה 770.13 Da 826.66 Da. תוצאות אלו ציינו כי התמצית רקמת הריאה כולל פרוטאזות עם היכולת קליב-קצה קרבוקסילי של חומצה גלוטמית ו טריפטופן. ככל שרמת החומציות בהדרגה, הפסגות של שברי ביקע על ידי חומצה גלוטמית ו טריפטופן ירד בהדרגה, ואילו פסגות של קטעים ביקע מאת ארגינין, ליזין בהדרגה גדל (איור 3C, D; pH 7 ו- 9). תוצאות אלו ציינו כי תמצית ריאות הכיל פרוטאזות שניים או יותר שהיה שונה אופטימום specificities pH והמחשוף.
איור 1: סכימה עבור זיהוי היחודיות פרוטאז. (א) המבנה של התווית על-ידי iminobiotin סובסטרט של פרוטאז ירידה לפרטים. (B) סובסטרטים היו iminobiotin, כרווח פוליאתילן גליקול, אתר cleavable חומצת אמינו. (ג) הספקטרום של סובסטרטים התווית על-ידי iminobiotin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הערכה של השיטה לקביעת פרוטאז ירידה לפרטים באמצעות אנזים מטוהרים. (א) הספקטרום עבור התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים שטופלו TPCK-טריפסין. הפסגות 839.81 ו- 796.76 מתאימים את המשקל המולקולרי תיאורטי של קטעים שנוצרו על-ידי פצילות לצד ג'-מסוף ליזין, ארגינין, בהתאמה. (B) הספקטרום עבור התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים מטופלים עם V8 פרוטאז. הפסגות 769.78 ו- 755.62 מתאימים את המשקל המולקולרי תיאורטי של קטעים שנוצרו על-ידי פצילות לצד ג'-מסוף חומצה גלוטמית וחומצה אספרטית, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הערכה של השיטה לקביעת פרוטאז ירידה לפרטים באמצעות רקמות תמציות. הספקטרום עבור התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים מטופלים עם רקמת הריאה לחלץ. ספקטרה אלה מראים פסגות שהושג ב pH (א) 3, ה-pH (B) 5, ה-pH (ג) 7 ו pH (D) 9. (E) iminobiotin עם התווית סובסטרטים מודגרות עם תמצית רקמה לא פעיל עם טיפול בחום כדי להעריך את מערכת העיכול לא ספציפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| X | קודמן | טופס cleaved |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| אני * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| ז * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa טופס | ||
טבלה 1: משקל מולקולרי תיאורטי של סובסטרטים התווית על-ידי iminobiotin, משקל מולקולרי הצפוי של קטעים פרוטאז. כוכביות (*) מצביעים על תוספת של D-סרין בין את מרווח פוליאתילן חומצת אמינו cleavable ביותר.
| Xaa: Gly, Ala, Ser, Pro, וואל, חמישי, Leu, Asp, אך זה לא נגמר, Glu, שלו, Phe, Arg, טיר | |||
| הבמה | Fmoc-מתחם | ||
| 1 | Fmoc-מיני-PEG3-הו | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-הו | ||
| 3 | Fmoc-מיני-PEG3-הו | ||
| 4 | Fmoc-מיני-PEG3-הו | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys, איל, Asn, ליס, נפגשו, Trp | |||
| הבמה | Fmoc-מתחם | ||
| 1 | Fmoc-מיני-PEG3-הו | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-הו | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-הו | ||
| 4 | Fmoc-מיני-PEG3-הו | ||
| 5 | Fmoc-מיני-PEG3-הו | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
טבלה 2: ברשימה הרציפה של ריאגנטים משמש מצע סינתזה.
| ה-pH | קומפוזיציה | ||
| 9 | 50 מ"מ Tricine המכיל 0.1 M NaCl ו 10 מ"מ CaCl2 | ||
| 7 | 50 מ"מ טריס-HCl 0.1 M NaCl המכיל ו 10 מ"מ CaCl2 | ||
| 5 | 50 מ מ סודיום אצטט המכיל 0.1 M NaCl ו- 10 מ"מ CaCl2 | ||
| 3 | חומצה ציטרית 50 מ מ המכיל 0.1 M NaCl ו- 10 מ"מ CaCl2 | ||
טבלה 3: קומפוזיציות של הפתרונות המאגר משמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה משתמש ספקטרומטר מסה MALDI-TOF לזיהוי ירידה לפרטים פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות, יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות. בפרט, אנו מניפולציות pH כדי לגרום לשינוי במצב המצע ירידה לפרטים.
אבידין-ביוטין מורכבים (ABC) השיטה, אשר כבר בשימוש נרחב בביוכימיה עקב ירידה לפרטים שלה מחייב, היה מנוצל פרוטוקול שלנו. בשל בזיקה חזקה של ABC, הכריכה של אבידין כדי ביוטין הוא כמעט בלתי הפיך. זיקה טיהור על ABCs לכן מאוד לא יעיל. מסיבה זו, אנו מדווחים כי שיעור שחזור עבור התווית על-ידי ביוטין סובסטרטים הוא צפוי להיות נמוך. במחקר זה, שאנחנו משתמשים. רק רמת pH נמוך עבור • תנאי; עם זאת, deglycosylated אבידין-שרף13 או אבידין monomeric-שרף14 עשוי לשמש גם לטהר את התווית על-ידי ביוטין סובסטרטים.
השיטה המוצעת במחקר זה ניתן להתאים מערכות ניסוי שונות ויישומים; במחשבתנו כי ספקטרומטר מסה MALDI-TOF אינו מסוגל לערוך ניתוח כמותי. לאחר ירידה לפרטים המצע נקבע, ואולי כדאי לבצע כימות באמצעות מבחני spectrometric, מבחני fluorometric או קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה (סריג).
הכיול של ספקטרומטר מסה היה הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול זה. במקרים שבו מזוהים מצעים עם משקולות מולקולרי דומה, שיפור הדיוק של התוצאות על-ידי הוספת את המשקל המולקולרי של סימנים מקדימים.
מאז התגובה אנזים משופרת עם הזמן, זה אפשר להאריך את זמן התגובה, אם אין אפשרות לזהות את האנזים. עם זאת, נותן את התגובה במשך יותר מ 24 שעות תוצאות ריאקציות צדדיות היוצרים פסגות רצויה. לכן, מומלץ לבצע את התגובה של עד 18 שעות או לשלוט בדיקה באמצעות חום שטופלו דגימות. הליך זה יכול לקבוע יחודיות פרוטאז כדי בתוך כמה femtomol של טריפסין.
לסיכום, אנחנו מציגים שיטה נוחה המשתמשת התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים להעריך פרוטאז ירידה לפרטים. שיטה זו מאפשרת עיבוד הדגימות מרובים בו זמנית, עשוי לשמש כדי לפשט פרוטאז ההקרנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי ניהון התרופות אוניברסיטת מחקר המענק ניהון התרופות האוניברסיטה (2016), את JP17854179 מספר MEXT גראנט KAKENHI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
