Artículo de método

Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística

DOI:

10.3791/57492

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11 de abril de 2018

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1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

En este artículo

Resumen

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Aquí se describe un método para generar culturas esferoide tridimensional de células epiteliales nasales humanas. Esferoides son estimulados luego a unidad de regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR)-ion dependiente y secreción flúida, cuantificar el cambio en el tamaño luminal esferoide como un proxy para la función CFTR.

Resumen

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Mientras que la introducción del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Fibrosis Quística modulador medicamentos ha revolucionado el cuidado en la Fibrosis Quística (FQ), el modelo de la terapia dirigida de genotipo actualmente en uso tiene varias limitaciones. Grupos de primera, raras o escasamente mutación están excluidos de ensayos clínicos definitivos. Por otra parte, como drogas modulador podrá entran en el mercado, será difícil optimizar las opciones de modulador para un tema individual. Ambos problemas se tratan con el uso de sistemas modelo preclínico derivados del paciente, individualizado de la función CFTR y modulación. Las células epiteliales nasales humanas (HNEs) son una fuente accesible de tejido respiratorio de este modelo. Adjunto, describimos a la generación de un modelo esferoide tridimensional de la función CFTR y modulación usando HNEs primarias. HNEs están aislados de los sujetos de manera mínimamente invasiva, ampliado en condiciones de reprogramación condicionales y sembrado en la cultura del esferoide. Dentro de 2 semanas de la siembra, las culturas esferoide generan esferoides HNE que pueden ser estimulados con 3', 5'-cíclico del monofosfato de adenosina (cAMP)-generación de agonistas para activar la función CFTR. Hinchazón del esferoide se cuantifica entonces como un proxy de la actividad CFTR. Esferoides HNE capitalizan el origen mínimamente invasivo, sin embargo, respiratorio de las células nasales para generar un modelo accesible, personalizado correspondiente a un epitelio que refleja la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad. En comparación con las culturas de gran interfaz aire-líquido, esferoides son relativamente rápidos a madurar, que reduce la tasa de contaminación. En su forma actual, el modelo es limitado por bajo rendimiento, aunque esto es compensado por la relativa facilidad de adquisición de tejido. Esferoides HNE pueden utilizarse confiablemente cuantificar y caracterizar la actividad CFTR a nivel individual. Un estudio en curso hacer esta cuantificación en vivo respuesta fármaco determinará si esferoides HNE son un verdadero predictor preclínico de respuesta del paciente a la modulación de la CFTR.

Introducción

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Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad recesiva fatal, de un autosoma que afecta a más de 70.000 personas en todo el mundo1. Esta enfermedad genética del vida-acortamiento es causada por mutaciones en la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística regulador de la proteína (CFTR)2. CFTR es miembro de la familia de cassette de unión a trifosfato de adenosina y funciones como un canal iónico que permite el movimiento de cloruro y bicarbonato a través de las membranas apicales del epitelio polarizado múltiples incluyendo el tracto gastrointestinal, glándulas sudoríparas, y respiratoria del árbol, entre otros

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Protocolo

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Muestras de gran fueron procuradas de los sujetos reclutados a través Hospital Centro médico CF centro de los niños de Cincinnati de investigación. Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional (IRB) del centro médico del Hospital infantil de Cincinnati. Se obtuvo consentimiento por escrito de todos los temas antes de la prueba.

1. preparar la expansión y antibióticos

  1. Se reúnen componentes de los medios enumerados en la tabla 1. Materiales congelados a temperatura de descongelar y hacen necesarias soluciones como se indica en la tabla 1 bajo "Medios de ....

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Resultados

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HNEs deben conectar a la placa de cultivo y forman pequeñas islas de células dentro de las 72 h de la siembra; ejemplos de formación de la isla buena y mala a la semana se muestran en la figura 1A y 1B, respectivamente. Estas islas deben ampliar para cubrir el plato en el transcurso de 15-30 días. Muestras pequeñas o subóptimas pueden tomar más tiempo y a menudo no dan útiles esferoides. Contaminación con agentes infecciosos se demuestra por .......

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Discusión

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Este protocolo describe la generación de culturas de células nasales paciente esferoide capaces de producir un modelo individualizado, específico de la función CFTR. Hay varios pasos claves en el proceso que debe ser atendido cerca para evitar la dificultad. En primer lugar es una adquisición de buena muestra de la nariz del paciente. Una buena muestra debe tener > 50.000 células, limitada moco/escombros y estar listo para el procesamiento dentro de 4 h (aunque el éxito también es fácilmente alcanzable con envío en hielo.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Fibrosis quística, número CLANCY14XX0 y a través de la Fundación de Fibrosis quística, número CLANCY15R0 de la concesión. Los autores desean agradecer a Kristina Ray por su asistencia en el reclutamiento de pacientes y supervisión reguladora. Los autores también desean agradecer al grupo de trabajo de gran apoyado de la Fundación de Fibrosis quística, que ayudó en la generación de capacidades de gran cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomón Marty y Katherine Tuggle.

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo Eppendorf de 1,5 mLEE. UU. Scientific 4036-3204
Matraz de filtro de 150 mLMidsci TP99150Para filtrar los medios
15 mL Tubo cónicoMidsci 
matraz filtrante de 1 LMidsci TP99950Para filtrar Medios
35 mm Plato con fondo de vidrioMatTek CorporationP35G-0-20-COpcional
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 Prepare una solución madre de 100 mM de 22,0 mg en 1 mL de DMSO
50 mL Tubo CónicoMidsci  
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104Solución de desprendimiento de células
AdeninaSigma-AldrichA2786-25GVer Tabla 1
Anfotericina BSigma-AldrichA9528-100MGVer Tabla 1
Extracto de Cerebro Bovino (9mg/mL)Lonza CC-4098Ver Tabla 2
Hidrato de CeftazidimaSigma-AldrichC3809-1GVer Tabla 1
Raspadores de Celdas 20 cm Midsci 
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Prepare una solución madre de 10 mM de 4,0 mg en 1 mL de DMSO
Toxina B del cólera (de Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGVer Tabla 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Cepillo de citología
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Medios de águila modificados de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes Tecnologías de la Vida 11330-057Base Media; Ver Tablas 1 y 2
Factor de Crecimiento Epidérmico (Proteína Humana Recombinante, Libre de Origen Animal)Thermo Fisher ScientificPHG6045Ver Tabla 1
EpinefrinaSigma-AldrichE4250-1GVer Tabla 2
Etanol Fisher Scientific 2701
EtanolaminaSigma-AldrichE0135-500MLsolución de 16,6 mM; Ver Tabla 2
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)TCI America E0084
Suero fetal bovino (FBS de alto rendimiento)Invitrogen 10082147Ver Tabla 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Prepare una solución madre de 10 mM de 4,1 mg en 1 mL de
DMSO Factor de Crecimiento Reducido MatrigelCorning, Inc.356231Matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento (GFR) de Corning Matrigel Growth Factor, sin rojo fenol, sin LDEV, 10 mL.
HemacitómetroHausser Scientific1483
Solución de Colágeno Humano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-ASolución de Colágeno
HyClone (también conocido como FetalClone II) GE Cuidado de la salud SH30066.03HIVer Tabla 2
HidrocortisonaStemCell Technologies07904Ver Tablas 1 y 2
Insulina, recombinante humana, solución de zincLife Technologies 12585014solución de 4 mg/mL; ver Tabla 2
Placa de FIV de 4 pocillos, NUNC no tratada(vía Fisher Scientific)12566350Placa de 4 pocillos para esferoides; tamaño de pocillo similar a una placa de 24 pocillos
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GFibroblastos embrionarios murinos irradiados
Metamorph 7.7DispositivosmolecularesSoftware de análisis; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software para obtener un presupuesto
Microscopio invertido Olympus IX51Olympus CorporationMicroscopio de imágenes descontinuado. Sustitución: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  para una cotización
Pen StrepLife Technologies 15140122Ver Tabla 2
FsoforileteanolaminaSigma-AldrichP0503-5GVer Tabla 2
Ácido retinoicoSigma-AldrichR2625-50MGVer Tabla 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Cureta nasal
Slidebook 5.53i, Intelligent Imaging InnovationsSoftware de imagen descontinuado. Reemplazo: Libro de diapositivas 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook para obtener un presupuesto
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)Thermo Fisher Scientific 20012050
Agua estérilSigma-AldrichW3500-6X500ML
Plato de cultivo de tejidos 100Productos de tecno plástico93100Plato de cultivo de tejidos para expansión
TobramicinaSigma-AldrichT4014-100MGVer Tabla 1
Transferrina (Transferrina Humana 0.5 mL)Lonza CC-4205Ver Tabla 2
TriyodotrioninaSigma-AldrichT6397-1G3,3′,5-Triyodo-L-tironina sal de sodio  [T3]; Ver Tabla 2
Tripsina del páncreas porcinoSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (vía Fisher Scientific)NC039302420 mL de polvo lipofiliado; Ver Tabla 2
Clorhidrato de vancomicina de Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GVer Tabla 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Prepare una solución madre de 1 mM de 0,4 mg en 1 mL de DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565Compre o prepare una solución madre de 10 mM de 4.5 mg en 1 mL de DMSO
Y-27632 Dihidroclorhidrato  Inhibidor de ROCK Enzo Ciencias de la Vida ALX-270-333-M025 Ver Tabla 1
TP91015TP91050TP99010

Referencias

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  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al.

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