Artículo de método

Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística

DOI:

10.3791/57492

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11 de abril de 2018

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1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

En este artículo

Resumen

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Aquí se describe un método para generar culturas esferoide tridimensional de células epiteliales nasales humanas. Esferoides son estimulados luego a unidad de regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR)-ion dependiente y secreción flúida, cuantificar el cambio en el tamaño luminal esferoide como un proxy para la función CFTR.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mientras que la introducción del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Fibrosis Quística modulador medicamentos ha revolucionado el cuidado en la Fibrosis Quística (FQ), el modelo de la terapia dirigida de genotipo actualmente en uso tiene varias limitaciones. Grupos de primera, raras o escasamente mutación están excluidos de ensayos clínicos definitivos. Por otra parte, como drogas modulador podrá entran en el mercado, será difícil optimizar las opciones de modulador para un tema individual. Ambos problemas se tratan con el uso de sistemas modelo preclínico derivados del paciente, individualizado de la función CFTR y modulación. Las células epiteliales nasales humanas (HNEs) son una fuente accesible de tejido respiratorio de este modelo. Adjunto, describimos a la generación de un modelo esferoide tridimensional de la función CFTR y modulación usando HNEs primarias. HNEs están aislados de los sujetos de manera mínimamente invasiva, ampliado en condiciones de reprogramación condicionales y sembrado en la cultura del esferoide. Dentro de 2 semanas de la siembra, las culturas esferoide generan esferoides HNE que pueden ser estimulados con 3', 5'-cíclico del monofosfato de adenosina (cAMP)-generación de agonistas para activar la función CFTR. Hinchazón del esferoide se cuantifica entonces como un proxy de la actividad CFTR. Esferoides HNE capitalizan el origen mínimamente invasivo, sin embargo, respiratorio de las células nasales para generar un modelo accesible, personalizado correspondiente a un epitelio que refleja la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad. En comparación con las culturas de gran interfaz aire-líquido, esferoides son relativamente rápidos a madurar, que reduce la tasa de contaminación. En su forma actual, el modelo es limitado por bajo rendimiento, aunque esto es compensado por la relativa facilidad de adquisición de tejido. Esferoides HNE pueden utilizarse confiablemente cuantificar y caracterizar la actividad CFTR a nivel individual. Un estudio en curso hacer esta cuantificación en vivo respuesta fármaco determinará si esferoides HNE son un verdadero predictor preclínico de respuesta del paciente a la modulación de la CFTR.

Introducción

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Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad recesiva fatal, de un autosoma que afecta a más de 70.000 personas en todo el mundo1. Esta enfermedad genética del vida-acortamiento es causada por mutaciones en la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística regulador de la proteína (CFTR)2. CFTR es miembro de la familia de cassette de unión a trifosfato de adenosina y funciones como un canal iónico que permite el movimiento de cloruro y bicarbonato a través de las membranas apicales del epitelio polarizado múltiples incluyendo el tracto gastrointestinal, glándulas sudoríparas, y respiratoria del árbol, entre otros3,4. Como tal, disfuncional CFTR conduce a la disfunción epitelial del multisistema, con más mortalidad derivadas de la enfermedad respiratoria1. En el pulmón con FQ, pérdida de vía aérea basada en CFTR superficie líquido (ASL) regulación y moco lanzamiento conduce a moco espesado, obstrucción de las vías respiratorias, infección crónica y remodelación de vía aérea progresiva y pérdida de función de pulmón1,5.

A pesar de la identificación de la disfunción CFTR como la causa de la enfermedad, terapias en la FQ tradicionalmente centrado en la mitigación de los síntomas (p. ej., terapia de reemplazo de enzimas pancreáticas, terapias de limpieza de la vía aérea)1. Este enfoque recientemente fue revolucionado por la llegada de la nueva terapéutica, denominada "Moduladores CFTR," que directamente CFTR disfuncional. Este enfoque ha cambiado el panorama clínico de manejo de los síntomas a modificadores de la enfermedad cuidado pero lleva varias limitaciones6,7,8,9,10. Actividad de modulador es específico para el defecto de la proteína que acompaña cada mutación de CFTR y limitada para seleccionar las poblaciones genético11. Esta limitación es conducida por la naturaleza heterogénea de los defectos de la proteína, sino también por la impracticalidad de ensayos clínicos en grupos de mutación rara. Además, entre los sujetos con genotipos estudiados (e.g., CFTR F508del/F508del, la mutación de CFTR más común), hay gran variabilidad en enfermedad carga y modulador de respuesta6,7,8 ,9,11.

Para superar ambos problemas, los investigadores han propuesto el uso de modelos personalizados para ensayos preclínicos12. Este concepto utiliza tejido específico para cada paciente para generar un sistema de modelo individualizado ex vivo para la prueba compuesta, predecir la en vivo tema respuesta a los tratamientos de forma personalizada. Una vez validado, este modelo podría utilizarse por los clínicos a la terapia de precisión de disco independientemente del genotipo CFTR subyacente del paciente.

Humano bronquial (HBE) las células epiteliales obtenidas del tejido del explante en el momento del trasplante de pulmón establecieron la posibilidad de tal modelo para CF13,14. HBE crecido en una interfase aire-líquido (ALI) permite la cuantificación de CFTR funcional directamente a través de la prueba electrophysiologic o indirectamente a través de medidas de ASL homeostasis13,15. Este modelo ha sido fundamental para entender la biología CFTR y fue un factor clave en el desarrollo de moduladores CFTR16. Desafortunadamente, los modelos HBE no son sostenible como un modelo personalizado debido a la naturaleza invasiva de adquisición (el trasplante de pulmón o cepillado bronquial) y falta de muestras para aquellos con mutaciones raras o enfermedad leve. Por el contrario, tejido intestinal, Obtenido de especímenes de la biopsia rectal o duodenal, puede utilizarse para que medición de corriente intestinal (ICM) o un ensayo de organoide basada en la inflamación al estudio individualizado CFTR función17,18, 19. ensayos de organoide, en particular, son modelos muy sensibles de la CFTR actividad20,21,22. Ambos modelos están limitados por la fuente de tejido (tejido intestinal, mientras la mayoría enfermedad patología respiratoria) y el método semi-invasivo de adquisición. Por otra parte, varios investigadores han estudiado humana nasal (HNE) las células epiteliales a modelo CFTR restauración23,24,25. HNEs pueden recolectarse con seguridad por el cepillo o el curetaje en sujetos de cualquier edad y, cuando se cultivan en ALI, recapitulan muchas características de HBE25,26,27,28. Cultivos monocapa de gran tradicionalmente han sido limitadas por transformación escamosa y mucho tiempo a madurez29. Además, cortocircuito medidas de corriente en HNEs son más pequeñas que ésos en HBEs, sugiriendo una ventana más pequeña para detectar la eficacia terapéutica25.

Dada la necesidad de un modelo de cultivo de tejidos personalizados, no invasivos, respiratorios de la función CFTR, intentamos combinar la sensibilidad de un ensayo de organoide basado en inflamación, con la naturaleza no invasiva y respiratoria de HNEs. Aquí, describimos nuestro método de generar culturas de 3 dimensiones "esferoide" de HNEs para estudio individualizado de CFTR en un ensayo basado en la inflamación de30. Esferoides HNE polarizan confiablemente con el ápice epitelial hacia el centro de la esfera, o lumen. Este modelo recoge numerosas características de un epitelio respiratorio inferior y madura más rápidamente que las culturas ALI. Como un análisis funcional, esferoides HNE cuantifican confiablemente una función gama de CFTR, así como la modulación en grupos bien estudiados de la mutación (por ejemplo, F508del CFTR). Este análisis basado en la inflamación aprovecha las propiedades de transporte iónico sal de CFTR, indirectamente medir flujo líquido en el esferoide como agua sigue sal apical de la emanación. De esta manera, esferoides estimulados con CFTR completamente funcional se hinchan robusta, mientras que aquellos con CFTR disfuncional hinchan menos o encogen. Esto se cuantifica a través de análisis de imagen de pre- y cambian de esferoides de estimulación después de 1 h, área luminal y determinar el por ciento. Esta medida se puede comparar entonces a través de grupos experimentales a la pantalla para la bioactividad de la droga de un modo específico para cada paciente.

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Protocolo

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Muestras de gran fueron procuradas de los sujetos reclutados a través Hospital Centro médico CF centro de los niños de Cincinnati de investigación. Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional (IRB) del centro médico del Hospital infantil de Cincinnati. Se obtuvo consentimiento por escrito de todos los temas antes de la prueba.

1. preparar la expansión y antibióticos

  1. Se reúnen componentes de los medios enumerados en la tabla 1. Materiales congelados a temperatura de descongelar y hacen necesarias soluciones como se indica en la tabla 1 bajo "Medios de expansión".
    Nota: Tenga cuidado al manejar la toxina del cólera, que es tóxico si se ingiere y es un irritante respiratorio, piel y ojos. Hacer y combinar todas las soluciones y medios bajo condiciones de limpieza en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
  2. Con una pipeta serológica de 50 mL, retire y deseche los 50 mL de medio base (Dulbecco modificado Eagle medio/F12) de un recipiente para compensar la adición de otros materiales. Vierta todos los medios de base a mano una botella de vidrio de 1 L esterilizado.
  3. Utilizando una pipeta serológica de 50 mL o pipeta de 1 mL según el caso, transferir todos los componentes restantes de la sección "Medios de expansión" del cuadro 1 al frasco de vidrio esterilizado que contiene los medios de comunicación. Agitar suavemente la botella a mano para mezclar.
  4. Medios de filtro en un fresco, estéril 1 L, 0.22 μm polyethersulfone (PES) matraz de filtración utilizando las instrucciones del fabricante y anotar con "Medios de expansión" y la fecha.
  5. Preparar medios antibióticos. Hacen necesarias soluciones antibióticas como se indica en la tabla 1 bajo "Medios antibióticos".
    1. Con una pipeta serológica de 50 mL, transferir 150 mL de medio de expansión para una botella de vidrio esterilizada fresca 250 mL.
    2. Con una pipeta de 1 mL, añadir todos los componentes de la sección de "Medios antibiótico" del cuadro 1 al frasco de vidrio esterilizado que contiene los medios de comunicación. Agitar con la mano para mezclar hasta que los medios de comunicación son uniforme en apariencia.
    3. Medios de filtro en un fresco, estéril 250 mL, matraz de filtración PES de μm 0,22 utilizando las instrucciones del fabricante y anotar con "Antibióticos medios" y la fecha.
  6. Tienda media a 4 ° C hasta por un mes, descartando si nublado, lo que sugiere contaminación.

2. preparar los medios de diferenciación

  1. Se reúnen componentes de los medios enumerados en la tabla 2. Materiales congelados a temperatura de descongelar y hacen necesarias soluciones como se indica en la tabla 2.
    Nota: Tenga cuidado al manipular el ácido retinoico, que es una toxina reproductiva, puede ser tóxico si se ingiere y causa irritación de la piel. Hacer, alícuota y combinan todas las soluciones y medios bajo condiciones de limpieza en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
  2. Retire y deseche 52 mL del medio base de un recipiente para compensar la adición de otros materiales. Vierta una botella de vidrio de 1 L esterilizado a todos los medios de la base.
  3. Utilizando una pipeta serológica de 25 mL o pipeta de 1 mL según el caso, transferir todos los componentes restantes de la tabla 2 a la botella de vidrio esterilizada que contiene los medios de comunicación y girelo suavemente con la mano para mezclar.
  4. Medios de filtro en un fresco, estéril 1 L, 0.22 μm polyethersulfone (PES) matraz de filtración utilizando las instrucciones del fabricante y anotar con "Medios de diferenciación" y la fecha.
  5. Tienda media a 4 ° C hasta por un mes, descartando si nublado, lo que sugiere contaminación.

3. capa cultura platos y plato alimentador fibroblastos

Nota: Realice todas las medidas bajo condiciones de limpieza en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Mezclar 0,5 mL de stock de colágeno y 37,5 mL de agua estéril en un tubo cónico de 50 mL.
  2. Pipetear 4-5 mL de solución de colágeno en cada placa de cultivo limpio P100, asegurando que se cubre toda la superficie.
  3. Cubrir los platos con las tapas e incubar durante la noche a 37 ° C y 5% CO2.
  4. En el gabinete de bioseguridad, quitar todas las tapas del plato. Remolino de solución cubra el plato, y luego aspirar.
  5. Esterilizar por la exposición a radiación ultravioleta (UV) luz para tapas de lugar de 1 h. en los platos, platos de la pila y la tapa con papel de aluminio.
  6. Platos de almacén cubierto a 4 ° C durante 3-6 meses, volver a esterilizar bajo UV luz 15-30 min antes del uso de cultivo celular.
  7. 24 h antes de obtener una muestra HNE, esterilizar un plato previamente cubierto y etiqueta como fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y la fecha.
  8. Añadir el medio de expansión para cubrir la placa (aproximadamente 5 mL) con una pipeta serológica.
  9. Descongelar un vial de MEFs de 2 x 106 irradiado en un baño de agua de 37 ° C. Tan pronto como se haya descongelado las MEFs, agregue la mitad de la cubeta (aproximadamente 106 células) al plato con una pipeta de 1 mL, girando con la mano para dispersar.
  10. Incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante la noche en preparación para la cultura de la HNE.
    Nota: Si es necesario, medidas 3.7-3.10 pueden ser realizado hasta 60 minutos antes de las células de revestimiento, aunque durante la noche es ideal.

4. obtener y procesar muestras de gran

  1. Asegurar aprobación IRB consentimiento/asentimiento se obtiene para todas las materias.
  2. Tienen nariz soplo paciente para despejar el moco suelto.
  3. Visualizar a utilizando un rhinoscope turbinate inferior. Asegurar lesiones o pólipos no son presente que puede impedir la recogida de muestras.
  4. Recoger las células nasales de la primera fosa nasal por legrado o cepillado.
    1. Legrado: Cureta de curva en su punto medio para crear una leve, ángulo de ~ 135º con el ápice de la Copa de la cureta. Inserte la cureta en la fosa nasal y avanzar en la Copa de la cureta bajo el cornete nasal inferior. Suavemente presione la Copa cureta contra el inferior cornete y raspe el cornete tirando la cureta hacia adelante, repitiendo 3 - 4 veces total.
    2. Cepillo: Paso el cepillo por debajo de la inferior cornete nasal, luego gire y mueva el cepillo entrada y salido un poco a las 4 - 5 veces, sin salir de la fosa nasal.
  5. Lugar cureta/pincel de 15 mL cónico lleno de medios antibióticos. Repita los pasos 4.3-4.4 para la otra fosa, colocando el cepillo de cureta en el mismo tubo cónico.
  6. Tienda cónica en hielo hasta que esté listo para el proceso. Asegúrese de que el proceso ocurre dentro de 4 h de adquisición de muestra, pero puede ocurrir tan tarde como 24 h después de la adquisición si es necesario.

5. proceso y expandir las células HNE en platos

Nota: Realice todas las medidas bajo condiciones de limpieza en el gabinete de seguridad de la biotecnología.

  1. Utilizando una pipeta de 1 mL y media de la muestra cónica, lavar todas las células de cepillos de citología de la curetas en el mismo tubo cónico. Una vez limpio, descartar curetas / cepillos.
  2. De centrífuga cónico en 360 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
  3. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celulares.
  4. Resuspenda el precipitado de células en 3 mL de solución de separación celular, pipetear con una punta de 1 mL para homogeneizar la mezcla.
  5. De centrífuga cónico en 360 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
  6. Repita los pasos 5.3-5.5 una vez.
  7. Aspirar el sobrenadante restante, teniendo cuidado de no para perturbar el sedimento celulares.
  8. Resuspenda el sedimento en 1 mL de medio antibiótico y conteo de células con un hemocitómetro.
  9. Con una pipeta de 1 mL, placa de células gota a gota sobre el plato cubierto, sembrado de fibroblastos preparado en el paso 3.10. Añadir antibióticos medios para cubrir el plato completamente y dispersar las células a través de la superficie. Plato con el contenido y fecha de la etiqueta e incubar a 37 ° C y 5% CO2.
  10. Después de 48 h, asegúrese de que las células se unen a la placa de cultivo. Aspire los medios de comunicación y sustituir con bastante fresco medios antibióticos para cubrir la placa.
  11. Cambiar los medios de comunicación 3 x semanal, aspirar viejos medios con una línea de vacío y una pipeta Pasteur y reemplazar con suficientes medios frescos para cubrir la placa. Después de 5 días en medios antibióticos, cambiar los medios de comunicación a los medios de expansión, continuando reemplazar tres veces semanalmente.
    Nota: Riesgo de contaminación es alto en la primera semana de la cultura. Mantener las muestras frescas en una incubadora separada para minimizar el riesgo de contaminación cruzada.
  12. Controlar el crecimiento celular varias veces cada semana. Una vez que las células son aproximadamente 70-80% confluente, proceder a las células de paso.

6. pasaje HNE células

  1. Preparar solución de tripsina 0.1% en ácido etilendiaminotetracético (EDTA).
    Nota: Tenga cuidado manejo de tripsina, que es un irritante de ojo y piel, vías respiratoria.
    1. Peso 15 mg de tripsina del páncreas porcino en un tubo cónico.
    2. Peso 56 mg de EDTA en un separado tubo cónico.
    3. En el gabinete de seguridad de la biotecnología, transferencia de tripsina y EDTA en un frasco de vidrio esterilizado 250 mL. Utilice una pequeña alícuota de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para enjuagar los tubos de tripsina/EDTA para asegurar a transferencia completa.
    4. Añadir PBS estéril para llevar la solución total a 150 mL. Cierre la tapa firmemente.
    5. Incubar la solución de tripsina en un baño de agua de 37 ° C hasta que se disuelva completamente. Revisar cada 15 min y retirar inmediatamente una vez disuelto.
      Nota: No deje desactivada durante períodos prolongados de tiempo (por ejemplo, durante la noche), como tripsina en solución se desnaturaliza si se calienta demasiado.
    6. Limpie la botella con 2-3 sprays de etanol al 70% y volver a la seguridad de la biotecnología gabinete.
    7. Filtro 0.1% solución de tripsina-EDTA en un fresco, estéril de 250 mL, matraz de filtración PES de μm 0,22 utilizando las instrucciones del fabricante y anotar con el contenido y fecha.
    8. Almacenar solución de tripsina-EDTA a 4 ° C hasta por un mes, descartando si nublado.
  2. Llevar medios de diferenciación, solución al 0.1% tripsina-EDTA y PBS estéril a temperatura ambiente durante 30 minutos limpiar con etanol al 70% y la transferencia a un gabinete de bioseguridad limpia.
  3. En el gabinete de bioseguridad, usar una línea de vacío y una pipeta Pasteur para aspirar y desechar el medio del plato de cultivo de tejidos. Lavar el plato añadiendo, remolinos y aspirar 5 mL de PBS con una pipeta serológica limpio.
  4. Utilizando una pipeta serológica de 5 mL, agregar 5 mL de solución de tripsina-EDTA 0.1% para el plato de cultivo de tejidos y volver a la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 5 minutos.
  5. Visualizar las células en un microscopio invertido en 4-10 X. Comprobar que las células separan del plato, se convierten en la redondeos y flotan. Golpee suavemente el lado de la placa de cultivo para desalojar a las células, o volver a incubar por un adicional 5 min hasta que la mayoría de las células es separada.
    Nota: Tenga cuidado al eliminar rápidamente las células una vez separadas de la placa de cultivo; la exposición prolongada al 0.1% tripsina-EDTA afectará viabilidad celular.
  6. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregar 5 mL de medio de expansión para el plato y recoger todo el contenido es líquido (10 mL en total) en un tubo cónico de 50 mL estéril, etiquetados.
  7. Si las células permanecen adheridas a la placa de cultivo, repita los pasos 6,4 6,6 por a dos tiempos, que recoge contenido en el mismo tubo cónico.
    1. Si las células permanecen adheridas a la placa de cultivo después de tres rondas de exposición de la solución de tripsina, un raspador celular estéril suavemente Quite el resto. Después de raspar el plato, lave la espátula y plato con 5 mL de medio de expansión y recoger en el mismo tubo cónico etiquetado.
      Nota: Si pases esferoides, modificar este procedimiento para realizar un diferencial tripsinización. Después de agregar la tripsina (paso 6.4), compruebe el plato con frecuencia hasta que los fibroblastos han separado (típicamente 1-2 min), dejando las células epiteliales poligonales sólo unida al plato. Recoger y dejar de lado este sobrenadante, que pueden ser pasados hacia adelante para la expansión. Repita los pasos 6.4-6.6 utilizando la misma solución de tripsina y recoger sólo las restantes células epiteliales para la cultura del esferoide.
  8. De centrífuga cónico a 360 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire los medios de comunicación de cónico.
  9. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de células medios de expansión y cuenta con un hemacitómetro.
  10. Una vez cuantificados, las células pueden dividirse si es necesario y pasados hacia adelante en un nuevo plato de cultura (incluyendo preparación de co cultivo de fibroblastos, paso 3 y las células en expansión, pasos 5.9 5.12 de la galjanoplastia) o cultivados como esferoides (paso 7).
    Nota: Si pases a un nuevo plato de cultura de expansión, una densidad de siembra de 0.5-1 × 106 células en un plato de P100 recomienda.

7. siembra células de HNE esferoide culturas

Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos en este paso, que no sean de centrifugación, en un gabinete de bioseguridad limpia.

  1. Descongelar la matriz de la membrana del sótano en hielo por las instrucciones del fabricante (100 μl por pozo del esferoide).
    Nota: Considere hacer estériles alícuotas de 500 μl de la matriz de la membrana del sótano en el recibo; Esta cantidad siembra una sola placa de 4 pozos.
  2. Separar un número apropiado de células tripsinizaron diferencialmente, los (de paso 6.9) para una concentración final de 500.000 células por mL de la matriz. Para una placa de 4 pozos, uso 200.000 células. Recoger en un tubo de 1,5 mL.
  3. Centrifugar la mezcla celular y medios de comunicación a 360 x g durante 5 min a 4 ° C. Totalmente, pero cuidadosamente aspirar y desechar el medio utilizando una pipeta de 1 mL, teniendo cuidado de no para perturbar el sedimento celulares.
  4. Utilizando una pipeta de 1 mL, añadir 100 μl por planeado de la matriz de la membrana del sótano en el tubo de 1,5 mL que contiene las células. Mantenga el tubo en hielo.
  5. Pipetee hacia arriba y hacia abajo a cuidadosamente y bien resuspender las células en la matriz de la membrana del sótano. Actuar rápidamente para evitar la solidificación de la matriz. Evite vaciar completamente la punta de la pipeta para que no se introduzcan burbujas de aire en la mezcla de la matriz celular.
  6. Semilla de alícuotas de matriz de 100 μL en cada pocillo de una placa de cultivo de FIV 4 pozos.
    1. Usando un par limpio de tijeras, corte la 3-4 mm distal de una punta de pipeta de 200 μl.
    2. Con la punta recortada, cuidadosamente Pipetee 100 μl de la mezcla de células y matrix en el centro de cada pozo. Pipeta lentamente, con el objetivo de hacer una matriz única "caída" en el centro de cada pozo. La gota debe seguir siendo esférica y no debe tocar los lados del pozo. Cuando se mueve la placa, hacer tan cuidadosamente para evitar molestar a estas gotas.
    3. Incubar las gotas de matriz de la membrana del sótano en 37 ° C y 5% de CO2 por 30 min, hasta el sólido.
    4. Cuidadosamente Pipetear 500 μl del medio de diferenciación en cada pocillo, teniendo cuidado de no para molestar a la caída de la matriz. Asegúrese de que la cubierta sólo de los medios de comunicación la matriz caída y agregue más si es necesario.

8. distinguir y madurar HNE esferoides

  1. Utilizando una pipeta de 1 mL, aspirar suavemente todos los medios de pozo; evitar la aspiración de la matriz, que destruirá esferoides en esa porción de la matriz, aunque cualquier esferoides dejadas pueden permanecer viables.
  2. Utilizando una pipeta de 1 mL fresco, suavemente agregar 500 μl de medio de diferenciación al pozo alrededor de la matriz. No toque la matriz con la pipeta y evitar molestar a la caída de la matriz.
  3. Volver esferoides a la incubadora a 37 oC y 5% CO2 para el crecimiento continuo. Repita los pasos 8,1 8,3 a través tres veces semanal.
  4. Evaluar morfología esferoide diariamente bajo un microscopio invertido a 20 X. Esferoides deben formar entre 3-5 días de la galjanoplastia y alcanzan la madurez dentro de aproximadamente 10 días.

9. trate, estimular y HNE esferoides de imagen para el análisis

  1. Pretratar esferoides como desee antes de la proyección de imagen de como se describió anteriormente30.
    Nota: Para el tratamiento previo de VX809, añadir 3 μm de VX809 a los medios de comunicación de 48-72 h antes de la proyección de imagen. Mezclar 1 μl de 10 mM VX809 stock (véase Tabla de materiales) en 3.3 mL de medios de comunicación para esta concentración.
  2. Cambiar cada tanto de esferoides a 1 mL de dulce medios de diferenciación, incluyendo pretratamiento (pasos 8.1-8.3) antes de la proyección de imagen esferoides.
  3. Preparar dulce estímulo medicamentos soluciones (Forskolin, 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], VX770 y CFTR inhibidor 172 [Inh172]) de las existencias (véase la Tabla de materiales). Para forskoline/IBMX, añadir 1 μl de cada población a 98 μl de agua estéril en un solo tubo de 1,5 mL con la etiqueta. Para VX770 y Inh172, añadir 1 μl de cada población a 99 μl de agua estéril en tubos separados etiquetados 1,5 mL. Hacer un volumen total que permite 50 μl de solución para cada uno de ellos bien probados. Preparar soluciones bajo condiciones estériles en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
  4. Transferencia de placa esferoide a una cámara se incubó a 37 ° C y 5% CO2, montada sobre un microscopio invertido equipado con software de captura de imagen electrónica y una etapa mecánica para el ajuste de XY. Encienda el microscopio y cámara, así como el equipo de proyección de imagen.
  5. Capturar imágenes de referencia de esferoides en un pozo.
    1. Abra el software de captura de imagen (Slidebook 5.5 para las direcciones más abajo). Una vez inicializado, abra un archivo nuevo haciendo clic en "Archivo", luego "Nuevo". Por consiguiente el nombre al archivo y haga clic en "Guardar".
    2. Con cuidado retire la tapa de la placa de cultura y centro de una gota de la matriz sobre el objetivo.
    3. A partir de la parte superior de la caída de la matriz, desplazarse en una cuadrícula para encontrar esferoides con 20 aumentos con el ocular del microscopio. Enfoque hacia arriba y hacia abajo para capturar la esfera en su punto más ancho. Anotar la ubicación de cada esferoide en el mapa de la caída de la matriz vuelva a identificar después de la proyección de imagen.
    4. En el software, haga clic en "Captura de imagen". La exposición, seleccione "Manual" e introduzca 50 Sra. asegurar otros ajustes son apropiados (Bin Factor: 1 x 1, W: 512, 512 h, X y Y Offset: 0). Escriba un nombre adecuado para cada imagen en el cuadro "Nombre" (p. ej., 1 base de esferoide). Haga clic en "Inicio" ver una imagen en directo y "Guardar" para capturar una imagen de línea de base.
    5. Repita los pasos 9.5.1-9.5.4 hasta que número de meta se alcanza, o gota de toda matriz es reflejada.
      Nota: Pueden detectar diferencias de grupo con tan sólo 3-5 esferoides por condición, sin embargo, se ha convertido en nuestra práctica de esferoides de 10 o más por condición para incrementar la potencia de la imagen. Variabilidad del ensayo se demuestra en la figura 2 de la sección de "Resultados del representante", con muestras de esferoides de 8-10 por cada tema como un ejemplo.
  6. Estimular esferoides.
    1. Con una pipeta de 200 μL, añada 50 μl de la droga de estimulación adecuada en los medios de comunicación dentro del pozo, teniendo cuidado de no para molestar a la matriz.
      Nota: Después de esta dilución 10 veces (50 μL en 500 μl de medios de comunicación), la concentración de droga final será: forskoline 10 μm IBMX 100 μm, μm VX770 1, Inh172 10 μm.
    2. Campamento solo, agregar sólo la forskoline/IBMX.
    3. Campamento + VX770, añadir forskoline/IBMX primero, luego el VX770 después de 2 minutos.
    4. Para condiciones de inhibición, añadir Inh172 primero, entonces la forskoline/IBMX después de 2 minutos.
  7. Inmediatamente después del estímulo, monitor esferoide hinchazón por proyección de imagen de lapso de tiempo de 1 h. En el software, haga clic en "Captura de imagen". Haga clic en "Timelapse" y establecer el intervalo de 30 s, con una duración de 60 minutos, escriba un nombre apropiado y haga clic en "Guardar" para iniciar el lapso de tiempo.
    Nota: Lapso de tiempo estándar es captar imágenes de un esferoide solo cada 30 s para un video de alta calidad. Como alternativa, realizar captura de menor magnificación de todo bien (por ejemplo, 4 X) y menos imágenes si lo desea. Si se utiliza una etapa automatizada, realizar timelapse de los esferoides mediante coordenadas predefinidas; de lo contrario, utilice timelapse de un subconjunto de esferoides para proporcionar una revisión cualitativa de la hinchazón y para que ninguna cuestión sistemática surge durante la proyección de imagen (p. ej., desprendimiento de la matriz del pozo).
  8. Inmediatamente sobre la terminación de la imagen de lapso de tiempo de 1 h, capturar imágenes de la estimulación de los esferoides (por paso 9.5) usando el mapa creado en el paso 9.5.3.
    1. Consulte imágenes de estimulación previa para asegurar que el mismo plano de enfoque se utiliza para imágenes de seguimiento (la calidad focal de alrededor de las células, esferoides o desechos grandemente facilitar este proceso).
    2. Guardar archivos con una anotación de pares de paso 9.5.4 (p. ej., esferoide 1 post estimulación).
      Nota: completar este paso inmediatamente después del lapso de tiempo, como esferoides pueden continuar a hincharse.
  9. Sustituir los medios de comunicación en la imagen con medios de diferenciación fresco.
  10. Repita los pasos del 9.5 a 9.9 de cada pozo o condición, ajuste de medicamentos de estimulación como se indica para las condiciones experimentales.
  11. Al finalizar la proyección de imagen todos volver esferoides a la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
    Nota: Dependiendo de la esterilidad de la cámara de microscopio incubados, estimulación posterior contaminación de esferoides puede ser bastante común. Mantener imagen esferoides en una incubadora separada, para minimizar el riesgo de contaminación cruzada, o deseche esferoides inmediatamente después de la proyección de imagen.

10. analizar imágenes del esferoide HNE

  1. Exportar imágenes capturadas de todo a un formato compatible con software de análisis de imagen. En el software, haga clic en "Ver", se ciernen sobre la "Exportación" y seleccione "Default vistas de todas imágenes como TIFF...". Guardar en el disco duro o una unidad flash para el análisis.
    Nota: un análisis comercial software (Tabla de materiales) y archivos .tiff funcionan bien y se describen aquí, aunque también se pueden realizar análisis con otras plataformas. Cuando nombres de archivos, personal analizando imágenes debe ser ciego a las condiciones experimentales, pero consciente de que imágenes están emparejados (pre y post estimulación) para asegurar el análisis equivalente.
  2. Usando software de análisis, delimitar el área luminal de cada imagen del esferoide y exportar a un software de análisis de datos.
    1. Software de análisis abierto. Haga clic en "Archivo", luego "abrir" y desplácese hasta la carpeta que contiene imágenes de esferoide. Seleccione todas las imágenes para análisis y haga clic en "Abrir".
    2. Haga clic en "Medida" y seleccionar "Región medidas". En el cuadro de diálogo región medidas seleccione droptab "Configuración" y asegúrese de controlar cuadros de "Nombre de imagen" y "Área".
    3. Haga clic en "Registro" y seleccione "Abrir datos de registro". Haga clic en "OK" en el archivo de caja y nombre de diálogo de registro de datos en consecuencia (por ejemplo, condición X, fecha). Esto transferirá todas las mediciones a una hoja de cálculo.
    4. Seleccione el botón de la herramienta "Trace región" y trazar cuidadosamente el lumen de la esferoide en la primera imagen para el análisis. En el cuadro de diálogo de medición de la región, haga clic en "Datos de registro" para registrar la medición en Excel.
    5. Repita pasos 10.2.2-10.2.4 hasta que se analizan todos los esferoides.
  3. Calcular el cambio porcentual (100 * [Post-stim - línea de base] ÷ línea de base) en la zona luminal de línea base para cada esferoide individual par la imagen y recopilar datos para análisis.

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Resultados

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HNEs deben conectar a la placa de cultivo y forman pequeñas islas de células dentro de las 72 h de la siembra; ejemplos de formación de la isla buena y mala a la semana se muestran en la figura 1A y 1B, respectivamente. Estas islas deben ampliar para cubrir el plato en el transcurso de 15-30 días. Muestras pequeñas o subóptimas pueden tomar más tiempo y a menudo no dan útiles esferoides. Contaminación con agentes infecciosos se demuestra por ...

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Discusión

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Este protocolo describe la generación de culturas de células nasales paciente esferoide capaces de producir un modelo individualizado, específico de la función CFTR. Hay varios pasos claves en el proceso que debe ser atendido cerca para evitar la dificultad. En primer lugar es una adquisición de buena muestra de la nariz del paciente. Una buena muestra debe tener > 50.000 células, limitada moco/escombros y estar listo para el procesamiento dentro de 4 h (aunque el éxito también es fácilmente alcanzable con envío en hielo...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por la Fundación Fibrosis quística, número CLANCY14XX0 y a través de la Fundación de Fibrosis quística, número CLANCY15R0 de la concesión. Los autores desean agradecer a Kristina Ray por su asistencia en el reclutamiento de pacientes y supervisión reguladora. Los autores también desean agradecer al grupo de trabajo de gran apoyado de la Fundación de Fibrosis quística, que ayudó en la generación de capacidades de gran cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomón Marty y Katherine Tuggle.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo Eppendorf de 1,5 mLEE. UU. Scientific 4036-3204
Matraz de filtro de 150 mLMidsci TP99150Para filtrar los medios
15 mL Tubo cónicoMidsci 
matraz filtrante de 1 LMidsci TP99950Para filtrar Medios
35 mm Plato con fondo de vidrioMatTek CorporationP35G-0-20-COpcional
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 Prepare una solución madre de 100 mM de 22,0 mg en 1 mL de DMSO
50 mL Tubo CónicoMidsci  
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104Solución de desprendimiento de células
AdeninaSigma-AldrichA2786-25GVer Tabla 1
Anfotericina BSigma-AldrichA9528-100MGVer Tabla 1
Extracto de Cerebro Bovino (9mg/mL)Lonza CC-4098Ver Tabla 2
Hidrato de CeftazidimaSigma-AldrichC3809-1GVer Tabla 1
Raspadores de Celdas 20 cm Midsci 
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Prepare una solución madre de 10 mM de 4,0 mg en 1 mL de DMSO
Toxina B del cólera (de Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGVer Tabla 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Cepillo de citología
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Medios de águila modificados de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes Tecnologías de la Vida 11330-057Base Media; Ver Tablas 1 y 2
Factor de Crecimiento Epidérmico (Proteína Humana Recombinante, Libre de Origen Animal)Thermo Fisher ScientificPHG6045Ver Tabla 1
EpinefrinaSigma-AldrichE4250-1GVer Tabla 2
Etanol Fisher Scientific 2701
EtanolaminaSigma-AldrichE0135-500MLsolución de 16,6 mM; Ver Tabla 2
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)TCI America E0084
Suero fetal bovino (FBS de alto rendimiento)Invitrogen 10082147Ver Tabla 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Prepare una solución madre de 10 mM de 4,1 mg en 1 mL de
DMSO Factor de Crecimiento Reducido MatrigelCorning, Inc.356231Matriz de membrana basal reducida con factor de crecimiento (GFR) de Corning Matrigel Growth Factor, sin rojo fenol, sin LDEV, 10 mL.
HemacitómetroHausser Scientific1483
Solución de Colágeno Humano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-ASolución de Colágeno
HyClone (también conocido como FetalClone II) GE Cuidado de la salud SH30066.03HIVer Tabla 2
HidrocortisonaStemCell Technologies07904Ver Tablas 1 y 2
Insulina, recombinante humana, solución de zincLife Technologies 12585014solución de 4 mg/mL; ver Tabla 2
Placa de FIV de 4 pocillos, NUNC no tratada(vía Fisher Scientific)12566350Placa de 4 pocillos para esferoides; tamaño de pocillo similar a una placa de 24 pocillos
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GFibroblastos embrionarios murinos irradiados
Metamorph 7.7DispositivosmolecularesSoftware de análisis; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software para obtener un presupuesto
Microscopio invertido Olympus IX51Olympus CorporationMicroscopio de imágenes descontinuado. Sustitución: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  para una cotización
Pen StrepLife Technologies 15140122Ver Tabla 2
FsoforileteanolaminaSigma-AldrichP0503-5GVer Tabla 2
Ácido retinoicoSigma-AldrichR2625-50MGVer Tabla 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Cureta nasal
Slidebook 5.53i, Intelligent Imaging InnovationsSoftware de imagen descontinuado. Reemplazo: Libro de diapositivas 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook para obtener un presupuesto
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)Thermo Fisher Scientific 20012050
Agua estérilSigma-AldrichW3500-6X500ML
Plato de cultivo de tejidos 100Productos de tecno plástico93100Plato de cultivo de tejidos para expansión
TobramicinaSigma-AldrichT4014-100MGVer Tabla 1
Transferrina (Transferrina Humana 0.5 mL)Lonza CC-4205Ver Tabla 2
TriyodotrioninaSigma-AldrichT6397-1G3,3′,5-Triyodo-L-tironina sal de sodio  [T3]; Ver Tabla 2
Tripsina del páncreas porcinoSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (vía Fisher Scientific)NC039302420 mL de polvo lipofiliado; Ver Tabla 2
Clorhidrato de vancomicina de Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GVer Tabla 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Prepare una solución madre de 1 mM de 0,4 mg en 1 mL de DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565Compre o prepare una solución madre de 10 mM de 4.5 mg en 1 mL de DMSO
Y-27632 Dihidroclorhidrato  Inhibidor de ROCK Enzo Ciencias de la Vida ALX-270-333-M025 Ver Tabla 1
TP91015TP91050TP99010

Referencias

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