Summary
Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.
Abstract
Batı Mısır rootworm (WCR) Mısır önemli bir böcek ve haşere Yönetim Stratejileri için hızla adapte kabiliyetini için bilinen. RNA müdahale (RNAi) WCR biyoloji okuyan için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamıştır rağmen kendi sınırlamaları vardır. Özellikle, RNAi kendisi geçici (Yani tam yol ilişkili fenotip uzun vadeli Mendel miras), ve hedef gen DNA dizisi bilerek gerektirir. Fenotip ilgi kötü korunmuş veya bile roman genler tarafından kontrol edilir eğer yararlı hedefler belirlenmesi zor olabilir çünkü ikinci imkansız olmasa sınırlama. Bu nedenle, dizi WCR'ın genomik araç kutusundaki araç istikrarlı mutant suşları oluşturmak ve WCR genom dizisi bağımsız çalışmaları etkinleştirmek için kullanılabilir yöntemleri geliştirme tarafından genişletilip. Burada, biz toplamak ve nükleik asitler ile precellular WCR embriyo microinject için kullanılan yöntemleri ayrıntılı. Burada açıklanan protokoller transgenik WCR yaratılması hedefleniyor iken, CRISPR/Cas9-genom düzenleme de embriyo enjekte çözüm bileşimi olmanın tek farkı ile aynı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Introduction
Batı Mısır rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, önemli bir böcekten Mısır1var. İlginçtir, denetim üstesinden gelmek için WCR görünür onlar sadece fizyolojik olarak aynı zamanda davranışsal2,3,4,5, uyum bu yana en Tarım zararlıları daha hızlı ölçer 6. son on yıl içinde RNA müdahale (RNAi), güçlü bir işlevsel genomik araç, WCR7,8için potansiyel bir kontrol yöntemi olarak incelenmiş ve gen fonksiyon9eğitim için bir araç olarak da kullanılmıştır. RNAi sık mikroenjeksiyon çift iplikçikli RNA (dsRNA) diğer türler tarafından gerçekleştirilir, ancak, RNAi enjeksiyon tabanlı WCR içinde nadir iken. Aslında, RNAi yolu ile mikroenjeksiyon dsRNA in WCR9içine sadece bir kaç rapor ediliyor. WCR bile annem11' e dsRNA besleyerek embriyonik etkileri çalışma izin dsRNA7,10, için gen devirme yolu ile yenmesi yüksek düzeyde elde edebilirsiniz nedenidir. Bu yöntem WCR fonksiyonel genomik analiz yoluyla RNAi için mükemmel bir konu yapar iken, bu türlerin embriyonik mikroenjeksiyon yöntemleri geliştirmedek ilerlemeyi yavaşladı.
RNAi güç rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, tüm genler eşit RNAi için yanıt. Bu değişkenliği daha zor bir işlevsel genomik tahlil sonuçlarını yorumlama yapabilirsiniz. Ayrıca, RNAi geçici ve kalıtsal mutasyonlar oluşturmaz. Öte yandan, germline dönüştürme, başka bir işlevsel genomik aracı, kalıtsal mutasyonlar ile işaretli olan öğesinin içine ekleme genom12,13oluşturabilirsiniz. Bu uzun vadeli genetik çalışmalarda kullanılmak mutant suşları oluşturmak için mükemmel bir araç germline dönüştürme yapar. Dönüştürme bir mutant genom14' e gen işlevsel bir kopyasını sunarak bir mutasyon kurtarmak için de kullanılabilir. Ayrıca, germline dönüştürme moleküler genetik teknikleri çok çeşitli taşıdır. Nakavt ve/veya gen işlevi tahlisiye yanı sıra, germline dönüştürme artırıcı bindirme15, gen bindirme16, Ektopik ifade Gal4 tabanlı17ve genom-wide mutagenesis18için kullanılabilir.
Daha yakın zamanlarda, sofistike genom düzenleme sağlayan araçlar geliştirilmiştir. Bu araçlar transkripsiyon Activator-Like efektör enzimler (TALEN) CRISPR/Cas9-nükleaz sistemi19,20içerir. Bu yeni araçların çift iplikçikli DNA ara hemen hemen her yerde hemen hemen tüm genom içinde ikna yeteneği araştırmacılar sundukları avantajdır. Bir kez bağlı, bu tatili katalizler hangi bir mühendislik yapı huzurunda homoloji yönetmen onarım veya silme veya ekleme hedeflenen gen tanıtmak katılmadan, homolog olmayan iki ucundan aracılığıyla onarılabilir yerine tüm genler veya genetik bölgeleri21,22. Ancak, bu yöntemlerin çok genç embriyo içine DNA, RNA ve/veya protein mikroenjeksiyon gerektirir.
Önemlisi, RNAi, nükleik asitler ve protein germline için kullanılan için kullanılan dsRNAs aksine dönüştürme ve genom düzenleme kolayca hücre zarlarında geçemez. Bu nedenle, mikroenjeksiyon plazmid DNA'lar, mRNA'ların ve/veya proteinler (böcek embriyo cellularizes önceYani ) sinsisyal blastoderm aşamasında yer almalıdır. Bu kritik bir faktör enjeksiyonları zamanlamasını yapar. Örneğin, Drosophila melanogasteriçinde embriyo12yumurta sonra iki saat içinde enjekte edilir gerekir. Bu nedenle, başarılı embriyonik mikroenjeksiyon Protokolü gelişimi için WCR yanı sıra precellular embriyo yeterli miktarda toplamak için en iyi yöntem dişi yumurta döşenmesi için en iyi koşulları dikkate almanız gerekir.
Toplamak ve precellular WCR embriyo microinjecting yöntemleri geliştirmek, WCR Biyoloji üzerinde ayı için moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede getirmek için bir çaba gerektirir. Burada WCR araştırmada dönüşüm tabanlı teknikleri kullanmak başkalarına yardım etmek için ayrıntılı talimatlar, ipuçları ve püf noktaları, birlikte sağlamak. İşlevsel genomik çalışmalarda kullanılmak için WCR transgenik teknolojileri uzanan ek olarak bu teknikler de bunda ekonomik açıdan önemli test edilecek gen sürücü23,24 gibi güçlü yeni haşere kontrol stratejileri sağlar haşere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koloni düzeyi WCR yetişkin yetiştirme
- WCR yetişkin yeterli miktarda elde etmek (500-1000) üzerinden güvenilir bir şirket veya Araştırma Laboratuvarı ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) ve 30 cm3 kafese koyun.
Not: Bir sigara diapausing yük kullanımı önerilir. - WCR yapay diyet üreticisinin protokolüne hazırlamak ve 1 cm kalınlığında kat 38 oz konteyner içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek). Karıştırma sonra kullanılmayan diyet 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.
- Yetişkin diyet (10-15 g) ile Petri kabına (100 x 15 mm) 30 cm3 kafesin içine koymak. Yemek düşük veya kuru olduğunda daha fazla diyet ekleyin.
- Bir şişesi (300 mL) su, bir pamuk rulo (6 "x 3/8"), hizmet etmek için tutmak için kullanılan bir pamuk topağı ile kaplı ile bir su kaynağı olarak koymak. Bu azaldığında değişmek belgili tanımlık su.
- % 60 nem ile 26 ° C'de WCR korumak ve bir 14:10 ışık döngüsü kuluçka yetiştirme bir böcek.
2. embriyo toplama ve hizalama
- Bir yumurta toplama Odası %1 agar suda bir steril 100 x 15 mm2 ' Petri kabına kullanarak olun. Agar katılaşır sonra 4 ° C'de depolayın.
- Yeni koydu yumurta toplamak için filtre kağıdı, tülbent (her kesim boyutu için) 4 kat (şekil 1A) agar yüzeyinde ardından tek bir katman yer.
Not: Tülbent, yıkanmış çamaşır suyu ve autoclaved, kaldıktan sonra yeniden kullanılabilir ancak ilk kullanım için bunun gerekli değildir. Filtre kağıdı yeniden ve steril gerekmez. - Yumurta toplama plaka (son iş günü) olabildiğince kadar geç saatte WCR kafesin içine yerleştirin ve bir folyo çadır ile kaplayın. Gece bırakın.
Not: ışıklar saat 12 (14 h) gecikmeler yumurta için döşeme 10 saatleri arasında açık olması, böylece mikroenjeksiyon için genç yumurta toplama toplama odası gece geç saatlerde kafesin içine yerleştirmek laboratuvar personeli gerek kalmadan kolaylaştırmak. - Yumurta toplama Odası 8 veya 9'da kaldırmak
- Forseps tülbent 1 kat kadar bir zaman ve yerde bir ölçek (500 mL) su almak için kullanın. Yıkayın tülbent kapalı yumurta hafifçe karıştırarak (şekil 1B ve 1 C).
- Bir ampul pipet yumurta başka bir kabı (500 mL) su için aktarmak için kullanın. 2-3 x yumurta temizlemek için yineleyin.
- Ampul pipet su etkilenmişimdir miktarını en aza indirerek yumurta filtre kağıdı (şekil 1 d) üzerine aktarmak için kullanın.
- Siyah filtre kağıdı bir cam slayt ve kaset olarak geniş şeritler halinde kesin sıkıca emin olmak için slayda kağıt düz (şekil 2A) bırakır.
Not: Siyah filtre kağıdı yansıyan ışık miktarını azaltarak mikroskop altında görünürlüğünü artırmak yardımcı olur. - Toksik olmayan yapıştırıcı uygulamak ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) için filtre kağıdı ince çizgileri (şekil 2B) içinde. Tutkal satırları içinde tutkal boyalı yumurta almamak için bir yumurta çapı daha ince tut.
- İnce fırça yavaşça WCR Yumurtaları teker teker tutkal hattına onların filtre kağıdı taşımak için kullanın. Kurumadan uyuşmuşhalde yumurtlamak deneyin ve her yumurta arasında en az bir yumurta'nın uzak dur.
- Enjeksiyon verimliliği maksimize etmek yanında duvar ilanı yumurta birkaç satırlık bir filtre kağıdı slayt (şekil 3).
- Sonra tüm yumurta üzerinde filtre kağıdı koyulur, tüm tutkal mikroenjeksiyon önce kurur kadar bekleyin.
Not: en eski embriyo fazla 19 h eski olması germline dönüştürme ve düzenleme CRISPR/Cas9-aracılı genom, tüm embriyoların öğle vakti (12 üzerinde) enjekte et. Ancak, RNAi için olduğunu hiçbir zaman sınırlama WCR içinde dsRNA hücreler arasında hareket edebilir çünkü. Aslında, RNAi için yaşlanma embriyolar daha iyi sağkalım oranları neden olabilir.
3. hazırlık plazmid DNA'lar ve enjeksiyon iğneler
- Endotoksin-Alerjik bir ticari kullanarak yüksek kaliteli supercoiled plazmid DNA hazırlamak ( Malzemeler tablo bir örnek için bkz) kit.
- Enjeksiyon çözüm hazırlamak için her plazmid konsantrasyonu kontrol ve yardımcı plazmid (250 ng/µL son konsantrasyonu), donör plazmid (750 ng/µL son konsantrasyonu) ve fenol red arabellek (% 20 son konsantrasyonu) birleştirir. Girdap kısaca çözüm ve iğne yapışmasına neden parçacıklar çökelti maksimum hızda 3 dk santrifüj.
- Borosilikat cam iğneler (doz 1 mm, kimlik 0,58 mm, 10 cm uzunluk) çekin bir yanan/kahverengi türü micropipette çektirmenin kullanarak. Güvenli depolama için çift taraflı yapışkan bant Petri kabına veya diğer açık kapsayıcıda çekti iğne falan batmazdı.
Not: micropipette çektirme sistemi için kullanılan ayarları vardı: ısı 335, FIL = = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Is bir mikro-yükleyici kullanarak enjeksiyon iğne ipucu ( Tablo malzemelerigörmek) için damlalıklı 0.5 - 1.0 µL aşağı konik sonuna yakın iğne içinde. Oluşursa kabarcıklar iğneyi ucundan kaldır.
- Enjeksiyon iğne iğne bağı yerleştirin.
- İğne ucu hafifçe forseps güzel bir ikili ile kırma, ya da hafifçe dokunmadan/coverslip veya cam slayt üzerindeki sürükleyerek açın.
Not: Hala dışarı çıkmasını enjeksiyon karışım verir en küçük açılması için hedeftir (daha küçük açıklıklar genellikle daha yüksek enjeksiyon basıncı gerektirir). Onlar zaten açık olduğundan eğimli iğneler bu adımı gerekmez.
4. mikroenjeksiyon ve enjeksiyon sonrası bakım
- İyi bir fırça kullanarak, dikkatli bir şekilde steril su ile 1-3 yumurta yüzeyine ıslak, iğne yerleştirin ve çözüm enjekte. Yüzey kurumadan her yumurta enjekte et. Görünüm için kırmızı renk yumurta içinde az miktarda enjeksiyon sırasında başarılı mikroenjeksiyon belirtmek için bak. Ezmek veya bak hasarlı, boş veya aksi takdirde enjekte cant herhangi bir yumurta kaldırın.
Not: enjeksiyon basıncı iğne delik boyutu bağlı olarak değişir, 10-13 psi iyi bir başlangıç noktası olsa da. - Tüm yumurta enjekte sonra filtre kağıdı cam slayttan kaldırın.
- (Yukarıda açıklanmıştır) %1 agar çanak yüzeyi filtre kağıdı yerleştirin.
- Plastik parafin film çanak mühür ve 12 gün boyunca kuluçka yetiştirme 26 ° C böcek koymak için kullanın.
Not: Parafin film Çapraz kontaminasyon küf yemekleri arasında engellenmesine yardımcı olur. Ancak, küf ve bakterilerin büyüme önlemek için başka bir tedavi enjekte embriyo yaşama azaltmak olabilir.
5. Kültür ve embriyoların çıkım
- Embriyo 12 gün sonrası enjeksiyon yeni yumurtadan larva için kontrol edin ve her gün önümüzdeki 2 hafta boyunca devam edin.
- Larvalar, Filiz Mısır ve toprak bir yetiştirme kutusu için iyi bir fırça kullanarak aktarın.
Not: Kalıp agar tabak içinde büyümek, ama larva hala çoğu durumda yumurtadan. Larva hepsini yakalamak için dikkatli bir şekilde kalıp içinde arayın. Bazı larvaların çanak kapağı için hareket olabilir ve yoğunlaşma içinde sıkışıp. - Larva yetiştirme yöntemleri25standart WCR takip 26 ° C'de arka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı geliştirilirken önemli bir göz mikroenjeksiyon esnasında embriyonik gelişim aşaması oldu. Özellikle, DNA'lar mikroenjeksiyon embriyonik cellularization önce germline dönüştürme gerektirir. Bunun nedeni DNA'lar kolayca hücre zarlarında geçemez. Dechorionation WCR embriyo aslında tüm koruyucu membran embriyonun bütünlüğünü için sorumlu erir çünkü nükleer bir leke kullanarak WCR embriyonik gelişim aşamalarında görselleştirmek için girişimleri başarısız oldu. Ancak, bu satır soruşturma başka bir zorluk-embriyo yeterli miktarda zamanında edinme üstlenilmekle. Alanında, WCR dişiler yumurtalarını toprak, böylece laboratuarda, kadın sadece karanlıkta yumurtalarını bırakmak hiç de şaşırtıcı olmalı. Bu kısa gündüz koleksiyonları (2-4 h) zor yapar. Bu sorunu aşmak için tek bir gecede yumurta yatıyordu gerçekleştirilmiş ve embriyo büyük miktarlarda verim bulundu. (Şekil 1) toplama ve mikroenjeksiyon için (Şekil 2) embriyo dışarı atarken işlemi hızlı bir şekilde yapılırsa biraz zahmetli olsa da bu protokolü mikroenjeksiyon 2-19 h enjeksiyon anda eski ve Hayır arasında embriyo sağlar 24 iğne daha sonra gün içinde gerçekleştirilmesi durumunda h daha eski. Geliştirme kez WCR ve diğer türler arasında karşılaştırma öneriyor WCR embriyo hala 24 sonrası yumurta (konuya bakın) s precellular olmalıdır.
WCR germline dönüşümü, ilk deneme precellular embriyo yardımcı (transposase kaynak) ve donör (transposon) plazmid ortak enjeksiyon (şekil 3) söz konusu. Donör plazmid dönüşümün işaretçisi bir yeşil flüoresan protein (EGFP) gen Tribolium castaneum (Alfa-tübülin organizatörü26) yapısal etkin bir düzenleyici tarafından tahrik oldu. Embriyonik sağkalım oranları vardı düşük (Tablo 1) ama 26 G0 yetişkin iyileşti. Donör öğe embriyolar herhangi bir germ hücreleri G1 eklenen belirlemek için EGFP ifade için gösterildi. Her ne kadar floresan döl gerçekten tespit edilmiştir (şekil 4), WCR embriyo yoğun ışık kaynağı ile eleme olduğunu kanıtladı öldürücü27. Yeni bir donör plazmid, bir kırmızı floresan protein (DsRed) gen Drosophila melanogaster (ısı şok protein 70 organizatörü28 yapısal etkin bir düzenleyici tarafından tahrik sahip germline dönüşümü bir sonraki turda kullanılan ). Sağkalım oranları çok (Tablo 1) gelişmiş olmakla birlikte, hayatta kalan yetişkin sadece bir tek DsRed pozitif larva (şekil 5) üretti. Ancak, bu deneyler iki açısından özellikle bilgilendirici idi. İlk, keşfedildi bu mikroenjeksiyon geliştirme, bir genişletilmiş zaman-için-ambarda kaynaklanan gecikmeler neden oldu. 2 hafta içinde yumurtadan tüm embriyo yerine enjekte embriyo böylece gerektiren tüm yavru toplanmıştır emin olmak için bir genişletilmiş izleme süresinin 12 ve 26 gün sonrası mikroenjeksiyon arasında yumurtadan. İkinci olarak, yeni yumurtadan larva oldukça aktif olduğunu fark ettim. Onlar nereye onlar sıkışmış ve bazen agar çanak kaçtı kapağı üzerine sürünerek. Bu sorunlar Petri yemekler parafin film ile sızdırmazlık ve kapakları ve agar yavru için dikkatli bir şekilde inceleyerek tarafından üstesinden.
Bu enjeksiyon protokol son sürümü WCR embriyo arabellek yalnız veya yardımcı ve göz-promotor (3xP329) ile donör DNA plazmid işaretli microinjecting tarafından test edildi. Ek bir denetim embriyolar başka bir set-ele aynı şekilde değil microinjected ama. Embriyo dört setleri her iki enjeksiyon çözüm ile enjekte edildi. Toplam 485 embriyo enjekte arabellek ve yumurtadan o, 148 (kapağı oranı = %30.5, Tablo 1). Plazmid DNA'lar ile enjekte 1.450 embriyo 289 yumurtadan (oranı = %26,8). İlginçtir, aynı yumurta işleme koşulları uygulandı 470 embriyoların, ama mikroenjeksiyon olmadan, sadece 250 yumurtadan (oranı = %53.2). Uninjected embriyo hayatta kalma oranı % 20 enjekte embriyo sağkalım oranları daha yüksek olduğunu mikroenjeksiyon tarafından neden kaçınılmaz zarar nedeniyle beklenen bir şey. Ancak, arabellek enjeksiyon ve varlık mülhak DNA miktarı WCR için kabul edilebilir olduğunu göstermektedir DNA enjeksiyon arasındaki farkı az görülür (konuya bakın). Bu sonuçlar da sağkalım oranları önceki çabaları geliştirilmiş göster. Bu yöntemi kullanarak transgenic satırları başarılı kurulması oldu başka bir yerde27bildirdi.
Şekil 1: yumurta toplama. A) yumurta toplama odası. B) bir bölüm sonra 24-h yumurta bir yumurta odası görünümünü vınlamak içinde yatıyordu. Dikkat, oklar, birkaç yumurta konumunu gösterir. C) yumurta tülbent kapalı yıkama. D) WCR yumurta son transferi. Dikkat, ayraç, bölge yoğun paketlenmiş WCR embriyo (Yani en az su) ile gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: bir enjeksiyon slayt hazırlama. A) siyah filtre kağıdı sıkıca standart mikroskop slayda bantlanmış. B) bir bölümünü bir enjeksiyon vınlamak görünümü slayt hazırlama işlemi sırasında. Dikkat, ok #1 yumurta bir satırı, tutkal kısmi satır #2 ve #3 pin tutkal yaymak için kullanılan konumunu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: embriyo enjekte. Yumurta sekiz sıra bir enjeksiyon slayt. Enjeksiyon iğneyi açı nedeniyle, embriyo ardışık satırlar sahne hareket ettirerek parça atlamanızı enjekte edilebilir. Not kırmızı boya enjeksiyon iğne içinde büyük ölçüde görselleştirme enjeksiyon yardımcı olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Transgenik G1 embriyo. Embriyo piggyBacile birlikte eklenen bir WCR yetişkin gelen-bir erken embriyo yardımcı ve donör plazmid dayalı. Diğerleri olmayan parlak yeşil embriyo için geliştirilmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ifade pozitif çıktı. EGFP ifade Tribolium castaneum Alfa-tübülin organizatörü26tarafından tahrik edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Transgenik G1 larva. 3-biçim larva olan üst piggyBacile birlikte enjekte-helper ve donör plazmid erken bir embriyo dayalı. Sağdaki larva iken değil soldaki kırmızı parlayan larva DsRed ifade için olumludur. DsRed ifade Drosophila melanogaster ısı şok 70 organizatörü28tarafından tahrik edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Deney | Tedavi | Yumurta | Yumurtadan | Hatch oranı |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donör | 910 | 57 | % 6.3 |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donör | 1580 | 211 | % 13.4 |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donör | 1450 | 389 | %26,8 |
| Arabellek | 485 | 148 | %30.5 | |
| Hayır-enjeksiyon | 470 | 250 | %53.2 |
Tablo 1: mikroenjeksiyon veri. WCR embriyo yumurta enjekte toplam sayısı, başarıyla yumurtadan larva toplam sayısı ve kapağı hızı gösteren üzerinde üç mikroenjeksiyon deneyler dan oranları hatch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WCR mikroenjeksiyon RNAi amacıyla dsRNAs ile bildirilen9olmasına rağmen bu precellular WCR embriyo, germline dönüştürme yürütmek için kritik bir işlem microinjecting için en iyi yöntemler kurmak için ilk protokoldür ve/veya CRISPR/Cas9 genom içinde bu tür düzenleme. Dönüşüm verimliliği olduğu gibi WCR embriyo başarılı mikroenjeksiyon birçok etkene bağlıdır. Aşağıda açıklanan bazı önemli konuları bu böceğin germline dönüştürme için bu iletişim kuralını kullanan sonucu etkileyen vardır.
Precellular embriyo elde etme
Yukarıda belirtildiği gibi DNA hücre zarlarında yolu dsRNA olabilir çapraz değil. Bu çok kritik önemini cellularization oluşmadan önce DNA, mRNA ve/veya protein enjekte edilebilir olduğu anlamına gelir. Enjeksiyon zamanlaması önemli olduğundan, başarılı mikroenjeksiyon embriyogenez tamamlamak için nondiapausing WCR zorlanma30 ne kadar sürerse dayalı için büyük olasılıkla bir pencere belirlemek önemliydi. Bu bir zamanlama sinsisyal blastoderm sahne başka bir Beetle, Tribolium castaneumdetaylı çalışmalar temel alınarak hesaplanmıştır. Triboliumiçinde cellularization ~ 8 h sonrası yumurta yatıyordu 30 ° C31oluşur. Bu Tribolium için tam embriyogenez 30 ° C'de ~3.5 gün alır bu yana, cellularization bir şekilde onda sürecine gerçekleşir. WCR embriyo geliştirmek için âdeta 2 hafta almak beri ikinci gün sonrası yumurta kadar cellularization ortaya çıkmaz. Bu nedenle, başarılı mikroenjeksiyon için pencere en az 24 WCR gerektiren bu yana gecede yumurta yumurta yeterli miktarda mikroenjeksiyon için sağlamak için döşeme yararlıdır, h uzun, olduğunu kabul edildi. Bu yöntem başarılı transgenesis27için kullanılan iken, bu çok erken embriyo işleme onlara zarar neden olmaz sağlanan sonuçlar genç embriyolar, enjekte edilerek geliştirilebilir ki akla yatkın.
DNA kalite ve
DNA toplama başarılı dönüşüm içinde önemli bir rol oynar şaşırtıcı değil. Bu uzun plazmid DNA 1 mg/mL aşağıda son konsantrasyonu tutmak potansiyel toksisitesi enjekte embriyo32önlemek için gerekli olduğunu düşündüm. Şimdi eğer DNA nedeniyle geçmişin toksisite sorunlar vardı ve bunun yerine plazmid arıtma işleminden araba yere kirletici sonucu idi, bu kural inatla oldu belirsiz olmasına rağmen iki yıldır yapıştırılır. Ancak, son zamanlarda 1 mg/mL aşan sınırı sadece da bu iş öylesine-daha yüksek dönüşüm oranları elde edebilirsiniz mümkün olduğunu yumurta toksisite yokluğu plazmid arıtma kitleri gelişmeler nedeniyle olabilir spekülasyon önde gelen keşfettik, daha az kirletici kaynaklanan. Biraz daha yüksek mortalite oranları sonuçlanırsa bile arka WCR için gereken süreyi göz önüne alındığında, herhangi bir artış dönüşüm oranları yardımcı olur.
Mikroenjeksiyon önce yumurta yüzey yumuşatma
Triboliumfarklı olarak, (koryon) en dış yüzeyine WCR embriyo mikroenjeksiyon önce yumuşadı gerekir. Kuvars iğne kullanırken bile bu kritik bir adımdır. İdeal olarak, su tek embriyo enjeksiyon hemen önce uygulanması gereken ama 2-3 embriyo gruplarına teker teker chorions reharden önce mikroenjeksiyon gerçekleştirilebilir uygulanabilir. Bu adım iğneler genellikle koryon, böylece enjeksiyon girişiminin başarısız olmasına neden olan ve iğne ucu zararlı nüfuz başarısız olur. İğne başarıyla kuru koryon nüfuz edecek olursa, Ayrıca, enjeksiyon çözüm genellikle ortam basıncı yüksek olan embriyo içinde baskısı yüzünden sızdırıyor geri dışarı. Ancak, ıslak (yumuşatılmış) embriyo kuru ayırt etmek kolay. Özellikle, Kuru, embriyo ayrı var sert, yuvarlak şekli, su ilavesi bunların küresel görünümlerini kaybetmesine neden olur iken. Yumuşatma sadece kolayca nüfuz koryon iğne sağlar ama aynı zamanda dışarı enjeksiyon çözüm kaçak değil basınç embriyo yeterince içinde azaltır.
Nem ve kalıp
Enjekte embriyo embriyogenez boyunca sıcak, nemli bir ortamda tutulur. Bu koşullar sadece WCR geliştirme için mükemmel bir ortam sağlamak ama aynı zamanda küf büyümesini teşvik. Bu iki haftalık dönemde kalıp sık WCR embriyo konut agar Bulaşık sırası büyür. Ne yazık ki, embriyo yüksek nem gerektirir ve girişimleri azaltmak için daha düşük kapağı fiyatlarına sonuçlandı. İlginçtir, kalıp varlığı genellikle küçük kapağı oranları, çoğu embriyo sorunsuz kuluçkalık ile etkiledi. Ayrıca, küf gelişimi azaltmak için en iyi yolu kirlenmesini önlemek için gibi görünüyor bu yüzden antifungal tedavi WCR embriyo için zararlıdır; Araçlar, kapsayıcı ve mikroenjeksiyon sistemi kullanmadan önce temizlik ve küf sporları birçok laboratuar ortamlarında yaygın olduğundan en az microinjecting harcanan süre tutmaya çalışıyorum.
Sonuçlar
Bu iletişim kuralı daha fazla araştırmacılar WCR araştırmalarını transgenik teknolojileri istihdam sağlamak için tasarlanmıştır ve umut verici bir biçimde bu böcek kullanmak için ek transgenics teknolojileri, geliştirilmesinde yardımcı olacak. Sofistike transgenics tabanlı denemeleri Tribolium yapılan potansiyel olarak mutagenesis33 ve34düzenleme CRISPR tabanlı genom gibi WCR için adapte olabilir. Bu teknikler mikroenjeksiyon precellular embriyo gerektirdiğinden, bu protokolü sadece transposon tabanlı fonksiyonel genomik çalışmalar ve/veya CRISPR/Cas9-aracılı genom ama aynı zamanda pest genetik tabanlı yönetim stratejileri için düzenleme yararlı olacaktır 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Monsanto Mısır Rootworm bilgi araştırma programı hibe tarafından desteklenen, numara AG/1005 (için MDL ve YC) ve başlangıç fonlar MDL için NCSU verin. FC hibe Monsanto'nun Mısır Rootworm bilgi araştırma programı (AG/1005) ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (MDL) sayı MCB-1244772 verin. Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin. FC ve MDL gebe ve deneyler tasarlanmış; FC, PW ve SP deneyler yapılır; FC ve MDL sonuçları analiz; ve FC, NG ve MDL el yazması yazdı. Biz Teresa O'Leary, William Klobasa ve Stephanie Gorski WCR eleme konusunda uzman onların yardım için teşekkür ederim. Ayrıca Dr. Wade Fransızca (USDA-ARS, Kuzey Merkez tarımsal araştırma laboratuvarı, Brookings, SD) laboratuar koloniler ve yetiştirme protokolleri sağlayarak kurmak için yumurta gönderiler için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
