Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Summary

Iones del potasio contribuyen al reclinación potencial de la membrana de las células y la concentración extracelular de K⁺ es un regulador crucial de excitabilidad celular. Describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K⁺-microelectrodos selectivos. Uso de tales electrodos permite la medición de la dinámica de concentración de K⁺ eléctricamente evocado en rebanadas de hipocampales adulto.

Abstract

Los iones de potasio contribuyen significativamente al reclinación potencial de la membrana de las células y, por tanto, la concentración extracelular de K⁺ es un regulador crucial de la excitabilidad de la célula. Altera las concentraciones de efecto extracelular de K⁺ la excitabilidad celular y potencial de membrana reposo cambiando los equilibrios entre los Estados cerrados y abiertos inactivados para canales voltaje-dependientes del ion que subyacen a potencial de acción iniciación y conducción. Por lo tanto, es valiosa para medir directamente la dinámica extracelular de K⁺ en salud y los Estados enfermos. Aquí, describimos cómo realizar, calibrar y utilizar monopolar K⁺-microelectrodos selectivos. Les implantamos en rebanadas de cerebro hipocampo adulto para medir eléctricamente evocado dinámica de concentración de K⁺ . El uso juicioso de estos electrodos es una parte importante de las herramientas necesarias para evaluar los mecanismos celulares y biofísicos que controlan las concentraciones extracelulares de K⁺ en el sistema nervioso.

Introduction

Las concentraciones de iones de potasio están estrictamente reguladas en el cerebro, y sus fluctuaciones ejercen una poderosa influencia sobre el potencial de membrana en reposo de todas las células. A la luz de estos aportes críticos, un objetivo importante de la biología es determinar los mecanismos celulares y biofísicos que se utilizan para regular estrechamente la concentración de K⁺ en el espacio extracelular en diferentes órganos del cuerpo^{1 , 2}. un requisito importante en estos estudios es la capacidad de medir con precisión las concentraciones de K⁺ . Aunque muchos componentes qu....

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de investigación Animal del Canciller de la Universidad de California, Los Ángeles. Todos los ratones estaban alojados con disposición comida y agua ad libitum en un entorno de luz-oscuridad de 12 h. Todos los animales estaban sanos sin cambios de conducta evidentes, no participaron en los estudios anteriores y fueron sacrificados durante el ciclo de luz. Se recolectaron datos de experimentos de ratones adultos (6-8 semanas para todos los experimentos).

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Results

Para la medida selectiva del K extracelular⁺, preparamos microelectrodos selectivos recubiertas con una capa hidrofóbica a través de silanización de pipetas de vidrio de borosilicato limpio (figura 1A). Esta capa permite el ionóforo K⁺ que contiene valinomycin para descansar en la punta del electrodo y permitir solo K⁺ de flujo a través de una abertura estrecha en la punta del electrodo (figura 1B.......

Discussion

El método que Describimos aquí nos ha permitido evaluar la dinámica de K⁺ en respuesta a la estimulación eléctrica de collaterals de Schaffer en rebanadas hippocampal agudas de ratones adultos. Nuestro método de preparación K⁺ de microelectrodos selectivos de ion es similar al anteriormente descrito procedimientos^12,13,14,15. Sin embargo, este método tiene ventajas sobre c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Ratón: C57BL/6NTac ratones endogámicos	Taconic	Stock#B6
Microscopio	Olympus	BX51
Extractor de electrodos	Sutter	P-97
Ag/AgCl pellet molido	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Punta personalizada de microfil 28G Instrumentos	de precisión mundial	CMF28G
Varilla de tungsteno	A-M Systems	716000
Electrodos estimulantes bipolares	FHC	MX21XEW(T01)
Aislador de estímulos	Instrumentos de precisión mundial	A365
Grass S88 Estimulador	Grass Instruments Company	S88
Pipetas de vidrio de borosilicato Instrumentos de	precisión mundial	1B150-4
Placa A a D	Digidata 1322A	Axon Instruments
Amplificador de señal	Multiclamp 700A o 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Computadora de parche	Dell	n/a
Cloruro de sodio	Sigma	S5886
Cloruro de Potasio	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Bicarbonato de Sodio	Sigma	S5761
Fosfato de Sodio Monobásico	Sigma	S0751
D-glucosa	Sigma	G7528
Cloruro de Calcio	Sigma	21108
Cloruro de magnesio	Sigma	M8266
valinomicina	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimetil-3-nitrobenceno	Sigma	40870-25ml
Tetrakis de potasio (4-clorofenil)borato		Sigma 60591-100mg
5% dimetildiclorosilano en heptano	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Empresa química	14964
Ácido clorhídrico	Sigma	H1758-500mL
Sacarosa	Sigma	S9378-5kg
Micromanipulador de pipetas	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Lente objetivo	Olympus	PlanAPO 10xW