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Sondeando los límites del reconocimiento de huevo usando experimentos de rechazo de huevos a lo largo de gradientes fenotípicos

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57512
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 4, 5, 1
1Department of Biology, Long Island University-Post, 2Department of Animal Biology, School of Integrative Biology, University of Illinois, 3Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 4Department of Zoology and Laboratory of Ornithology, Palacký University, 5Institute of Vertebrate Biology, Academy of Sciences of the Czech Republic

Summary

Este protocolo proporciona pautas para el funcionamiento de huevo experimentos de rechazo: esquema técnicas de pintura experimental huevo modelos para emular los colores naturales de huevos del pájaro, realizando trabajo de campo y análisis de los datos recogidos. Este protocolo proporciona un método uniforme para realizar experimentos de rechazo de huevos comparables.

Abstract

Cría parásitos depositan sus huevos en nidos de otras hembras, dejando a los padres para eclosión y posterior de sus crías. Estudiar cómo cría parásitos manipulan hosts en criar a sus crías y cómo hosts detectan parasitismo proporcionan penetraciones importantes en el campo de la biología de coevolución. Parásitos de cría, como cucos y tordos, obtienen una ventaja evolutiva, porque no tienen que pagar los costos de criar a sus propias crías. Sin embargo, estos costos seleccionar para las defensas del huésped contra todas las etapas del desarrollo de parásitos, incluyendo huevos, sus jóvenes y adultos. Experimentos de rechazo de huevo son el método más común utilizado para el estudio de las defensas del anfitrión. Durante estos experimentos, el investigador coloca un huevo experimental en un nido de host y monitorea cómo responden los hosts. Color a menudo es manipulado, y la expectativa es que la probabilidad de discriminación de huevo y el grado de disimilitud entre el host y huevo experimental están relacionadas positivamente. Este documento sirve como guía para realizar experimentos de rechazo de huevo de describir métodos para crear colores de huevo consistente para el análisis de los resultados de tales experimentos. Se presta especial atención a un nuevo método con huevos único colores a lo largo de gradientes de color que tiene el potencial para explorar prejuicios de color en el reconocimiento del hospedero. Sin estandarización, no es posible comparar resultados entre los estudios de una manera significativa; un protocolo estándar dentro de este campo permitirá resultados cada vez más precisos y comparables para experimentos adicionales.

Introduction

Cría parásitos depositan sus huevos en los nidos de otras especies que pueden criar a sus pequeños y pagar los costos asociados con el cuidado de sus padres1,2,3. Este acto de engaño para burlar el anfitrión por parte del parásito y de detective para detectar el parásito por parte del host proporciona fuertes presiones selectivas sobre ambos actores. En algunos casos de parasitismo de cría aviar, reconocimiento del host de huevos parásitos diferentes selecciona para los parásitos que imitan a huevos de host, que produce una carrera de armamentos evolutiva entre huésped y parásito4. Estudio de parasitismo de cría es importante porque es un sistema modelo para la investigación de coevolución dinámica y toma de decisiones en el salvaje5. Experimentos de rechazo de huevo son uno de los métodos más comunes utilizados para el estudio de parasitismo de cría aviar en el campo y una herramienta importante que los ecologistas utilizan para investigar las interacciones interespecíficas6.

Durante el curso de los experimentos de rechazo de huevos, los investigadores típicamente introducen a natural o modelo huevos y evaluación la respuesta del hospedador a estos huevos experimentales durante un período estandarizado. Tales experimentos pueden implicar intercambiar huevos real (que varían en apariencia) entre nidos7o teñir o pintar las superficies de huevos real (opcionalmente agregando patrones) y volver a su original nidos8o generar modelo huevos han manipulado los rasgos como color9, manchado10, tamaño11o12de la forma. La respuesta del huésped a los huevos de diferente aspecto puede proporcionar información valiosa sobre el contenido de información que utilizan para llegar a un huevo rechazo decisión13 y lo diferente que debe ser para provocar una respuesta14de huevo. Aceptación óptima umbral teoría15 Estados que hosts deben equilibrar los riesgos de aceptar erróneamente un huevo parásito (error de aceptación) o retirar por error sus propios huevos (error de rechazo) examinando la diferencia entre sus propios huevos (o un plantilla interna de los huevos) y los huevos parásitos. Por lo tanto, un umbral de aceptación existe más allá de que hosts decidan que un estímulo es muy diferente a tolerar. Cuando el riesgo de parasitismo es baja, el riesgo de errores de la aceptación es menor que cuando el riesgo de parasitismo es alto; por lo tanto, las decisiones son específicos del contexto y cambiarán apropiadamente como riesgos percibidos cambio14,16,17.

Teoría del umbral de aceptación óptima supone que hosts basan las decisiones sobre la variación continua de fenotipos anfitrión y parásito. Por lo tanto, medir las respuestas de host a diferentes fenotipos de parásitos es necesario establecer cómo tolerante es una población de acogida (con su propia variación fenotípica) a un rango de fenotipos parasitarios. Sin embargo, prácticamente todos los estudios anteriores han confiado en categóricos huevo color y maculation tratamientos (por ejemplo, mimetic/no-mimético). Sólo si los fenotipos de cáscara de huevo del anfitrión no varía, que no es una expectativa biológicamente práctica, todas las respuestas sería directamente comparables (independientemente del grado de la mímica). De lo contrario, un modelo "mimética" huevo variará en lo parecido es a los huevos del anfitrión dentro y entre poblaciones, que potencialmente podrían llevar a confusión cuando se comparan resultados18. La teoría sugiere que alojan las decisiones se basan en la diferencia entre el huevo parásito y sus14, no necesariamente un color huevo parásito particular. Por lo tanto, utilizando un tipo de modelo solo huevo no es un enfoque ideal para probar las hipótesis en los umbrales de decisión de host o de capacidades de discriminación, a menos que la diferencia apenas perceptible (de ahora en adelante y) entre el tipo de modelo de huevo y el color de huevo host individual es la variable de interés. Esto también se aplica a estudios experimentales que intercambiar o agregar los huevos naturales para poner a prueba las respuestas del anfitrión a una gama natural de colores19. Sin embargo, mientras que estos estudios permiten variaciones en fenotipos de huésped y parásito, están limitados por la natural variación en rasgos6, si se utiliza de la misma especie huevos7.

Por el contrario, los investigadores huevos artificiales de colores variados que están exentos de los límites de variación natural (por ejemplo, pueden investigar las respuestas a superstimuli20), lo que les permite a los límites del host percepción6. La investigación reciente ha utilizado técnicas novedosas para medir respuestas de host a través de una variedad fenotípica, por huevos de pintura experimental diseñados para igualar y superar el rango natural de variación en cáscara de huevo9 y colores21. Estudiando las respuestas de los host a los huevos con colores a lo largo de gradientes puede revelar procesos cognitivos subyacentes porque las predicciones teóricas, tales como los umbrales de aceptación15 o mímica coevolucionaron4, se basan en las diferencias continuas entre rasgos. Por ejemplo, mediante este enfoque, Dainson et al. 21 establece que cuando el contraste cromático entre la coloración de la cáscara de huevo molido y coloración spot es mayor, el Robin americano Turdus migratorius tiende a rechazar huevos más fuertemente. Este hallazgo proporciona información valiosa sobre cómo este host procesa la información, en este caso a través de la observación, para decidir si sacar un huevo de parásito. Mediante la personalización de mezclas de pintura, los investigadores pueden manipular precisamente la similitud entre el color de un huevo experimental y huevo del anfitrión, mientras otros factores de confusión tales como manchas de huevo, huevo tamaño22 y patrones10de normalización forma23.

Para fomentar más la replicación y metareplication24 de trabajo rechazo de huevo clásico y reciente, es importante que los científicos utilizan metodologías que se estandardizan a través de la filogenia (diferente especie)7,22, (poblaciones de diferente host)7,22,25,26 de espacio y tiempo (estaciones de crianza diferentes)7,22,25,26 ,27, que fue hecha solamente raramente. Metodologías que no estaban estandarizadas28 mostraron más adelante conducir a resultados artefactuales29,30. Este documento sirve como un conjunto de directrices para los investigadores que buscan replicar este tipo de experimento de rechazo de huevos que examina las respuestas a la variación continua y destaca una serie de conceptos metodológicos importantes: la importancia de jerarquías de control, hipótesis a priori , metareplication, pseudoreplication y color y análisis espectral. A pesar de los experimentos de huevo rechazo dominando el campo de la coevolución parásito huésped aviar, ningún protocolo integral existe todavía. Por lo tanto, estas directrices será un valioso recurso para incrementar la inter-intra-laboratorio y repetibilidad como la verdadera prueba de cualquier hipótesis es metareplication, es decir, repetir estudios enteros a través de la filogenia, espacio y tiempo24, que sólo puede ser significativo hacer al usar métodos consistentes29,30,31.

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Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Long Island-Post.

1. mezcla acrílico pinturas

  1. La coloración de la cáscara de huevo molido, que es el color que cubra uniformemente toda la superficie de cáscara de huevo de la mezcla. La siguiente receta hará 50 g de la pintura, que llenará un poco más de dos tubos de pintura de aluminio de 22 mL.
    1. Generar un color azul verdoso, que representa a una cáscara de huevo azul-verde (e.g., una cáscara de huevo del Robin americano T. migratorius ), usando 18,24 g de turquesa de cobalto claro, 20,77 g de blanco titanium 6,52 g de cobalto verde y 2.86 g de turquesa de cobalto y 1,61 g de umber quemado.
    2. Generar un color marrón, que representa a una cáscara de huevo marrón (p. ej., una cáscara de huevo de gallina Gallus gallus domesticus ), con 4,12 g de óxido de hierro rojo, 9,75 g de naranja de cadmio, 22,15 g de crudo luz ocre oscuro y 13,97 g de blanco de titanio.
    3. Generar un color beige, que representa a una cáscara de huevo de color beige (p. ej., una cáscara de huevo de codorniz japonica del Coturnix ), usando 10,60 g de color de huevo marrón, 8,28 g de color azul verdoso, 18,51 g de blanco de titanio y 12,61 g de amarillo ocre.
    4. Generar un color blanco con blanco de titanio sin mezclar.
  2. Mezcla de color de punto marrón oscuro que representa los puntos encontrados en los huevos de codorniz C. japonica , con 8,38 g de color de huevo marrón, 26,04 g de umber quemado y 15,59 g de negro de Marte.
  3. Mezclar colores intermedios que abarca toda la gama de color cáscara de huevo de azul verdoso a café, mezclando pinturas azul-verde y marrón y variando su aporte recíproco (p. ej., partes de azul y verde a marrón pintura: 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 y 0:10, ver Figura 1E).
    1. Para generar más colores intermedios, simplemente mezcle cantidades incluso de estos colores intermedios y repetir hasta crear el número de colores únicos. El incluso mezcla de azul y verde y marrón producirán un color gris neutro, pero este color puede ser ajustado con blanco o beige según sea necesario. Si un color más exacto (por ejemplo, de un huevo de host específico) es necesario, utilice modelos de mezcla de color sustractivo para predecir la reflectancia espectral de combinaciones únicas de las pinturas y la mezcla produciendo menor diferencia apenas perceptible (JND) para el deseado de color (ver pasos 3.3 – 3.7).
  4. Guarde la pintura en tubos de pintura de aluminio de 22 mL vacía.
    1. Coloque la pintura en una bolsa de sandwich de plástico con una pequeña porción de una esquina cortada. Coloque el extremo de la bolsa de plástico en el tubo y apriete la pintura en el tubo, golpeando ligeramente el tubo suavemente contra la mesa.
    2. Sello de tubo utilizando el borde adhesivo y doblar el extremo sobre sí mismo al menos 3-4 veces.

2. la pintura Experimental huevo modelos

  1. Obtener modelos de huevo experimental.
    1. Imprimir huevos modelo utilizando tres dimensiones (en adelante, 3D) impresora o compra en un distribuidor28. Este enfoque simple se recomienda porque genera huevos que son de tamaño constante y forma28.
      Nota: Huevos modelo también pueden ser modelados de yeso, arcilla, madera u otras sustancias.
  2. Añadir una capa uniforme de blanco de titanio sobre cada huevo para obstruir el color subyacente.
  3. Mantener cada huevo con unas pinzas, pintura del color deseado, utilizando pinturas acrílicas de alta calidad y un pincel limpio para cada huevo de color único.
  4. Use un secador de pelo en un lugar fresco para acelerar el proceso de secado de cada huevo recién pintada.
  5. Utilice un papel de lija para pulir cualquier baches que puedan haber en el huevo una vez que el huevo esté completamente seco.
    1. Repita el paso 2.3 hasta que el huevo tiene una capa uniforme de pintura sin ningún grumos. Huevos requieren no menos de dos capas.
  6. Añadir cualquier manchas de huevos modelo cuidadosamente aplicando con un pincel y salpicaduras con cuidado la pintura con un cepillo de dientes. Es necesaria solamente una sola capa.
    PRECAUCIÓN: Si se desea la reflectancia de (UV) ULTRAVIOLETA de replicación, aplique una capa uniforme de pintura Ultravioleta; sin embargo, no es recomendable a menos que se obtiene permiso para usar estas pinturas de institucionales, estatales/provinciales y federales que permitan a las oficinas.

3. cuantificación de Color

  1. Encienda el espectrómetro pulsando el botón de encendido.
  2. Inserte la tarjeta SD en la ranura para tarjetas SD y enlace que el sistema pulsando el rojo cancelar botón, seleccione "File System" pulsando el botón verde de aceptar, seleccione "Encontrar tarjetas de SD" pulsando el botón menú. Luego, pulse el botón rojo cancelar dos veces o pulsando el botón de inicio.
  3. Conecte los cables de fibra óptica y el espectrómetro de luz fuente.
    1. Conecte el extremo marcado con "Fuente de luz" para el módulo de luz y conecte el extremo marcado con "Espectrómetro" al módulo de espectrómetro.
  4. Inserte la punta de la sonda en el extremo de la sonda de fibra óptica.
    Nota: Una ejemplo la punta para imprimir en una impresora 3D está disponible como un archivo de código suplementario. Este objeto requiere roscar un tornillo de su elección.
    1. Establecer una distancia (por ejemplo, 5 mm) entre la muestra y la sonda de medición que maximiza la relación señal a ruido. Garantizar una distancia de medición consistente utilizando una regla flexible.
      Nota: La distancia exacta variará con la combinación única de cada individuo del espectrómetro de rejilla y slit width, anchura óptica y fuente de luz. Mantener la misma distancia de todas las medidas. Una regla flexible está disponible para descarga como un archivo de código suplementario.
    2. Utilice un ángulo coincidente medida normal (90°), a menos que el modelo huevos o huevos del anfitrión natural tienen una superficie brillante, en cuyo caso usar un ángulo de 45° medición oblicua coincidente. Medir todos los huevos, reales y artificiales, utilizando el mismo ángulo.
    3. Lavar la punta de la sonda con etanol al 95%.
  5. Encienda la fuente de luz con la tecla hacia abajo tres veces, selecciona PX-lámpara pulsando el botón verde de aceptar, seleccione configuración pulsando el botón derecho, seleccione "Controles de calendario" pulsando el botón derecho, haga clic en el abajo botón tres veces y luego seleccionar funcionamiento libre con el botón aceptar de.
    1. Espere al menos 15 minutos antes de tomar cualquier medida.
  6. Calibrar y configurar el espectrómetro. Para hacer esto, pulse el botón Inicio y, a continuación, seleccione «Herramientas» presionando el scroll izquierda botón, seleccione "Control Manual" pulsando el botón menú y seleccione "Parámetros de adquirir" pulsando el botón menú.
    1. Set vagones suavizado a cinco pulsando el botón derecho, moviendo el cursor a los derecha dos espacios presionando botón derecho dos veces, y luego aumentando el ajuste de vagón de carga pulsando el menú botón cinco veces. Seleccione "Aceptar" pulsando el botón verde de aceptar una vez finalizada.
    2. Establecer promedios a 10 presionando el menú botón, luego hacia la derecha dos lugares pulsando botón derecho dos veces y ajustando el valor de las decenas lugar pulsando el botón menú una vez y moviendo a los lugar pulsando la tecla derecha o de desplazamiento NCE y reducir esto a cero pulsando el menú botón una vez. Seleccione "Aceptar" pulsando el botón verde de aceptar una vez finalizada.
    3. Pulse el botón Inicio, seleccione reflectancia pulsando el botón menú y coloque la sonda firmemente en el estándar blanco. Luego guarde un estándar de referencia blanco presionando el botón menú. Almacenar un oscuro estándar pulsando el botón derecho y ver la reflectancia pulsando el menú botón.
  7. Medir la reflectancia de cada cáscara de huevo seis veces midiendo dos veces cerca al poste embotado (extremo ancho del huevo), dos veces en el Ecuador del huevo y dos veces cerca el polo agudo (extremo más estrecho). Asegúrese de informar si los puntos son evitados o no. Llevar a cabo esto en huevos experimentales, así como huevos del anfitrión.
  8. Utilice una función polinómica ponderada localmente con un 0.25 nm alisar span para suavizar el ruido en las curvas de reflectancia, uso de software de análisis de color29. Si cuentas de color, como brillo, no son repetibles significativamente entre las regiones del modelo huevo (paso 3.7), pintar el huevo (pasos 2.2-2.6); promedio de lo contrario, la coloración de modelo de huevo en el huevo.
  9. Decidir sobre el conjunto de sensibilidades relativas del fotorreceptor para la pregunta más apropiado.
    Nota: Esto puede ser un genérico ULTRAVIOLETA sensible o violeta sensible pájaro, o una vez elegir modelo sensibilidad relativa30,31,32.
  10. Cuantificar quantum capturas33 para cada fotorreceptor, solo34 y dos conos35,36, integrando el producto de la reflectancia de cáscara de huevo, sensibilidades de fotorreceptor y un apropiado espectro de irradiación en el espectro visual aviar (es decir, 300 – 700 nm).
    1. Quantum relativo uso captura de estimaciones para generar coordenadas en el espacio de color tetraédrico aviar33,37. Asegúrese de que, a diferencia de las capturas de quantum, estos quantum relativo coge sumas a 1.
  11. Capturas de quantum de uso (paso 3.10) para estimar la discriminabilidad de la JND, entre cáscara de huevo de host (ver paso 2.6.1) de color y los colores percibidos de cada huevo extranjeros utilizando nervios ruido limitado visual modelo32 , 38 , 39.
    1. Medir la coloración de cáscara de huevo de host usando el espectrómetro de la misma y fuente de luz usado para medir los huevos del modelo (paso 3.7), si es posible.
      Nota: Consideraciones prácticas o logísticos pueden hacer esto imposible, en cuyo caso medir un subconjunto de los huevos de host de diferentes nidos para establecer una coloración host media cáscara de huevo.
    2. Usar una fracción de Weber para el cono sensible a la onda del largo de 0.140.
    3. Cuenta la relativa abundancia de conos y el miembro principal del doble cono30.
      Nota: Si los colores de huevo son en un gradiente correspondiente a los colores naturales de cáscara de huevo, y entre el host y huevo experimental puede ser multiplicado por 1 o -1 para distinguir diferencias en ambos extremos (p. ej., azul, verde o marrón, vea pasos 1.1.1–1.1.2). Si huevo colores utilizados caen a través de gradientes múltiples o llenan el espacio de color, un resumen de las diferencias de color perceptible entre huevos usando diagramas de cromaticidad perceptualmente uniforme41. Las coordenadas dentro de este tipo de diagrama describe la dirección y la magnitud de las diferencias de color percibidas entre huevos experimentales y host huevo color y estos se pueden utilizar en más análisis.

4. trabajo de campo

  1. Determinar las especies a estudiar.
    Nota: Factores a considerar incluyen (pero no están limitados a) la abundancia de la especie huésped o parásito y si el propietario es un asimiento42 o punción43 rejecter, que afectará el tipo de huevo que se utilizará (por ejemplo, no utilice duro huevos modelo artificial por punción eyectores44).
  2. Sistemáticamente la búsqueda de nidos en el área de estudio. Verificación anteriores registros de anidación que pueden proporcionar un punto de partida razonable en algunas especies45.
    Nota: Los marcadores visibles o marcar puede aumentar el riesgo de depredación46; por lo tanto, considerar el uso de un GPS de mano en lugar de otro.
  3. Supervisar los nidos diario usando métodos de grabación directa o video para registrar la presencia de cada huevo del anfitrión hasta el inicio del experimento (paso 4.4); por ejemplo, un día después de la terminación del embrague.
    Nota: Este seguimiento diario continuará hasta que el experimento ha concluido (paso 4.6).
    1. Escuchar las llamadas de alarma por los adultos y salir del área si continúan por más de 30 s. No acercarse a un nido cuando cualquier depredador de nidos potenciales, especialmente si es un depredador visualmente orientado (e.g., córvidos).
    2. Enfoque y dejar nidos de diferentes lugares, es decir, junto a los nidos, para que mamíferos depredadores no pueden seguir señales químicas directamente a nidos.
      Nota: Este enfoque puede ser inviable en algunos hábitats, es decir densos juncales.
    3. Siempre reducir al mínimo la alteración física a la jerarquía y el área alrededor del nido.
    4. No acercarse a nidos durante el periodo de nidificación, ya que muchas aves abandonarán los nidos si tienen perturbados antes de la puesta de huevos46.
  4. Suavemente agregar un huevo experimental al nido de un anfitrión deslizante en el lado de la taza del nido. No deje caer los modelos experimentales, ya que puede dañar los huevos del anfitrión.
    Nota: Asignar los tratamientos al azar.
    1. Registrar si los padres de acogida permanece cercano y así tiene la oportunidad de presenciar el acto de parasitismo artificial47. Control para una variable que indica si el host fue limpiado de la nido47registro y estadísticamente. Realizar presentaciones del huevo mientras que el padre está lejos.
    2. Recoger un huevo de host si el parásito en el sistema quita un huevo de host.
      Nota: Esto no puede ser necesario en anfitriones donde retiro del huevo no afecta a las respuestas del host a huevos experimental22.
  5. Emplear un conjunto de jerarquías de control (nidos que son visitados, comprueban y huevos huevo manipulado pero no experimental se agrega o se intercambian) para determinar las tasas de deserción del nido natural. Quitar un huevo de host de la jerarquía de control sólo si se retiran de los nidos experimentales (ver paso 4.5.1).
    Nota: Esto es crucial porque la deserción no puede ser una respuesta dirigida a ciertos extranjeros huevos pero puede ser una respuesta para otros tipos de huevo.
    1. Elija el número de nidos de control a priori basado en los tamaños de muestra conocida o esperada y Estimado efecto. Asignar cada nido nth como un nido de control hasta obtener determinación estadística de deserciones de nido sean una respuesta del huésped a los huevos experimentales o no puede ser (paso 5.1).
      Nota: Si se quita un huevo de host, quite el mismo número de huevos del anfitrión como en el tratamiento experimental, mantener un huevo en la mano para 5 s y luego volver a colocarlo y permanecen en el nido para el mismo período de tiempo como tratamiento de nidos. Si no se eliminan los huevos del anfitrión, mantener un host del huevo en la mano para 5 s y luego reemplazarlo, permanecen en el nido durante el tiempo que pasó en nidos experimentales (por ejemplo, 10 s).
  6. Revisar la jerarquía suficiente para determinar la respuesta en el nido de cada host, incluidos los controles. Revise el nido dentro de unas horas de la manipulación experimental.
    Nota: En algunas especies, rechazos pueden ocurrir el mismo día como parasitismo experimental; por lo tanto, es importante revisar el nido dentro de unas horas de la manipulación experimental48.
    1. Use un espejo telescópico al revisar el nido para evitar el contacto directo con el nido o el embrague.
    2. Evite observaciones meteorológicas (lluvia, calor o frío) porque esto puede aumentar el peligro para los polluelos y los huevos46.
    3. Realizar controles diarios hasta que el host ha respondido que el huevo introducido o una cierta cantidad de tiempo transcurrido.
      Nota: Por Convención, si el huevo permanece en el nido por 5 a 6 días, el anfitrión se considera un aceptador22; sin embargo, algunos individuos host responden incluso después49 y omisión de tales respuestas necesariamente sesgos estimaciones de tasa de rechazo de huevo. Idealmente, los investigadores deben determinar el superior intervalo de confianza family-wise de 95% de la latencia al rechazo en su sistema y utilice esto como su criterio.

5. estadísticos análisis

  1. Utilizar la prueba exacta de Fisher en un estudio perfectamente aleatorio (es decir, experimental y control los nidos se entremezclan perfectamente y así no se diferencian en la colocación de fecha, embrague o cualquier otro parámetro afectan la deserción del nido) para comparar el número de deserciones entre nidos de tratamientos y control (paso 4.5). De lo contrario, usar un modelo lineal generalizado (GLM) con covariables potencialmente relevantes (véase abajo), como un enfoque generalmente más cauteloso.
    1. Si nidos experimentales tienen una significativamente mayor tasa de deserción que nidos de control, código de ambos huevos y huevos abandonados como 'rechazaron'.
      Nota: Por Convención el host ha 'rechazado' el huevo cuando ha reconocido el huevo parásito y sea eliminado o abandonados (con el nido entero).
    2. Si las tasas de deserción no diferencian entre experimentales y control de nidos, excluir deserciones desde el análisis, porque no son una respuesta del huésped a parasitismo y código de respuestas como 'expulsado'.
      Nota: Por Convención, 'expulsa' se refiere a cuando realmente se ha quitado un huevo de su nido.
    3. Registrar la fecha y hora cuando el host ha rechazado el huevo. Recodificar la variable de respuesta dependiendo de su hallazgo en pasos 5.1.1–5.1.2.
  2. Informe de prueba exacta de Fisher, su cociente de las probabilidades asociadas y su correspondiente intervalo de confianza.
  3. Decidir sobre cualquier covariables significativas que serán incorporadas a modelos predictivos (p. ej., pasos 5.4-5.5).
    1. Especificar la codificación (por ejemplo, continua y categórica ordinal) de cada covariable.
    2. Código de fechas como días ordinales y confundir fechas de centro por separado en años para eliminar cualquier potencial debido a la variación atribuible a años o estacionalidad7,47,50,51.
    3. Centro de cualquier covariables implicadas en una interacción para permitir una más fácil interpretación de sus términos de orden inferiores en la salida del modelo.
      Nota: Escala covariables permite la sencilla comparación de efectos entre los estudios y a veces puede mejorar la convergencia del modelo.
  4. Predecir las respuestas del host (expulsar o rechazar vs aceptan) usando un modelo lineal generalizado (GLM) o un modelo mixto lineal generalizado (GLMM) con una distribución de error binomial y función de enlace logit.
    Nota: La opción entre un GLM o GLMM depende de los datos y si se incluye un efecto aleatorio (por ejemplo, ID de nido, año). Factores aleatorios deben tener al menos 5 niveles de variaciones tienen probabilidades de ser mal estimado52.
    1. Informe el coeficiente de determinación (generalmente R2) para mostrar qué proporción de la varianza se explicó por un modelo lineal53,54.
  5. Predecir cuánto tiempo tarda el ave para responder al parasitismo experimental utilizando un GLM con una distribución de error binomial negativo (o una distribución de Poisson error si los datos no están overdispersed) y registro de enlace.
    Nota: Investigadores se refieren a la longitud de tiempo que tarda para que un pájaro responder como 'latencia de respuesta,' lo que se informa con precisión a los días, que rechazó en el día del experimento los huevos tener una latencia de cero. Modelo las variables de respuesta con muchos ceros (> 50%) con cero inflado o cañizo modelos55.
  6. Utilizar herramientas de diagnóstico para comprobar si el modelo predice los datos satisfactoriamente y el informe estadístico Resumen modelo para cuantificar qué proporción del modelo de varianza explicado56 , 57. coeficiente de determinación (generalmente R2) de informe, vea el paso 5.4.2.
    1. Validar modelos binomiales negativa mediante validación gráfica produciendo un diagrama del quantile-quantile y trazar residuos de Pearson contra los valores ajustados.
      Nota: Un modelo bien administrado no tendrá afloramientos o patrones inesperados55.
    2. Validar modelos binomiales mediante pruebas de bondad de ajuste Hosmer-Lemeshow pruebas y otros diagnósticos disponibles en el paquete de R, 'binomTools'58 que contiene el conjunto de herramientas de diagnóstico.
  7. Considerar control de covariables consistente para fines de consistencia y comparabilidad entre los estudios.
    Nota: Covariables comunes incluyen embrague tamaño22, poniendo la fecha59, nido edad manipulación49, y si el anfitrión fue el nido o no47. Muchos, especialmente tempranos, estudios no utilizaron ningún covariables. Autores deben considerar además analizar las efectos de los tipos de huevo (o varios gradientes) sin covariables para hacer sus resultados cuantitativamente comparable a estos estudios que careciendo de covariables.
    1. Usar una aproximación teórica a la información e informar el resultado de un promedio de muchos posibles modelos explicando host comportamiento60.
      Nota: Alternativamente, utilizar análisis de regresión paso a paso como un modelo de algoritmo selección61. Investigadores deben utilizar un criterio predefinido (por ejemplo, ajustado R2, de malvas Cp, de Akaike Information Criterion, de Schwarz BIC o valor p) y proporciona el modelo completo (con covariables comunes) y un modelo reducido final.

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Representative Results

Generación de modelos de huevo colorido

Espectros de reflectancia de huevos naturales y mezclas de pintura personalizada se muestran en la figura 1A-D. Mezclas de pintura usados en estudios de parasitismo de cría deben corresponder con las mediciones de reflectancia natural en cuanto a la forma espectral (color) y magnitud (brillo). Si eso se logra, el color del huevo experimental debe ser percibido por el anfitrión como un color de huevo natural. Para evaluar el reconocimiento del hospedero, estos reflectancias se convirtiera en un espacio de color aviar pertinentes. Para ello, el producto de estos espectros de reflectancia, irradiación solar y la sensibilidad de los fotorreceptores pueden ser integrado para calcular el quantum capturas33. Opinión de color aviar es diferente en los seres humanos, porque las aves ver colores con cuatro, en lugar de tres fotorreceptores. La captura de cuántica de estos cuatro receptores puede transformarse en coordenadas dentro de un espacio de color tetraédricos (Figura 1E), donde cada vértice representa la estimulación relativa de un fotorreceptor específico: ULTRAVIOLETA, corto, mediano y largo 37de fotorreceptores sensibles a la longitud de onda. Coordenadas dentro de este espacio proporcionan un método para comparar colores y diversidad fenotípica de colores, que es relativamente limitado con respecto al color de las cáscaras de huevo de aves62. Ploteo color huevo experimental en un espacio de color es importante porque sus coordenadas dentro de ese espacio va a determinar si estos huevos parece naturales. La figura 1 muestra los colores de pinturas personalizadas (puntos de colores, letras corresponden con los espectros de reflectancia se muestra en la figura 1A-D) que se describen en este documento y cómo se comparan con colores de cáscara de huevo de los pájaros naturales. Este nuevo enfoque ofrece oportunidades para nuevos diseños experimentales y puede proporcionar nuevas penetraciones en reconocimiento del huevo hospedero.

Cuantificación de las respuestas de host color cáscara de huevo

Explícita o implícitamente, todos sino un estudio previo de9 ha asumido que hosts responden a diferencias de rasgo, por ejemplo, la diferencia entre un huevo de parásito y sus el propios, de manera absoluta o simétrica (figura 2, discontinua). Esta diferencia varía generalmente de idéntico (0) a infinitamente diferentes; sin embargo, la mayoría de los rasgos varían a lo largo de múltiples dimensiones y no una razón priori asumir sus respuestas debe ser similar en todo el espacio fenotípico. Investigación que manipula los rasgos a través de su gama completa fenotípica (figura 2, sólido), puede probar esta hipótesis. Para dos Turdus spp., Hanley et al. 9 encontró que entre un huevo azul-verde y marrón, ambos igualmente diferente de la sede propia, el huevo marrón era más probable ser rechazado. Utilizando modelos de huevo con coordenadas conocidas dentro de un espacio de color estándar aviar (Figura 1E), los investigadores pueden trabajar dentro de la gama fenotípica natural o extender ese rango fenotípico (p. ej., azul verdoso o marrón) para explorar la respuesta del huésped y los límites perceptuales del reconocimiento del hospedero. Este enfoque ofrece un contexto (basado en el espacio fenotípico) para entender las respuestas de los anfitriones.

Cuantificación de las respuestas de host a manchas de color cáscara de huevo

Un reciente estudio21 demostró que robins americanos son más propensos a rechazar huevos experimentales manchados cuando perciben esos puntos como más marrón que el color azul y verde de la cáscara de huevo (figura 3). Este host pone huevos sin manchas, pero su parásito la cabeza marrón renegrido Molothrus ater tiene manchas y por lo tanto, esta regla de decisión parece adaptable. Estos resultados refuerzan los resultados anteriores que han mostrado que robins americanos basan las decisiones en ambos tierra color y manchas13; sin embargo, midiendo sus respuestas a través de un color degradado Dainson et al pudieron establecer que robins americanos utilizan el contraste cromático entre la tierra y mancha de color en el huevo de las decisiones de rechazo21. Diseños experimentales empleando tal constante variación en coloración permiten a los investigadores estudiar el papel de anfitrión sensorial y mecanismos perceptivos en reconocimiento del huevo más a fondo.

Figure 1
Figura 1: variación representativa en colores naturales de cáscara de huevo aviares y artificiales. Los diez reflectancia espectral medidas de (A) el azul verde, beige (B), (C) marrón blanco (D) y (E) mezclas de pintura marrón oscuro (1.2.1 a 1.2.5, líneas sólidas) junto a la reflectancia de un huevo real con un aspecto similar: robin americano (A) T. migratorius, (B) codorniz C. japonica, un marrón (C) y (D) blanco huevo de gallina doméstica Gallus g. domesticus (líneas discontinuas). El pico de reflectancia ULTRAVIOLETA en (D) es debido a la eliminación de la cutícula67. Fotografías de huevos los huevos artificiales e izquierdos a la izquierda a escala real de la inserción (la barra superior "artificial" representa 1 cm). La imagen del huevo de codorniz real (recuadro B) fue modificada de una fotografía tomada por Roger Culos que está licenciado bajo CC por 4.0. Ilustramos a aves adultas como imágenes de inserción (créditos de la foto del pájaro inserciones A-d respectivamente: Tomáš Grim, Ingrid Taylar bajo CC por 2.0, Sherooly Dejungen bajo CC-BY-SA-3.0). Los colores percibidos aviares también se trazan en el espacio de color tetraédrico aviar (E) para el espectador aviar de medio sensible a la radiación ultravioleta. Los vértices representan la estimulación relativa de la luz ultravioleta (U), corto (S), mediano (M) y largo fotorreceptores sensibles a la longitud de onda de (L). Puntos grises representan los colores de los huevos aves naturales a través de la diversidad filogenética total66, de datos previamente publicados68, mientras que los puntos de colores representan los colores de las formulaciones de pintura personalizada aquí (pasos de 1.1.1 a 1.2), y pequeños sólidos puntos representan colores intermedios (paso 1.3). Letras cursiva al lado de puntos coloridos referencia reflectancias espectrales que se muestra en esta figura, mientras que (e) referencia a las manchas oscuras de un huevo de codorniz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: rechazos de huevo representativo anfitrión de huevos de coloración variable de cáscara de huevo. Tradicionalmente, la probabilidad de rechazo (discontinuas) predicha para un host se basa en el absoluto percibido diferencia entre huevo y huevo extranjero los anfitriones (es decir, el huevo extranjero es más diferente respuestas para que el huevo están más probable que, no importa la Dirección de la diferencia en el espacio de color). Esta práctica ignora la variación natural en el color del huevo del anfitrión. Sin embargo, es más probable que robins americanos (N = 52) rechazará los huevos marrones que igualmente disímiles huevos azul verdoso (línea sólida), que destaca la importancia de examinar las respuestas de host a través de un gradiente fenotípico9. Esta figura fue modificada de Hanley et al. 9 y estos datos65 están licenciados bajo CC por 4.0. Huevos de inserción son representativos de la gama de colores, pero sus posiciones son aproximadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  

Figure 3
Figura 3: rechazo de huevo representativo anfitrión de huevos de coloración variable de lugar. El contraste cromático (JND) entre los colores pintados en los huevos del modelo experimental y el color de la tierra de estos modelos predice respuesta de host (0 = aceptación, 1 = expulsión) en el robin americano. Esta figura ha sido modificada de Dainson et al. 21. inserción huevos representan variación en coloración spot utilizado, pero sus posiciones son aproximadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque experimentos de rechazo de huevo son el método más común para el estudio de coevolución parásito cría-host66, faltan esfuerzos para estandarizar materiales, técnicas o protocolos. Esto es especialmente problemático para los metanálisis. Ningún metaanálisis, a nuestro conocimiento, de rechazo de huevo de host hasta ahora ha controlado por discrepancias metodológicas entre los estudios67,68, incluyendo lo que se considera no mimética o mimética. Esto representa un problema importante porque los huevos MIMETICAS (por estándares humanos) pueden ser rechazados por los anfitriones más a menudo que aparentemente no mimética los69, que demuestra que la clasificación de color humano es insuficiente e inadecuado para inferencias con respecto a de cognición aviaria18. Además, el metanálisis ignoran el hecho de que algunos estudios, incluso de la misma especie hospedadora, manejan deserciones, contando como respuestas22 o excluirlos de análisis7,67, 68. Además, misclassifying modelos de huevos como huevos no mimética o miméticos, puede conducir a comparaciones falaces entre estudios que ambos utilizan estas clasificaciones para modelo de huevo diferentes tipos de70. Diferencias entre estudios1,70 pueden reflejar tanto las diferencias en el diseño del estudio (p. ej., modelo huevo tipos) o las diferencias entre poblaciones, tanto a un grado desconocido; Esto evita una interpretación clara de las diferencias y excluye rechazando la hipótesis nulas y alternativas. Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para el huevo de experimentos de rechazo y destaca particularmente el colorante y cuantificar el color de los modelos de huevo. Siguientes o adaptación (y apropiadamente información) este protocolo debe promover la estandarización metodológica necesaria para debate científico productivo, comparaciones entre estudios y futuros avances en este campo de investigación.

Puesto que la coloración de la cáscara de huevo es determinado por sólo dos pigmentos protoporfirina IX que aparece marrón y biliverdina IXα apareciendo azul verde62,71,72, cáscara de huevo colores sólo ocupan una pequeña sección de visión aviar 62. esta variación puede ser replicada a través de la formulación con cuidado las pinturas de acrílico que coincida con los colores naturales de cáscara de huevo, y esto llevará a una mejor comprensión de los mecanismos de reconocimiento de host. Por ejemplo, Turdus hosts son más propensos a rechazar huevos marrones que huevos de color azul-verde, a pesar de lo absoluto percibido diferencia de color entre estos extraños huevos y su dueño (figura 2). Las respuestas a huevos de color a lo largo de gradientes de color varían considerablemente, destacando la importancia de producir con precisión y reproducción de los colores utilizados en los experimentos de rechazo de huevos. Incluso variación en coloración spot puede resultar en diferencias llamativas en el host de respuesta (figura 3)21. Usando este enfoque, los investigadores pueden más sistemáticamente los límites del reconocimiento del hospedero y descubrir la importancia relativa de cromática y caminos de luminancia en informar a anfitrión decisiones.

A pesar de los beneficios que ofrece este enfoque para la cuantificación de las respuestas del host a través de una variedad fenotípica, no es adecuado para probar cada hipótesis. Cuando las tasas de rechazo son necesarias para probar hipótesis, especialmente para las comparaciones entre población, usando uno o más tipos de modelo de huevo consistente sería un enfoque menos costoso y exigente. Por ejemplo, presentando el huevo específico modelo tipo representativo de polimorfismos de huevo parásitos específicos, permiten comprender mejor las presiones de selección histórica y contemporánea73. Cálculo de las tasas de rechazo es imposible cuando cada huevo es de un color único; sin embargo, cuantificar las respuestas de host a través de una gama de colores de huevos parásitos potenciales puede proporcionar la penetración en cuestiones relacionadas con los umbrales de decisión y capacidad de discriminación. En concreto, este enfoque proporciona una herramienta para los investigadores medir habilidades de discriminación de huevo del host. Este protocolo describe recetas de pintura para ayudar a estandarizar el color de huevo modelos usados para cada enfoque. Por otra parte, independientemente del enfoque elegido, los investigadores deben informar las pinturas se utilizan para colorear sus modelos de huevo y deben cuantificar los colores cuidadosamente. Esto debe mejorar las comparaciones entre estudios y meta-análisis.

Estudios de rechazo de huevo con color continuo, patrón, tamaño y características de la forma han revolucionado el campo de estudios de la carrera de armamentos de aviar huésped-parásito en combinación con el uso ahora estándar de la percepción visual aviar modelización69, 74. ahora existe evidencia que algunos hosts no sólo uso la absoluta diferencia perceptual entre propios y extraños huevos en reconocimiento del huevo, pero en lugar de ello basan las decisiones de rechazo en el sentido de estas diferencias a lo largo del gradiente fenotípico de aviar color cáscara de huevo9. La investigación futura debe usar habituación/dishabituation u operante estudios para evaluar si los ejércitos de parásitos de cría aviares pueden percibir y discriminar entre colores naturales y artificiales huevo en contextos de reconocimiento sin huevo. Además, estos mismos experimentos podrían revelar si corriente, histórico y no-hosts pueden distinguir natural de cáscara de huevo artificial, que destaca el papel de mecanismos sensoriales en coevolución-carreras de armamentos. Finalmente, incorporar y reproducir los componentes UV de aves de huevo coloración y adecuadamente maculation en los estudios de rechazo de huevos es un desafío necesario para superar por la investigación futura75; Esto será necesario evaluar si las señales de color de huevo basado en UV representan un cue perceptualmente saliente o único huevo reconocimiento y rechazo en hospederos de parásitos de cría aviares. Mediante este protocolo consistente, los investigadores pueden crear nuevos experimentos y más fácil interpretaran y comparar sus resultados6,29,30,31.

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Disclosures

Ocean Optics ha financiado los gastos de la página de este manuscrito.

Acknowledgments

MEH financió el HJ Van Cleave Cátedra en la Universidad de Illinois, Urbana-Champaign. Además, para la financiación de agradecemos el humano programa de ciencia de frontera (al M.E.H. y T.G.) y el Fondo Social Europeo y el presupuesto del estado de la República Checa, no del proyecto. CZ.1.07/2.3.00/30.0041 (a T.G.). Agradecemos a Ocean Optics para cubrir los costos de publicación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replicator Mini + Makerbot
Professional Acrylic Paint Cobalt Turquoise Light Winsor & Newton 28382
Professional Acrylic Paint Titanium White Winsor & Newton 28489
Professional Acrylic Paint Cobalt Green Winsor & Newton 28381
Professional Acrylic Paint Cobalt Turquoise Winsor & Newton 28449
Professional Acrylic Paint Burnt Umber Winsor & Newton 28433
Professional Acrylic Paint Red Iron Oxide Winsor & Newton 28486
Professional Acrylic Paint Cadmium Orange Winsor & Newton 28437
Professional Acrylic Paint Raw Umber Light Winsor & Newton 28391
Professional Acrylic Paint Yellow Ochre Winsor & Newton 28491
Professional Acrylic Paint Mars Black Winsor & Newton 28460
Paint Brush Utrecht 206-FB Filbert brush
Paint Brush Utrecht 206-F Flat brush
Hair Dryer Oster 202
Fiber optic cables Ocean Optics Inc. OCF-103813 1 m custom bifurcating fiber optic assembly with blue zip tube (PVDF), 3.8mm nominal OD jeacketing and 2 legs
Spectrometer Ocean Optics Inc. Jaz Spectrometer unit with a 50 um slit width, installed with a 200-850 nm detector (DET2B-200-850), and grating option # 2.
Battery and SD card module for spectrometer Ocean Optics Inc. Jaz-B
Light source Ocean Optics Inc. Jaz-PX A pulsed xenon light source
White standard Ocean Optics Inc. WS-1-SL made from Spectralon
OHAUS Adventurer Pro Scale OHAUS AV114C A precision microbalance
Gemini-20 portable scale AWS Gemini-20 A standard scale
Empty Aluminum Paint Tubes (22 ml) Creative Mark NA
Telescopic mirror SE 8014TM
GPS Garmin Oregon 600
220-grit sandpaper 3M 21220-SBP-15 very fine sandpaper
400-grit sandpaper 3M 20400-SBP-5 very fine sandpaper
color analysis software: ‘pavo’, an R package for use in, R: A language and environment for statistical computing v 1.3.1 https://cran.r-project.org/web/packages/pavo/index.html
UV clear transparent Flock off! UV-001 A transparent ultraviolet paint
Plastic sandwich bags Ziploc Regular plastic sandwich bags from Ziploc that can be purchased at the supermarket.
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34120 11 x 21 cm kimwipes
Toothbrush Colgate Toothbrush

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Comportamiento número 138 percepción aviar parasitismo de cría color visión cognición color cáscara de huevo experimento rechazo
Sondeando los límites del reconocimiento de huevo usando experimentos de rechazo de huevos a lo largo de gradientes fenotípicos
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Canniff, L., Dainson, M.,… More

Canniff, L., Dainson, M., López, A. V., Hauber, M. E., Grim, T., Samaš, P., Hanley, D. Probing the Limits of Egg Recognition Using Egg Rejection Experiments Along Phenotypic Gradients. J. Vis. Exp. (138), e57512, doi:10.3791/57512 (2018).

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