Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

To metoder for Decellularization av anlegget vev for Tissue Engineering programmer

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Her presenterer vi og kontrast to protokoller brukes til å decellularize plante vev: en vaskemiddel tilnærming og et vaskemiddel-fri tilnærming. Begge metodene etterlater den ekstracellulære matrisen av anlegget vev brukes, som deretter kan benyttes som stillaser for tissue engineering programmer.

Abstract

Autologous, syntetiske og animalske graftene brukt som stillaser til vev erstatning har begrensninger på grunn av lav tilgjengelighet, dårlig biocompatibility og kostnader. Anlegget vev har gode egenskaper som gjør dem unikt egnet for bruk som stillaser, som høy areal, utmerket vanntransport og oppbevaring, sammenknyttede porøsitet, eksisterende vaskulære nettverk og en rekke mekaniske egenskaper. To vellykkede metoder for å plante decellularization for tissue engineering programmer er beskrevet her. Den første metoden er basert på vaskemiddel bad fjerne cellulære saken, som ligner på tidligere etablerte metoder brukt for å fjerne pattedyr vev. Andre er et vaskemiddel-fri metode tilpasset fra en protokoll som isolerer blad blodkar og involverer bruk av en oppvarmet blekemiddel og salt bad å fjerne blader og stengler. Begge metodene gir stillaser med sammenlignbare mekaniske egenskaper og lav mobilnettet metabolske innvirkning, slik at brukeren kan velge protokollen som passer bedre deres tiltenkte anvendelse.

Introduction

Tissue engineering dukket opp i 1980 å lage levende vev erstatninger, og potensielt adresse betydelig orgel og vev mangel1. En strategi har brukt stillaser å stimulere og guide kroppen til å regenerere mangler vev eller organer. Selv om avansert produksjon tilnærminger som 3D utskrift har produsert stillaser med unike fysiske egenskaper, fortsatt evnen til å produsere stillaser med en rekke ulike oppnåelig fysiske og biologiske egenskaper en utfordring2 , 3. videre på grunn av mangel på et funksjonelt vaskulære nettverk, disse teknikkene har blitt begrenset i å regenerere 3-dimensjonale vev. Bruk av decellularized dyr og menneskelige vev som stillaser har hjulpet i omgå dette problemet4,5,6,7. Men høy pris, parti til parti variasjon og begrenset tilgjengelighet kan begrense utbredt bruk av decellularized dyr stillaser8. Det er også bekymringer om potensielle smitteoverføring til pasienter og immunologiske reaksjon på noen decellularized pattedyr vev9.

Cellulose, avledet fra plante og bakteriell kilder, har vært mye brukt til å generere biologisk materiale for et bredt spekter av programmer i regenerativ medisin. Eksempler: Ben10,11, brusk12,13,14 og15for sårtilheling. Stillaser som består av cellulose har en ekstra fordel i at de slitesterke og motstandsdyktige mot blir brutt ned av pattedyrceller. Dette er på grunn av at pattedyrceller ikke produserer enzymer som er nødvendig å bryte ned cellulose molekyler. Sammenligning stillaser produsert med makromolekyler fra den ekstracellulære matrisen, som kollagen, brytes lett ned16 og kan ikke være godt egnet til langsiktige programmer. Kollagen stillaser kan stabiliseres av kjemiske cross-linking. Men er det en avveining på grunn av iboende toksisitet av cross-linkers som påvirker biokompatibilitet av stillaser17. Omvendt, cellulose har potensial til å være tilstede på stedet av implantasjon lengre tid fordi det er immun mot enzymatisk degradering av pattedyrceller18,19,20. Dette kan endres ved å justere frekvensen av nedbrytning gjennom hydrolyse forbehandling og co levering av stillasene med cellulases21. Biokompatibilitet av decellularized plante-avledet cellulose stillaser i vivo har også blitt vist i en studie gjort på mus22.

Hundrevis av millioner av år med evolusjon, har planter forbedret deres struktur og sammensetning å øke effektiviteten av væske transport og oppbevaring. Fabrikken karsystemet fartøy minimere hydraulisk motstand ved forgreninger inn i mindre fartøyer, lik for pattedyr blodkar ifølge Murrays lov23. Etter decellularization opprettholdes anlegget komplekst nettverk av fartøy og sammenhengende porene. Tatt i betraktning det store antallet forskjellige plantearter lett tilgjengelig har plante-avledet stillaser potensial til å overvinne design begrensninger for tiden påvirker stillaser i vev engineering24,25. For eksempel vist Modulevsky et al. at angiogenese og celle migrasjon oppstod når decellularized apple vev ble implantert subcutaneously på baksiden av en mus22. Tilsvarende viste Gershlak et al. at endotelceller kan dyrkes i blodkar decellularized bladene24. I et eget eksperiment kunne Gershlak et al. også viser at cardiomyocytes kunne dyrkes på overflaten av blader og kunne kontrakt24.

Planter også inkludere komplekse organisasjonen mobilnettet til makroskopisk skala, som er vanskelig å oppnå selv med de mest avanserte produksjonsteknikker utviklet ennå. Komplekse hierarkisk utformingen av anlegget vev gjør dem sterkere enn summen av sine bestanddeler26. Planter har en mengde ulike mekaniske egenskaper fra stive og tøff komponenter som stammer, mye mer fleksibel og smidig de som forlater27. Bladene varierer avhengig av Art i størrelse, form, bryte styrke, graden av endometrial blodkar, og kan bære ulike grader av hydrophilicity. Samlet foreslår disse plante egenskapene at decellularized planter kan tjene som unik og svært funksjonell medisinske enheter, inkludert som vev engineering stillaser.

Denne protokollen fokuserer på to metoder for å decellularize plante vev, som forlater og stammer, som stillaser i vev engineering. Den første metoden er en vaskemiddel-basert teknikk som bruker en rekke bad fjerne DNA og mobilnettet matter som har blitt tilpasset fra en brukte teknikk å decellularize pattedyr og plante vev6,22,25 ,28,29,30. Den andre metoden er vaskemiddel uten og er tilpasset fra en "skeletonization"-protokoll som vanligvis brukes til å fjerne bløtvev blader31. Tidligere arbeidet viste at simmering blader i en blekemiddel og natriumbikarbonat løsning tilrettelagt separasjon av er blodkar fra de omkringliggende bløtvev31. Denne teknikken kan bli sitert tilbake til eksperimenter utført i det 17th og 18th århundrer, som Albertus Seba32 og Edward Parrish33. Disse eksperimentene sentrert rundt slik plantemateriale, som blader og frukt, senkes ned i vann over lengre tid (uker til måneder) og tillater mykere vev forfalt bort naturlig. Her er "skeletonization" tilnærmingen tilpasset for å bruke mildere forhold, for eksempel lengre inkubasjon ganger ved lavere temperaturer, fjerne cellulære rester og unngå betydelig forstyrre bløtvev strukturen. Eksperimenter beskrevet heri, tre anleggstypene ble brukt: Ficus hispida, Pachira aquatica og en art av Garcinia. Resultatene av DNA kvantifisering, mekanisk tester og innvirkning på mobilnettet metabolsk aktivitet fra begge metodene beskrives.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularization av anlegget vev ved hjelp av vaskemiddel-basert tilnærming

  1. Bruke friske eller frosne F. hispida, blad prøver. Fryse ubrukte frisk prøver 20 ° C fryser og lagre for fremtidig bruk (inntil et år).
    Merk: Bruk stammen eller blad vev av nesten alle ønsket anlegget. Utvidet lagringstider kan skade vev.
    1. Bestemme størrelsen og form å bli behandlet på grunnlag av prøvens tilsiktet bruk (i.e. prøver skåret i strimler er godt egnet for mekanisk testing programmer, imens 8 mm plate prøvene er nyttig i flere godt dyrking programmer ). Skjær bladet i 8 mm-plater med en skarp, ren biopsi slag mens neddykket under romtemperatur (20-25 ° C) vaskebuffer H2O.
      Merk: Denne protokollen kan brukes på hele blader og stengler. Imidlertid vil mindre prøver decellularize raskere.
    2. Inkuber prøvene for 5-10 minutter til romtemperatur (20-25 ° C) vaskebuffer H2O på en riste sett en lav hastighet innstilling vask og/eller thaw seg. Bruk nok deionisert H2O for å sikre alle prøvene er grundig fuktet.
  2. Forberede en løsning av 10% (w/v) natrium dodecyl sulfate (SDS) i deionisert H2O. sted eksemplene i en egnet beholder (et glass eller plast parabolen er ideelle) og legge til SDS løsning som dekker prøvene. Inkuber prøver i 5 dager ved romtemperatur (20-25 ° C) på en riste sett for en lav hastighet for å hindre skade på prøvene.
    Merk: Ikke overfylle beholderen som kan bremse decellularization prosessen og føre til ujevn behandling av SDS. Dette trinnet bør prøver erverve en brun nyanse.
    1. Etter 5 dager, erstatte SDS løsningen med deionisert H2O. Incubate prøver for en ytterligere 10-15 minutter på riste plate å rense ut alle gjenværende SDS løsning.
  3. Forberede en 1% (v/v) ikke-ioniske surfactant i 10% (v/v) bleike løsning. Å lage en 500 mL løsning, bland 5 mL av den ikke-ioniske surfactant med 50 mL av blekemiddel deretter legge 445 mL deionisert H2O. Submerge eksempler av nylagde løsningen.
    Merk: Den ikke-ioniske surfactant/bleike løsningen har ikke lang holdbarhet, derfor, bør brukes innen 48 timer med forberedelse.
  4. Erstatte den ikke-ioniske surfactant/bleike løsningen hver 24 h til prøvene fjernes helt (se figur 1A for visuell sammenligning). Deretter ruge eksemplet i deionisert vann på en riste plate i 2 minutter for å skylle av overflødig ikke-ioniske surfactant/blekemiddel løsningen. Angi riste platen til en lav innstilling å hindre skade prøvene.
    Merk: Tiden det tar å tømme eksemplene brukes varierer, avhengig av typen og arter av anlegget. Den komplette misfarging av prøvene er et tegn på full decellularization (utføre DNA kvantifisering slik grundig clearing).
    1. Lyophilize prøver å lagre dem opp til ett år (flash fryse med flytende nitrogen foretrekkes, frysing prøver-80 ° C er akseptabelt) og lagre dem ved romtemperatur (20-25 ° C) i lav fuktighet.
    2. Rekonstituer prøver Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) bruker nok til pels eksempler. Skyll prøver 2 - 3 ganger i serum-frie medier forsiktig med brønnene før bruk (i.e. bruk 150-300 µL per skyll i en standard 24 godt plate).
      Merk: Tris-HCl buffer og serum-frie medier (dvs. DMEM, men noen grunnleggende cellekultur medier kan erstattes) er mer effektive i å redusere konsekvensene for cellen levedyktigheten til SDS behandlet eksempler enn de behandlet med deionisert H2O alene.

2. forberedelse av prøver ved hjelp av vaskemiddel uten Decellularization tilnærming

Merk: De første trinnene i denne fremgangsmåten sammenfallende med trinnene 1.1-1.1.2 (se ovenfor).

  1. Forbered en 5% (v/v) blekemiddel (NaClO) og 3% (w/v) natriumbikarbonat (NaHCO3) løsning. Varm løsningen i avtrekksvifte til 60-70 ° C for F. hispida blad prøver skåret i 8 mm plater stirring på en kokeplate.
    Merk: Natriumbikarbonat kan erstattes med natriumkarbonat (Na2CO3) eller natriumhydroksid (NaOH). Ønsket temperatur varierer sterkt (fra rom temperatur til 90 ° C) og bør justeres i henhold til egenskapene til prøvene brukes.
  2. Når løsningen har nådd ønsket temperatur omfang, dukke prøvene og redusere omrøring hastigheten for å unngå skade dem. Etter at prøvene fjernes synlig (se figur 1B for visuell sammenligning), fjerne fra badekaret nøye. Inkuber prøver i deionisert H2O for 1-2 min fjerne overflødig bleike løsning.
    Merk: Tiden det tar å tømme eksemplene kan variere mye. For eksempel kan kuttet persille fjernes i 10-15 minutter, mens tykkere og/eller større som helhet blader eller stammer kan ta timer i høy temperatur bad å tømme helt.
  3. Lyophilize prøvene og lagre dem ved romtemperatur (20-25 ° C) i lav fuktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Begge metodene gitt stillaser som var egnet for cellekultur og tissue engineering programmer. Figur 1 viser den generelle arbeidsflyten av decellularization prosessen med en intakt blad for vaskemiddel-basert metode og kutt prøver (8 mm diameter) for metoden vaskemiddel uten. Vellykket decellularization av Ficus hispida vev etter begge metodene gitt klare og intakt prøver (figur 1A og 1B). Det var mulig å decellularize hele anlegget vev (figur 1A); imidlertid syntes mindre prøver å fjerne raskere og mer effektivt. Et potensielt problem observert med vaskemiddel-basert tilnærming involvert heterogene decellularization som følge av tidlig fjerning fra ikke-ioniske surfactant bad (figur 1 c). En ulempe av vaskemiddel uten metoden er at skader kan oppstå på grunn av langvarig inkubasjon i oppvarmet bad (figur 1 d).

Mekaniske egenskaper for decellularized stillaser tilberedt med begge metodene ble undersøkt med uniaxial strekk testing som ble gjort i andre studier24,34. Denne testingen gitt den maksimale tangent modulus (MTM) (figur 2A), belastning på feil (SAF) (figur 2B) og endelig strekkfasthet (UTS) (figur 2C) for F. hispida og Pachira aquatica prøver. P. aquatica prøver tilberedt med begge decellularization protokollene vises lignende mekaniske egenskaper over alle tre av de målte parameterne. F. hispida prøvene viste en lignende trend i alle tilfeller bortsett fra UTS testing. Spesielt hadde prøver tilberedt med vaskemiddel-basert (SDS) protokollen høyere gjennomsnittlig UTS resultater enn de forberedt med vaskemiddel uten (bleke) tilnærming. Disse resultatene viser at prøver fra ulike plantearter kan gi forskjellige decellularized stillaset egenskaper når forberedes via de to decellularization-protokollene.

For å måle DNA fjerning, prøver ble tømt bruke enten metoden og genomisk DNA ble isolert med tidligere etablert protokoll35. Begge decellularization metoder (vaskemiddel-basert og vaskemiddel uten) betydelig redusert genomisk DNA innholdet å 2.47 ng DNA/mg (n = 3, s = 0,18) og 2,71 ng DNA/mg av vev (n = 3, s = 1,60) henholdsvis (figur 2D). Non-decellularized prøver hadde 104.67 ng DNA/mg av vev (n = 3, s = 26.21) (figur 2D). Betydelige nedgangen i DNA innhold etter decellularization indikerte en effektiv fjerning av anlegget celle rolle.

Innvirkning på celle levedyktighet av to decellularization metoder ble vurdert ved å måle metabolske aktiviteten til menneskelig dermal fibroblaster (hDF) kultivert for 2 dager i nærvær av decellularized P. aquatica eller Garcinia stillaser. hDFs fikk høyere metabolsk aktivitet når kultivert i nærvær av stillaser decellularized via vaskemiddel uten metoden kontra de forberedes via metoden vaskemiddel-basert (figur 3A). Sikre grundig fjerning av reagensene brukt under decellularization, et ekstra sett av eksperimenter ble utført der forberedt stillasene vasket mye før cellekultur. To separate vask metoder ble testet på prøver tilberedt med vaskemiddel-basert tilnærming: en vask i Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8.5) etterfulgt av en vask i Serum frie medier vs 2 vasker i deionisert H2O. Begge tilnærminger brukt siste vask trinn 1 x PBS. Virkningen på pattedyrceller deretter utsatt for decellularized plante stillasene ble målt ved hjelp av samme metabolsk aktivitet analysen som ovenfor. Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8.5) etterfulgt av Serum gratis Media hjalp redusere innvirkningen på mobilnettet metabolsk aktivitet sammenlignet med deionisert H2O, gjør prøver behandlet med vaskemiddel-basert tilnærming sammenlignes med prøver fra vaskemiddel-fri metode (figur 3B).

Det ble tidligere vist at pattedyrceller kunne vokse på stillaser tilberedt med vaskemiddel tilnærming25; Det var derfor nødvendig å demonstrere dette på prøver forberedt av tidligere testet vaskemiddel uten metoden. Stamceller (MSCs) var frø decellularized F. hispida blad prøver (8 mm plater) på 20.000 celler per stillaset og lov til å ruge 24 h. Disse stillaser var functionalized før cellen innføring med en RGD-dopamin konjugert å lette å følge. Figur 4 illustrerer bilder Hentet fra et typisk eksempel. En lysende felt bildet ble samlet inn for å vise den overordnede strukturen av en del av prøven brukt (figur 4A). MSCs var farget med calcein og fotografert med fluorescens mikroskop (figur 4B). Bildene ble deretter kledde (figur 4C) for å vise plasseringen av voksende cellene på overflaten av bladet.

Figure 1
Figur 1 . Den generelle arbeidsflyten for decellularization av anlegget vev. Typisk arbeidsflyt for decellularization av anlegget vev (vask og forberedende skritt er universell); (A) topp banen er for vaskemiddel-basert metode (B) nederst for metoden vaskemiddel uten. (C) en ufullstendig/mislyktes decellularization av et P. aquatica blad med metoden vaskemiddel-baserte på grunn av tidlig fjerning fra ikke-ioniske surfactant/blekemiddel bad (D) en skadet decellularization av et F. hispida blad på grunn av langvarig inkubasjon i den oppvarmede bleike løsningen i metoden vaskemiddel uten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Sammenligning av mekaniske egenskaper og effektiviteten av decellularization mellom metoder. Mener ± SD; statistisk analyse ble gjort med to utvalg t-test og p verdiene der statistisk signifikant (mindre enn eller lik til 0,05). Sammenligning av mekanisk testing resultater mellom prøver av F. hispida og P. aquatica (blå stolper brukes for vaskemiddel tilnærming, rød for vaskemiddel-fri og grønn for ubehandlet prøver) (F. hispida vaskemiddel-baserte n = 4, vaskemiddel uten n = 2; P. aquatica vaskemiddel-base n = 3, vaskemiddel uten n = 4) (A) maksimal tangens Modulus (MTM) (B) belastning på feil (SAF) (C) og Ultimate strekkfasthet (UTS). (D) en dsDNA kvantifisering analysen ble kjørt i tre eksemplarer på tre prøvene fra hver gruppe: ubehandlet (frisk, n = 3), vaskemiddel uten metoden (blekemiddel, n = 3) og vaskemiddel-basert metode (SDS, n = 3), p verdiene er for decellularization metode gruppen sammenlignet med ubehandlet utvalget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Metabolsk aktivitet analyseresultatene sammenligne innvirkning mellom de to decellularization metodene. Mener ± SD; statistisk analyse ble gjort ved hjelp av t-test for to utvalg og p verdiene der statistisk signifikant (mindre enn eller lik til 0,05). Mobilnettet metabolsk aktivitet ble målt i nærvær av vevsprøver P. aquatica og en art av Garcinia (normalisert kontroll brønner med ingen prøve lagt) vise en (A) sammenligning av metabolske virkningen av to decellularization metoder (n = 3 for hver gruppe) og (B) sammenligning av virkningen på metabolsk aktivitet bruker to vaske metoder i vaskemiddel-basert protokoll: Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8.5) kombinert med Serum frie medier (n = 4) vs vaskebuffer H 2 O (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Mesenchymal stamceller (MSCs) vokser på overflaten av decellularized Ficus hispida blad, functionalized med en RGD-dopamin konjugert. MSCs ble dyrket på F. hispida blader, decellularized av vaskemiddel uten metoden og functionalized med en RGD-dopamin konjugert (500 µm skala barer ble lagt for referanse) (A) lyse feltet bildet av en del av decellularized blad (B ) Fluorescens bildet av calcein farget MSCs vokser på blad overflate (C) fusjonerte lys feltet og fluorescens image. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrives to metoder for å decellularize plante vev. Resultatene presenteres her, kombinert med resultatene av tidligere studier25, tyder på at protokollene fremsatt er trolig gjelder for et bredt spekter av plantearter og kan utføres på både stengler og blader. Disse prosedyrene er enkle og krever ikke spesialisert utstyr, slik plante decellularization kan utføres i de fleste laboratorier. Det er bemerkelsesverdig at etter decellularization, stillasene må være functionalized for å lette pattedyr celleadhesjon. Forskjellige functionalization teknikker for å aktivere pattedyr celleadhesjon og vekst på anlegget vev er beskrevet andre steder25 og er ikke temaet av gjeldende manuskriptet.

Det siste trinnet i begge decellularization protokollene presenteres her (figur 1) var kritisk til deres suksess. Når utføre enten metoden ikke overfylle bad som dette vil resultere i en ujevn clearing. Disse metodene kan brukes på hele blader og stengler; Dette vil imidlertid øke tiden som kreves for å fjerne dem. Kontroller at prøvene er helt neddykket for å holde clearing konsekvent gjennom hele utvalget. Ideelt sett bør decellularization fjerne anlegget vev mest mobilnettet saken samtidig minimere strukturell skade. Det er sannsynlig at metoden vaskemiddel uten kan endres etter behov for å arbeide med ønsket prøver. Bad temperaturer kan føre til raskere clearing ganger, men kan også resultere i mer skade å prøvene hvis de over inkubert. Lavere temperaturer kan kreve lengre inkubasjon ganger og ville være passende for mer skjøre prøver. Konsentrasjonen av blekemiddel i løsningen kan også endres for å akselerere eller avta decellularization prosessen. Når du tester nye prøver for bruk med vaskemiddel uten metoden, anbefales å starte med en badevann på 50-60 ° C med hyppige kontrollerer fremdriften av decellularization (ideelt hver 15-20 minutter) før de er tilstrekkelig klarert. Denne temperaturområde ble godt tolerert av de fleste av plantearter som ble testet under optimalisering av teknikken. Ved ferdigstillelse, prøvene kan kontrolleres visuelt og manuelt for å sikre at de ikke er over ruges og skadet ugjenkallelig som ville angis med rive eller oppløsningen på fjerning fra bad. Prøver tilberedt med denne tilnærmingen Vis en minsket innvirkning på cellevekst (se figur 3A) enn den vaskemiddel tilnærmingen med bare vaske deionisert H2O. Det anbefales imidlertid å vask i tillegg med Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) og serum-free media, spesielt i sensitive applikasjoner.

Vaskemiddel-basert (SDS) metoden er trolig gjelder for de fleste plantearter og er spesielt nyttig for å fjerne hele blad og delikat prøver fordi den krever minimal fysiske agitasjon. Som nevnt ovenfor, er det siste trinnet avgjørende for decellularization av prøver. Prøver med forskjellige fysiske egenskaper kan fjernes ved å justere inkubasjon tiden i ikke-ioniske surfactant bad. En betydelig ulempe av denne prosessen er at decellularized vev kan inneholde spor av vaskemidler brukes, som senere kan påvirke mobilnettet metabolske aktiviteten til pattedyrceller. Derfor anbefales grundig vask trinn før bruk. Her ble det funnet at prøver vasket med Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8.5) etterfulgt av serum-frie medier hadde høyere celle levedyktighet enn de vasket med vaskebuffer H2O før bruk (figur 3B).

Ved lagring ubehandlet prøver for fremtidig bruk i disse metodene, er det viktig å overvåke dem for skade slik at resulterende stillasene ikke vil bli påvirket. Skaden kan vises som misfarging av anlegget vev samt sprengning eller overdreven skjørhet når håndteres. Det anbefales å overvåke prøvene ukentlig for å utnytte dem før de er ikke lenger nyttig og må avhendes. Utbruddet av skader varierer mellom prøven, tykkere mer robust utvalg varer lenger.

Generelt holder planter mye løfte som en potensiell kilde til biologisk materiale. Dette er styrket av deres naturlig utviklet intrikate strukturer og egenskaper som hjelper dem vokse i sine opprinnelige omgivelser. Vellykket utnyttelse av anlegget vev som vev engineering stillaser foreslår et potensielt billig alternativ til kostbar og ofte vanskelig å utforme, biologisk materiale. Anlegget vevets form, som iboende varierer mellom til en annen, kan også bli brukt til direkte romlig orientert mobilnettet vekst25. For eksempel har en tidligere studie vist at menneskelige celler svare på topografiske signaler på decellularized planter25, dermed disse stillaser kan brukes å kultur celler i svært organiserte mønstre25. En annen funksjon som er ønskelig i vev engineering er de novo perfusability. Anlegget vev har utviklet seg over hundrevis av millioner av år å være svært effektiv i væske transport, og deres vaskulære nettverk kan være effektivt perfused24. Denne egenskapen kan potensielt brukes å veilede mobilnettet migrasjon og angiogenese med det endelige mål å skape erstatning vev for klinisk bruk. Dette er styrket av resultatene av tidligere studier som har vist at biologisk materiale med høy areal og sammenhengende porøsitet er fremmer celle spredning og implantert i vivo, Aktiver innover migrasjon av verten cellene i det implantatet36,37,38,39. Høy arealet og de sammenkoblede porøsitet er også kjennetegnet av anlegget vev40,41,42, plante-avledet stillaser har potensial til å integrere med omkringliggende vev i vivo. Videre studier fant at decellularized blader kan være vellykket parfyme med celler24 og at når menneskelige celler var frø på decellularized plante vev, de likedannet deres topografiske stikkordene25. Når tatt alle sammen, plante-avledet stillaser besitter den nødvendige egenskaper til å kunne brukes mot vev utvikling programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke John Wirth Olbrich hagen for allernådigst å forsyne prøver brukes i dette prosjektet. Dette arbeidet støttes delvis av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (R01HL115282 til G.R.G.) National Science Foundation (DGE1144804 J.R.G og G.R.G.), og University of Wisconsin Department av kirurgi og Alumni Fund (H.D.L.). Dette arbeidet var også støttes delvis av Environmental Protection Agency (STAR grant nr. 83573701), National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 og UH3TR000506) og National Science Foundation (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Bioteknologi problemet 135 Decellularized stillaser plante vev blader stengler perfusable stillaser decellularization
To metoder for Decellularization av anlegget vev for Tissue Engineering programmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter