Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Burada mevcut ve bitki dokularında decellularize için kullanılan kontrast iki protokolleri: deterjan temelli bir yaklaşım ve deterjan-Alerjik bir yaklaşım. Her iki yöntem sonra doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanılabilir hücre dışı matriks kullanılan, bitki dokuların geride.

Abstract

Şu anda iskele doku yerine kullanılan otolog, sentetik ve hayvan kaynaklı greft nedeniyle düşük kullanılabilirlik, zavallı biyouyumluluk ve maliyet kısıtlamaları bulunmaktadır. Bitki doku yapmak onları benzersiz olarak uygun yüksek yüzey alanı, mükemmel su taşıma ve saklama, gibi iskele olarak birbirine bağlı gözeneklilik, damar ağları ve çok çeşitli mekanik önceden kullanmak uygun özelliklere sahip özellikleri. Doku mühendisliği uygulamaları için bitki decellularization iki başarılı yöntemleri burada açıklanmıştır. Birinci yöntem daha önce kurulan yöntemleri memeli dokuları temizlemek için kullanılan benzer hücresel madde kaldırmak için deterjan banyoları temel alır. İkinci yaprak damarlara yalıtır ve ısıtmalı çamaşır suyu ve sapları ve yaprakları temizlemek için tuz banyosu kullanımı içerir bir protokol adapte deterjan-Alerjik bir yöntemdir. Her iki yöntem iskele karşılaştırılabilir mekanik özellikleri ve böylece daha iyi onların amaçlanan uygulama uygun protokol seçmesini sağlayan düşük hücresel metabolik etkisi ile verim.

Introduction

Doku mühendisliği canlı bir doku oluşturmak için 1980'lerde ortaya çıkan yerine ve potansiyel olarak adres önemli organ ve doku sıkıntısı1. Bir strateji iskele teşvik ve vücut eksik doku veya organ yeniden oluşturmak için rehber kullandı. 3-b baskı üretilen benzersiz fiziksel özellikleri ile iskele gibi yaklaşımlar üretim gelişmiş rağmen iskele ile ulaşılabilir fiziksel ve biyolojik özellikleri çeşitli bir yelpazede üretim yeteneği mücadelesi2 kalır , 3. Ayrıca, işlevsel bir damar ağı eksikliği nedeniyle, bu teknikleri 3 boyutlu doku Yenileyici sınırlı. İskele olarak decellularized hayvan ve insan doku kullanımı bu sorun4,5,6,7engellemeyi destekli. Ancak, yüksek maliyet, toplu iş toplu iş değişkenliği ve sınırlı kullanılabilirliğe yaygın kullanımını sınırlayabilir decellularized hayvan iskele8. Ayrıca potansiyel hastalık iletim hastalara ve bazı decellularized memeli doku9immünolojik tepki hakkında endişeler vardır.

Bitki ve bakteriyel kaynaklardan elde edilen selüloz, kapsamlı rejeneratif tıp Biyomalzeme geniş bir uygulama yelpazesi için oluşturmak için kullanılmıştır. Bazı örnekler şunlardır: kemik10,11, kıkırdak12,13,14 ve15şifa yara. Dayanıklı ve memeli hücreleri tarafından kırık aşağı için dayanıklı olduğu oluşmaktadır iskele selüloz bir yararı yok. Gerçeğini memeli hücreleri selüloz molekülleri kırmak gerekli enzimler üretmek değildir nedeniyle bu. İçinde karşılaştırma, iskele oluştururlar kollajen gibi hücre dışı matriks kullanarak üretilen16 kolayca kırık ve uzun vadeli uygulamalar için uygun olmayabilir. Kollajen iskele kimyasal cross-linking tarafından stabilize. İskele17biyouyumluluk etkiler cross-linkers doğasında toksisite nedeniyle bir ticaret-off be. Diğer taraftan, selüloz dışındahiç bir şeyden etkilenmez memeli hücreleri18,19,20enzimatik bozulma olduğundan süre takmaktan implantasyonu sitesinde mevcut kalır potansiyeline sahiptir. Bu bozulma ile hidroliz Önarıtma oranı ve iskele cellulases21ile ortak teslim ayarlama tarafından değiştirilebilir. Decellularized bitki elde edilen selüloz iskele vivo içinde biyouyumluluk da fareler22tarihinde yapılan bir çalışmada gösterilmiştir.

Milyonlarca yıllık evrim, kendi yapısı ve sıvı taşıma ve saklama verimliliğini artırmak için kompozisyon bitkiler iyileştirdiyseniz. Bitki vasküler gemiler hidrolik direnç küçük gemi, Murray'nın hukuk23göre memeli damarlara benzer içine dallanma tarafından en aza indirmek. Decellularization sonra fabrika gemileri ve birbirine bağlı gözenekleri karmaşık ağ korunur. Farklı bitki türü hazır çok sayıda göz önüne alındığında, bitki kaynaklı iskele iskele doku mühendisliği24,25Şu anda etkileyen tasarım sınırlamalarının üstesinden gelir potansiyeline sahip. Örneğin, Modulevsky vd. decellularized elma doku subkutan bir fare22arkasında implante zaman anjiogenez ve hücre göç oluştuğunu gösterdi. Benzer şekilde, Gershlak ve ark. endotel hücreleri decellularized yaprakları24damarlara içinde yetiştirilen olabilir gösterdi. Ayrı bir deneyde, Gershlak vd. Ayrıca cardiomyocytes yaprak yüzeyinde büyümüş olabilir ve24sözleşme başardık göstermek mümkün.

Bitkiler de hücresel karmaşık kuruluştan bile bugüne kadar geliştirilen en ileri üretim teknikleri ile elde etmek zordur makroskopik ölçekli içerir. Bitki doku karmaşık hiyerarşik tasarımı onları onların bileşenlerinin26toplamından daha güçlü yapar. Bitkiler bir bolluk kaynaklanıyor gibi katı ve sert bileşenleri arasında değişen farklı mekanik özelliklere sahip, çok daha esnek ve bükülebilir olanlar gibi27bırakır. Yaprakları tür boyutu açısından bağlı olarak değişiklik gösterebilir, şekli, gücü, vaskülarizasyon, derecesini kırmak ve hydrophilicity farklı derecelerde taşıyabilir. Genel olarak, bu bitki özellikleri decellularized bitkiler iskele mühendislik doku da dahil olmak üzere benzersiz ve çok fonksiyonel tıbbi cihaz olarak hizmet verebilir tavsiye ederim.

Bu iletişim kuralı bitki doku decellularize için iki yöntem üzerinde duruluyor, gibi bırakır ve doku mühendisliği iskele olarak kullanmak için kaynaklanıyor. İlk yöntem bir dizi banyoları DNA ve memeli decellularize ve doku6,22,25 bitki için yaygın olarak kullanılan bir teknik adapte hücresel madde kaldırmak için kullanan bir deterjan tabanlı tekniktir ,28,29,30. İkinci yöntem deterjan-alerjik ve genellikle yumuşak doku yaprakları31kaldırmak için kullanılan bir "iskeletleşmiş" kuralından uyarlanmıştır. Ön çalışma yaprakları çamaşır suyu ve sodyum bikarbonat bir çözümde kaynayan damarlara ayrılması çevreleyen yumuşak doku31kolaylaştırdı gösterdi. Bu teknik geri 17inci ve 18inci yüzyıl, Albertus Seba32 ve Edward Parrish33çalışmalarını gibi yapılan deneyler için verilebilir. Bitki oldu, yaprak ve meyve gibi bırakarak etrafında merkezli bu deneyler için uzun bir süre suda Batık (hafta ay) ve uzak doğal çürüme daha yumuşak dokularda izin. Burada "iskeletleşmiş" yaklaşım hücresel artıkları kaldırmak için ve yumuşak doku yapısı önemli ölçüde etkilemesini önlemek için daha düşük sıcaklıklarda uzun kuluçka süreleri gibi daha hafif koşulları kullanmak için uyarlanmıştır. Burada detaylı deneyler için üç bitki türleri kullanılmıştır: Ficus hispida, Pachira aquatica ve Garciniabir tür. DNA miktar, mekanik test ve her iki yöntem üzerinden hücresel metabolik aktivite üzerindeki etkisi sonuçları açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularization deterjan dayalı yaklaşım kullanarak bitki dokusunun

  1. Taze veya dondurulmuş F. hispida, yaprak örnekleri kullanın. -20 ° C-dondurucu ve store (en fazla bir yıl) ileride kullanmak üzere kullanılmayan taze örnekler dondur.
    Not: neredeyse istenen herhangi bir bitki kök veya yaprak dokusu kullanın. Genişletilmiş depolama kez dokulara zarar verebilir.
    1. Boyutunu ve şeklini temelinde örnek'ın kullanım işleme örnekleri belirler (yani şeritler halinde kesin örnekleri mekanik test uygulamaları için uygundur, bu arada 8 mm disk örnekleri çok iyi kodlamayla uygulamalarda yararlıdır ). Yaprak keskin, temiz biyopsi ile 8 mm yuvarlak yüzey içine oda sıcaklığında (20-25 ° C) deiyonize H2altında O. sular altında iken yumruk kesilmiş
      Not: Bu protokolü bütün yaprakları ve sapları üzerinde kullanılabilir. Ancak, daha küçük örnekleri daha hızlı decellularize.
    2. Örnekleri için 5-10 dk oda sıcaklığında (20-25 ° C) deiyonize H2O yıkayın ve/veya onları çözme için bir düşük hız ayarı için sallamak plaka sette, kuluçkaya. Yeterince deiyonize H2O tüm örneklerini iyice ıslak emin olmak için kullanın.
  2. % 10 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) deiyonize H2o yer bir çözüm örnekleri (cam veya plastik tabak idealdir) uygun bir kap içinde hazırlamak ve tamamen örnekleri kapsayacak şekilde SDS Çözüm ekleyin. Örnekleri örnekleri için zarar görmesini önlemek için düşük bir hız için sallamak plaka sette, oda sıcaklığında (20-25 ° C) 5 gün kuluçkaya.
    Not: Bu decellularization sürecini yavaşlatmak ve düzensiz tedaviye SDS tarafından neden gibi kapsayıcı kalabalık değil. Bu adım sırasında örnekleri kahverengi bir renk tonu elde etmek.
    1. 5 gün sonra SDS Çözüm örnekleri için ek bir 10-15 dk iyice durulayın kalan birisi SDS eriyik için sallamak plaka üzerinde deiyonize H2ile O. Incubate değiştirin.
  3. % 10 (v/v) çamaşır suyu çözüm %1 (v/v) iyonik olmayan yüzey aktif hazırlayın. 500 mL solüsyon yapmak, iyonik olmayan yüzey aktif 5 mL 50 mL çamaşır suyu ile karıştırın sonra 445 mL deiyonize H2O. Submerge eklemek için taze hazırlanmış çözümde örnekler.
    Not: İyonik olmayan yüzey aktif/çamaşır suyu çözüm uzun bir raf ömrü, bu nedenle yok, hazırlık 48 saat içinde kullanılmalıdır.
  4. Örnekleri tamamen temizlenene kadar iyonik olmayan yüzey aktif/çamaşır suyu çözüm her 24 h yerine ( Şekil 1A için görsel karşılaştırma için bakınız). Sonra örnek 2 min için sallamak tabakta deiyonize su aşırı iyonik olmayan yüzey aktif/çamaşır suyu çözüm durulama için kuluçkaya. Shake plaka örnekleri zarar önlemek için düşük bir ayara getirin.
    Not: kullanılan örneklerini temizlemek için gereken süreyi, bitki tür ve türünü bağlı olarak değişir. Tam örnekleri discoloring tam decellularization göstergesidir (kapsamlı Temizleme emin olmak için DNA miktar gerçekleştirin).
    1. Bunları bir yıl kadar saklamak için örnekleri lyophilize (sıvı nitrojen kullanarak buz gibi flaş tercih edilen,-80 ° C örnekleri dondurma da kabul edilebilir) ve oda sıcaklığında (20-25 ° C) düşük nem içinde saklayabilirsiniz.
    2. Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) örneklerinde sulandırmak yeterli ceket örnekleri kullanarak. Örnek 2 - 3 kez serum-ücretsiz medya yavaşça (yani durulama, bir standart 24 iyi plaka başına kullanım 150-300 µL) kullanmadan bir micropipette kullanarak durulayın.
      Not: Tris-HCl tampon ve serum-ücretsiz medya (yani DMEM, ama medya yerine herhangi bir temel hücre kültürü) hücre canlılığı deiyonize H2ile O yalnız tedavi daha tedavi SDS örneklerinin etkisini düşürerek daha etkilidir.

2. hazırlanması, deterjan-Alerjik Decellularization yaklaşım kullanarak örnekleri

Not: Bu yordamın ilk adımını adımları 1.1-1.1.2 (yukarı bakın) ile aynı tarihte.

  1. %5 (v/v) çamaşır suyu (NaClO) ve % 3 (w/v) sodyum bikarbonat (NaHCO3) çözüm hazırlamak. 60-70 ° C sıcak tabakta karıştırma sırasında 8 mm diskler halinde kesip F. hispida yaprak örnekleri için bir duman Hood'a çözümde sıcak.
    Not: Sodyum bikarbonat sodyum karbonat (Na2CO3) veya sodyum hidroksit (NaOH) ile yedek olabilir. İstenen sıcaklık büyük ölçüde (Oda sıcaklığı 90 ° c) değişir ve kullanılan örnekleri özellikleri göre ayarlanmalıdır.
  2. İstenen sıcaklık aralığı çözüm noktasına gelince, örnekleri daldırın ve onlara zarar görmesini önlemek için karıştırma hızını düşürür. Örnekleri gözle görülür geçtikten sonra ( Şekil 1B için görsel karşılaştırma için bakın), banyodan dikkatli bir şekilde çıkarın. Deiyonize H2O fazla çamaşır suyu çözümü kaldırmak 1-2 min için bir kez örneklerinde kuluçkaya.
    Not: örneklerini temizlemek için gereken süreyi çok değişebilir. Örneğin, kesme maydanoz daha kalın ve/veya daha büyük örnekleri ise 10-15 dakika içinde bütün yaprakları veya kaynaklanıyor yüksek sıcaklık banyoları tamamen temizleyin saatler alır gibi temizlenebilir.
  3. Örnekleri lyophilize ve oda sıcaklığında (20-25 ° C) düşük nem içinde depolayabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her iki yöntem hücre kültürü ve doku mühendisliği uygulamaları için uygun iskele vermiştir. Şekil 1 decellularization süreci için deterjan tabanlı ve kesim örnekleri (8 mm çap) deterjan ücretsiz yöntemi için sağlam bir yaprak kullanarak genel iş akışını gösterir. Her iki yöntem takip Ficus hispida dokuların başarılı decellularization açık ve sağlam örnekleri (Şekil 1A ve 1B) vermiştir. Bütün bitki doku (Şekil 1A); decellularize mümkün Ancak, daha hızlı ve daha etkili bir şekilde temizlemek için daha küçük örnekleri çıktı. Olası bir sorunu ile deterjan dayalı yaklaşım gözlenen iyonik olmayan yüzey aktif banyo (Şekil 1 c) erken kaldırılması sonucunda heterojen decellularization dahil. Deterjan-Alerjik yöntemin bir dezavantajı hasar ısıtmalı banyo (Şekil 1 d) uzun süreli kuluçka nedeniyle oluşabilir olduğunu.

Her iki yöntem de kullanılarak hazırlanan decellularized iskele mekanik özelliklerini kullanarak diğer çalışmalar24,34olduğu gibi uniaxial gerilme test araştırıldı. Bu test en fazla teğet modülü (MTM) (Şekil 2A), baskı hatası (SAF) (Şekil 2B) ve nihai çekme dayanımı (UTS) (Şekil 2C) F. hispida ve Pachira aquatica örnekleri için vermiştir. Her iki decellularization protokolü kullanılarak hazırlanan P. aquatica örnekleri ölçülen parametreler arasında üç benzer mekanik özellikleri görüntülenir. F. hispida örnekleri test UTS dışında her durumda benzer bir eğilim gösterdi. Özellikle, deterjan tabanlı (SDS) protokolü kullanılarak hazırlanan örnekleri bu deterjan-Alerjik (çamaşır suyu) yaklaşımla hazırlanan daha yüksek ortalama UTS sonuçlar vardı. Bu sonuçlar farklı bitki türü toplanan örnekleri zaman iki decellularization protokol yolu ile hazırlanan farklı decellularized iskele özellikleri üretmek gösterir.

DNA kaldırma ölçmek için örnekleri iki yöntemden herhangi birini kullanarak silinmesinden ve genomik DNA'ları bir daha önce oluşturulmuş protokol35kullanarak izole edildi. Her iki decellularization Yöntem (deterjan tabanlı ve deterjan içermeyen) önemli ölçüde örnekleri için 2,47 genomik DNA içeriği azalmış ng DNA/mg (n = 3, s 0.18 =) ve 2,71 ng DNA/mg doku (n = 3, s = 1.60) sırasıyla (Şekil 2B). Sigara decellularized örnekleri vardı 104.67 ng DNA/mg doku (n = 3, s 26.21 =) (Şekil 2B). Decellularization bitki hücre etkili bir kaldırılması belirtilen sonra DNA içeriği önemli azalma önemli.

İki decellularization Yöntem hücre canlılığı üzerindeki etkisini insan dermal fibroblastlar (hDF) decellularized P. aquatica veya Garcinia iskele huzurunda 2 gün kültürlü metabolik etkinliğini ölçerek değerlendirildi. hDFs daha yüksek metabolik aktivite varlığında bu deterjan tabanlı yöntemi ile (Şekil 3A) hazırlanan karşı deterjan ücretsiz yöntemi ile decellularized iskele kültürlü vardı. Decellularization, ek bir set deneyler sırasında kullanılan reaktifler ayrıntılı kaldırılması içinde hazırlanan iskele yoğun hücre kültürü önce yıkanmış gerçekleştirildi emin olmak için. İki ayrı yıkama yöntemleri deterjan dayalı yaklaşım kullanılarak hazırlanan örnekleri üzerinde test edildi: bir yıkama Tris-HCl tampon (10 mM, pH 8,5) Serum boş ortam vs bir makinaya deiyonize H2o 2 yıkama ardından Her iki yaklaşımın son yıkama adımları 1 x PBS ile kullanılır. Daha sonra decellularized bitki iskele eline memeli hücreleri etkisi aynı metabolik aktivite assay yukarıdaki kullanarak ölçüldü. Tris-HCl tampon (10 mM, pH 8,5) serum ücretsiz medya tarafından takip deiyonize H2O, deterjan dayalı yaklaşım deterjan ücretsiz örnekleri için karşılaştırılabilir ile tedavi örnekleri yapma ile karşılaştırıldığında hücresel metabolik aktivite üzerindeki etkisini azaltmak yardımcı oldu Yöntemi (Şekil 3B).

Bu daha önce memeli hücreleri deterjan dayalı yaklaşım25kullanılarak hazırlanan iskele üzerinde büyümek olabilir gösterildi; Bu nedenle, bunu daha önce denenmemiş deterjan ücretsiz yöntemi tarafından hazırlanan örnekleri üzerinde göstermek gerekli. Mezenkimal kök hücre (MSCs) numaralı seribaşı iskele başına 20.000 hücre, F. hispida yaprak örnekleri (8 mm diskler) decellularized ve 24 saat kuluçkaya için izin. Bu iskele önce hücre giriş kalarak kolaylaştırmak için bir RGD-dopamin eşlenik ile functionalized. Şekil 4 tipik bir örnek toplanan görüntüleri gösterir. Parlak alan görüntü kullanılan örnek (Şekil 4A) bir bölümünü genel yapısını göstermek için toplanmıştır. MSCs calcein kullanarak ve floresan mikroskop (Şekil 4B) görüntüsü lekeli. Görüntüleri daha sonra (yaprak yüzeyinde büyüyen hücreler konumunu görüntülemek için,Şekil 4 c) overlaid.

Figure 1
Resim 1 . Genel iş akışı için bitki dokuların decellularization. Decellularization bitki dokuların; (yıkama ve hazırlık adımları evrensel) için normal iş akışı (A)en iyi yoldur deterjan ücretsiz yöntemi için deterjan tabanlı yöntemi (B) alt için. (C) bir eksik/başarısız decellularization P. aquatica yaprak iyonik olmayan yüzey aktif/çamaşır suyu Hamamı zarar (D) A decellularization F. hispida yaprak erken kaldırılması nedeniyle deterjan tabanlı yöntemi kullanma deterjan ücretsiz yöntemi ısıtmalı çamaşır suyu çözümde uzun süreli kuluçka nedeniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Mekanik özellikleri ve yöntemleri arasında decellularization etkinliğinin karşılaştırılması. Demek ± SD; istatistiksel analiz yapıldı nerede istatistiksel olarak anlamlı listelenen iki örnek t-testi ve p değerleri (daha az veya ona eşit 0,05) kullanarak. Mekanik test karşılaştırma sonuçları arasında F. hispida örnekleri ve P. aquatica (deterjan dayalı yaklaşım, deterjan ücretsiz için kırmızı ve yeşil tedavi edilmezse örnekleri için kullanılan mavi bar) (F. hispida deterjan tabanlı n = 4, deterjan içermeyen n = 2; P. aquatica deterjan bazlı n = 3, deterjan içermeyen n = 4)(a)maksimum tanjant modülü (MTM) (B) baskı hatası (SAF) (C) ve nihai çekme dayanımı (UTS). (D) A dsDNA miktar tahlil çalıştırmak nüsha üç örnek üzerinde her gruptan: tedavi edilmemiş (taze, n = 3), deterjan ücretsiz yöntemi (çamaşır suyu, n = 3) ve deterjan tabanlı yöntemi (SDS, n = 3), p değerleri için decellularization yöntemi tedavi edilmemiş örnek grubuna göre grup. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Metabolik aktivite tahlil sonuçları etkisi iki decellularization yöntemleri arasında karşılaştırma. ± SD demek; istatistiksel analiz yapıldı iki örnek t-testi kullanarak ve istatistiksel olarak anlamlı nerede listelenen p değerleri (daha az veya ona eşit 0,05). Hücresel metabolik aktivite varlığında doku örnekleri P. aquatica ve Garcinia (denetim wells için örnek eklendi yok normalize) familyasından ölçülen iki metabolik etkisi(a)karşılaştırılması görüntülemek için decellularization Yöntemleri (n = 3 her grup için) ve (B) karşılaştırma için iki kullanarak metabolik etkinliğini etkisi yıkama yöntemleri deterjan tabanlı iletişim kuralında: Tris-HCl tampon (10 mM, pH 8,5) kombine ile Serum boş ortam (n = 4) vs deiyonize H 2 O (n = 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Mezenkimal kök hücre yüzeyinde büyüyen (MSCs) Ficus hispida yaprak, RGD-dopamin eşlenik ile functionalized decellularized. MSCs F. hispida yapraklarda yetiştirilen, deterjan ücretsiz yöntemi tarafından decellularized ve bir RGD-dopamin eşlenik (500 µm ölçek çubukları başvuru için eklenmiştir) ile functionalized(a)parlak alan görüntü decellularized yaprak (B bölümünün ) Calcein floresan görüntü lekeli yaprak yüzey (C) birleştirilmiş parlak alan ve floresan görüntü üzerinde büyüyen MSCs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, bitki doku decellularize için iki yöntem açıklanmaktadır. Burada anlatılan sonuçları önceki çalışmalar25, sonuçları ile birleştiğinde ortaya koymak protokolleri muhtemeldir önermek geniş bir yelpazede uygun bitki tür ve sapları ve yaprakları üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu yordamları basit ve bitki decellularization çoğu laboratuvarlarında yürütülen olabilir bu yüzden özel ekipman gerektirmez. Bu decellularization sonra iskele memeli hücre adezyon kolaylaştırmak için functionalized gerekir ki dikkat çekicidir. Memeli hücre adezyon ve doku olmuştur bitki büyüme sağlamak için farklı functionalization teknikleri başka bir bölümünde25 ve are değil konu geçerli alt alta yazılmalıdır.

Burada sunulan her iki decellularization Protokolü (Şekil 1) son adımında onların başarısı için önemlidir. Ne zaman iki yöntemden herhangi birini yapmak değil fazla kalabalık banyoda bu kadar dengesiz bir açıklığa neden olur. Bu yöntemlerin bütün yaprakları ve sapları için uygulanabilir; Ancak, bu onları temizlemek için gerekli süreyi artırır. Örnekleri tamamen açıklığın tüm örnek tutarlı tutmak için batık emin olun. İdeal olarak, decellularization bitki dokuları en hücresel madde yapısal hasarı en aza indirerek temizlemek gerekir. Deterjan ücretsiz yöntemi ile istenen örnek çalışmaya karşılayacak biçimde değiştirilmiş muhtemeldir. Daha yüksek banyo sıcaklıklar daha hızlı kez temizlenmesi neden olabilir ama aşırı inkübe olsalar da daha fazla zarar örnekleri için neden. Düşük sıcaklıklar daha uzun kuluçka süreleri gerekli olabilir ve daha kırılgan örnekleri için uygun olacaktır. Çamaşır suyu çözüm konsantrasyonu da hızlandırmak veya decellularization süreci yavaşlatmak için değiştirilebilir. Yeni örnekleri kullanmak için deterjan ücretsiz yöntemi ile sınarken, ile başlamak için 50-60 ° C ile sık sık bir banyo sıcaklığı denetler (ideal olarak her 15-20 dakika) decellularization ilerlemeyi tavsiye edilir Onlar yeterince temizlenene kadar. Bu sıcaklık aralığı tekniğin en iyileştirme sırasında test edildi bitki türlerinin çoğu tarafından iyi tolere. Üzerinde ikmal, örnekleri görsel olarak kontrol ve el ile onlar olmamıştır aşırı inkübe ve onarılamaz zarar olarak emin olmak için yırtılma veya banyo kaldırılması üzerine dağılma tarafından belirtilen. Bu yaklaşımı kullanarak hazırlanan örnekleri göster azaltılabilir bir etkisi hücre büyüme ( Şekil 3Aiçin bakınız) ile sadece deiyonize H2' O. yıkama deterjan tabanlı yaklaşım daha Ancak, bu yıkama Ayrıca Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) ile ve serum-Alerjik medyada, özellikle duyarlı uygulamalar için önerilir.

Deterjan tabanlı (SDS) yöntemi olasıdır çoğu bitki türleri için geçerlidir ve en az fiziksel ajitasyon gerektirdiğinden bütün yaprak ve hassas örnekleri temizlenmesi için kullanışlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi son adım örnekleri decellularization için önemlidir. İyonik olmayan yüzey aktif banyolarında kuluçka süresi ayarlayarak örnekleri farklı fiziksel özellikleri ile temizlenebilir. Bu sürecin önemli bir dezavantajı decellularized doku daha sonra memeli hücrelerinin hücresel metabolik etkinliğini etkileyebilir kullanılan, deterjanlar izleri içeriyor olabilir olduğunu. Bu nedenle, kapsamlı yıkama adımları kullanmadan önce tavsiye edilir. Burada serum-ücretsiz medya tarafından takip Tris-HCl tampon (10 mM, pH 8,5) ile yıkanmış örnekleri olanlar ile yıkanmış H2O kullanımları (Şekil 3B)önce deiyonize daha yüksek hücre canlılığı vardı bulundu.

Tedavi edilmemiş örnekleri ileride kullanmak için her iki yönteminde saklarken, onlara zarar elde edilen iskele değil etkilenen sağlamak için izlemek önemlidir. Hasar zaman ele çatlama ya da aşırı kırılganlık yanı sıra bitki doku renk değişikliği ortaya çıkabilir. Bu örnekleri önce artık yararlı bunları kullanmak için haftalık olarak izlemek ve bertaraf edilecek ihtiyacınız için tavsiye edilir. Hasar başlangıçlı uzun süren daha kalın daha sağlam örnekleri ile örnek türleri arasında değişmektedir.

Genel olarak, bitkiler Biyomalzeme potansiyel bir kaynak fazla sözü tutun. Bu onların doğal olarak geliştirilen karmaşık yapılar tarafından takviye ve onlara yardım özellikleri onların doğal ortamlarda büyür. Bitki doku başarılı kullanımı doku mühendisliği iskele olarak pahalı ve çoğu zaman zor tasarlamak, Biyomalzemeler potansiyel olarak ucuz bir alternatif öneriyor. Doğal olarak bir tür diğerine değişir, bitki doku'nın yüzey topografyası aynı zamanda doğrudan dağınık şekilde odaklı hücresel büyüme25için harnessed olabilir. Örneğin, bir önceki çalışma insan hücreleri topografik ipuçlarını decellularized bitkiler25, mevcut böylece bu iskele hücreleri son derece organize desen25kültür için kullanılan yanıt vermesini göstermiştir. Doku mühendisliği arzu edilir bir diğer özelliği de novo perfusability var. Bitki doku üzerinde yüz milyonlarca yıl sıvı ulaşım son derece verimli olması için geliştiğini ve vasküler ağlarını verimli periosteum24olabilir. Bu özellik hücresel göç ve klinik uygulamalar için yedek doku oluşturma nihai hedefi ile angiogenez rehberlik için kullanılabilir. Bu yüksek yüzey alanı ve birbirine bağlı porozite Biyomalzeme elverişli hücre çoğalması ve implante gösterdi önceki çalışmalarda bulgular tarafından takviye vivo içindekonak hücreleri içe geçirilmesi etkinleştir implant36,37,38,39. Yüksek yüzey alanı ve birbirine bağlı porozite bitki doku40,41,42damgasını da vardır, böylece bitki kaynaklı iskele çevre dokular ile entegre potansiyeline sahip içinde vivo. Ayrıca, son yıllarda yapılan çalışmalarda decellularized yaprakları başarıyla hücreleri24 ile derin ve insan hücreleri decellularized bitki doku üzerinde seribaşı zaman, onlar için onların topografik cues25conformed buldum. Otelde alınan hep birlikte, bitki kaynaklı iskele doğru doku mühendisliği uygulamaları başarılı bir şekilde uygulanması için gerekli özelliklere sahip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

John Wirth bahçeleri Olbrich nezaketle bu projede kullanılan numuneler temini için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kısmen Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü tarafından desteklenen (G.R.G. R01HL115282) Ulusal Bilim Vakfı (DGE1144804) J.R.G ve G.R.G. ve Wisconsin Üniversitesi cerrahi departmanı ve mezunlar Fonu (H.D.L.). Bu eser de kısmen çevre koruma ajansı (yıldız hibe no. 83573701), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL093282-01A1 ve UH3TR000506) ve Ulusal Bilim Vakfı (IGERT DGE1144804) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Biyomühendislik sorunu 135 Decellularized iskele bitki doku yaprakları sapları perfusable iskele decellularization
Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter