Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar los folículos en los ovarios cultivados de ratones jóvenes sin seccionamiento serial. Con inmunofluorescencia de todo órgano y tejido claro, seccionar físico se sustituye por seccionamiento óptico. Este método de preparación de la muestra y visualización mantiene la integridad de órganos y facilita la cuantificación automática de células específicas.
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Artículo de método
Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas
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Resumen
Resumen
Investigación en el campo de la biología reproductiva de mamífero a menudo implica evaluar la salud general de los ovarios y los testículos. Específicamente, en las mujeres, fitness ovárico a menudo es evaluado por visualización y cuantificación de los folículos y ovocitos. Porque el ovario es un opaco tejido tridimensional, los enfoques tradicionales requieren laborioso cortar el tejido en numerosas secciones seriadas para poder visualizar las células en el órgano entero. Además, porque la cuantificación por este método típicamente conlleva puntuación sólo un subconjunto de las secciones separadas por el diámetro aproximado de un ovocito, es propensa a la inexactitud. Aquí, se describe un protocolo que utiliza en su lugar claro de tejido órgano entero y tinción de inmunofluorescencia de ovarios de ratón para visualizar los folículos y ovocitos. En comparación con los enfoques más tradicionales, este protocolo es ventajoso para la visualización de las células en el ovario por muchas razones: 1) el ovario se mantiene intacto a lo largo de la preparación de la muestra y el procesamiento; 2) ovarios pequeños, que son difíciles de sección, pueden examinarse con facilidad; 3) celular cuantificación se logra más fácilmente y con precisión; y 4) el órgano entero reflejado.
Introducción
Para estudiar la composición celular y las características morfológicas de los ovarios mamíferos, los científicos a menudo confían en vivo experimentos, seguidos por la coloración de immunohistological de los ovarios de embebido de parafina. Más recientemente sin embargo, cultura de órgano entero ovario ha demostrado para ser una alternativa eficaz para el estudio de la función ovárica1,2,3,4 porque la técnica puede combinarse con mejor visualización y herramientas de cuantificación. Tradicionalmente, el análisis de la morfología ovárica depende de reconstrucción tridimensional arquitectura ovárica de embebido de parafina secciones seriales, pero, además de ser laborioso y desperdiciador de tiempo, en serie Seccionando tejido embebido de parafina no garantía de reconstrucción adecuada del órgano y secciones a menudo se pierden o mal ordenadas en el proceso.
Además de los desafíos técnicos asociados con el seccionamiento serial, también hay variaciones en los métodos habitualmente utilizados para cuantificar el número de folículos por ovario de5,6. La variabilidad metodológica utilizada actualmente deteriora metanálisis de reserva ovárica a través de estudios5,7. Por ejemplo, números de folículos de diferentes artículos pueden variar en 10 veces o más entre las edades del desarrollo similares dentro de una cepa específica6. Estas grandes diferencias en la cuantificación reportados del folículo pueden conducir a la confusión y han obstaculizado las comparaciones Cruz-estudio. Experimentalmente, los enfoques tradicionales para cuantificación de folículo de secciones seriales realizan recuento de folículos de un número predefinido de secciones (por ejemplo, cada quinto, décimo, u otra sección). Variabilidad en folículo cuenta con este enfoque surge no sólo de la periodicidad en que secciones se cuentan sino también de las variaciones en el grosor de la sección y experiencia técnica en la generación de secciones seriadas de5,6. Además de su variabilidad, otra desventaja de seccionamiento de tejidos tradicionales es que el seccionamiento de ovarios pequeños de animales jóvenes es especialmente difícil y depende en gran medida de tejido orientación8.
El protocolo a continuación describe un ovario rutinariamente usada cultura técnica1 pero mejora grandemente sobre cuantificación de folículo tradicional mediante la sustitución física de seccionamiento con tejido claro y seccionamiento óptico usando microscopia confocal8 ,9. Mediante inmersión del tejido (sin la necesidad de perfusión de transcranial o electroforesis) en una urea y sorbitol basado en solución (por ejemplo, ScaleS(0)10) resultó compatible con la inmunotinción y permitió la reducción de tiempo de limpieza sin comprometer la profundidad de la proyección de imagen. Otros métodos reportados (p. ej., ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12y ClearT212) están más tiempo consumiendo o no permite profundidad resolución óptica de la muestra. Seccionamiento óptico es ventajoso porque es menos mano de obra y mantiene arquitectura tridimensional7,8 el órgano. Otra ventaja de este enfoque es que la preparación de las muestras no requiere de costosos reactivos para eliminar el tejido y puede llevarse a cabo con relativa facilidad.
Específicamente, el protocolo descrito ha sido optimizado para los ovarios de ratón cultivadas en día postnatal cinco pero se ha realizado en los ovarios desde día postnatal 0 - 10. El método hace uso de un sistema de cultivo de ovario en el que el tejido naturalmente se une a la membrana en la que se cultiva, facilitando el manejo del órgano y manipulación. El sistema de cultivo descrito puede utilizarse para mantener explanted ovarios hasta por 10 días y evaluar cómo las diferentes condiciones experimentales pueden interferir con el oocyte supervivencia13. El procedimiento de cuantificación descrito se realiza utilizando el paquete ImageJ FIJI14 de procesamiento de imágenes no comerciales y puede llevarse a cabo en la mayoría de los ordenadores personales. Además, las imágenes utilizadas para la cuantificación es posible disponibles para la comunidad científica, permitiendo así futuros metanálisis.
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Protocolo
Institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Cornell ha aprobado todos los métodos descritos aquí, bajo protocolo 2004-0038 JCS.
1. elaboración de instrumentos y medios de cultivo
- Limpie el área de trabajo con 10% bleach y deje que el blanqueador en la superficie del área de trabajo durante al menos 5 minutos. Después de 5 minutos, quitar el exceso cloro con toallas de papel limpias y 70% de etanol (EtOH). Limpiar el microscopio de disección con el 70% EtOH.
Nota: Es importante que el área de trabajo al menos semi estéril para evitar la contaminación de cultivos de órganos. - Wrap limpieza pinzas y las tijeras con una toalla de papel humedecida con 70% EtOH hasta el tiempo de uso.
Nota: Las herramientas de disección ideal pueden variar según el edad/tamaño del ovario. Mejores resultados se obtienen utilizando la tijera de disección micro aguda uno, dos pinzas de punta fina (o número 5 o 55) y un micro disección tijera de iris. - En un tubo cónico, hacer 50 mL de medio de cultivo de ovario y caliente en un baño de agua de 37 ° C.
- Realizar medio de cultivo de ovario4suplemento 1 x medio esencial mínimo (MEM) con 10% suero bovino Fetal (FBS), 25 mM (ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 4 (HEPES), 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL, 0.25 μg/mL Anfotericina B (p. ej., 45 mL de MEM, 5 mL de calor inactiva FBS, 1,25 mL de HEPES y 0,5 mL de 100 acciones de x de la penicilina, estreptomicina y anfotericina B).
- Preparar las placas y los partes movibles antes la cultura de ovario.
- En una campana de cultivo de tejidos, añadir 1 mL de medio de cultivo de ovario a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm.
- Remojo previo colocar membrana con medio de cultivo. Añadir suficiente medios de comunicación, generalmente alrededor de 0,55 mL por bien, a la placa de cultivo de tejidos de portadora de 24 pocillos y coloque un cultivo celular introducir en el pozo. Asegúrese de que la membrana del inserto toca los medios de comunicación.
- Preparar el número de placas de 35 mm y los pozos con células cultura insertos según el número esperado de ovarios en el experimento. Coloque las placas de 35 mm que contiene 1 mL de medio de cultivo y la placa de 24 pocillos portadora que contienen medios de cultivo y los partes movibles en 37 ° C, 5% CO2y atmosférica O2 la incubadora.
- Arreglar una placa junto a la alcance de disección y ajustar la temperatura a 37 ° C. Mantenga a 37 ° C, 5% CO2 y la atmosférica O2 la incubadora está cerca de la sala de disección.
2. ovario disección y cultivo
Nota: Los ovarios pueden disecar a temperatura ambiente como la exposición a la temperatura ideal no es mínima.
- Eutanasia a los ratones hembra en día postnatal 5, por decapitación, uno a la vez.
Nota: Eutanasia debe realizarse según las pautas IACUC presentes en las instalaciones donde se realiza la investigación. - Rociar al animal con el 70% EtOH. Coloque el animal en la parte superior de la toalla de papel bajo el microscopio de disección. Colocar un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contienen medios de cultivo de ovario cerca del microscopio de disección.
- Con pinzas o con una tijera de iris de micro disección, hacer una incisión a través de la piel del animal y en la cavidad abdominal, con precaución de no para cortar los intestinos. Empujar los intestinos fuera de la cavidad abdominal y localice los ovarios. Extraer los ovarios y colocarlos en el plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contienen medios de cultivo.
- Una vez los ovarios han sido disecados del animal, aumentar la magnificación del microscopio de disección para visualizar mejor los ovarios y los tejidos adjuntos. Con limpiar pinzas de punta fina, quitar todo el tejido no ovárico, como bursa y tejido graso. Tenga cuidado de mantener los ovarios intactos al retirar el tejido no ovárico adjunto.
- Una vez que los ovarios están aislados, coloque el par en los insertos de cultura celular previamente remojadas de la placa de 24 pocillos de portadora (consulte los pasos 1.4.2 y 1.4.3) y ajustar el volumen del medio para que sea suficiente para mantener el órgano húmedo (sin completamente sumergiéndola).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no meter un agujero en la membrana de la célula cultura insertar al transferir los ovarios. - Lugar explantados órganos en 37 ° C, 5% CO2y atmosférica O2 la incubadora.
- Repita los pasos insertar 2.1-2.6 hasta los ovarios de cada animal disecados y puestos en cultivo celular de la placa de 24 pocillos que contienen el medio de cultivo de ovario.
- Cambio el medio de cultivo de ovario cada 2 días, utilizando calentado alícuotas de los medios de comunicación de ovario de un baño de agua de 37 ° C y proceder a 3 parte del protocolo en el deseado momento experimental.
3. tejido fijación
- En un tubo cónico de 15 mL, preparar 4% paraformaldehido (PFA) en 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (p. ej., añadir 2 mL de grado de la microscopia electrónica PFA 16% 6 mL de PBS 1 x).
PRECAUCIÓN: PFA es una sustancia peligrosa y debe ser manejado bajo una campana química. - Fijar los ovarios cultivados, sin quitar el tejido de la inserción de la cultura, cubriendo el tejido con la solución recién preparada de PFA 4%. Sellar los bordes de la placa con plástico adhesivo (para evitar la evaporación) y las muestras a 4 ° C durante la noche.
Nota: Para facilitar la manipulación y la integridad de tejidos, evite desplazar los ovarios de la inserción de la cultura de célula a lo largo de todo el procedimiento. Cultivadas ovarios atados a la superficie de la pieza de inserción son ventajosos para el manejo sin dañar o perder el órgano. - Enjuague el tejido 3 x con el 70% EtOH y tampoco proceda al paso 4.1 o tienda en viales de centelleo llenó de 70% EtOH a 4 ° C hasta más de procesamiento.
Nota: Si se utiliza tejido endógeno expresan proteínas fluorescentes, almacenamiento de las muestras con el 70% EtOH puede reducir grandemente la señal. Alternativamente, tejido puede enjuagarse y almacenado en PBS con azida de sodio 0.2% (NaN3). NaN3 es, sin embargo, altamente tóxico y representa un peligro para la inhalación grave. La solución en la campana y manejar usando equipo de protección personal como los guantes de capa y nitrilo de un laboratorio.
4. todo montaje inmunofluorescencia
- Coloque el tejido fijo en 1 x PBS a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 h antes del paso de permeabilización 4.3.
- Preparar solución de permeabilización y bloqueo.
- Preparar solución de permeabilización como se describe. A PBS 1 x, agregue 0.2% alcohol polivinílico (PVA), solución al 0.1% Sodio borohidruro (NaBH4) (de 12 wt.% en solución de hidróxido de sodio (NaOH) de 14 M) y 1,5% terc -Octylpheny éter de polietilenglicol (detergente tensioactivo no iónico). En un tubo cónico de 50 mL, agregar 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA, 50 μl de NaBH4y 750 μl de detergente tensioactivo no iónico y, a continuación, añadir ultrapura hasta 50 mL de agua y agite bien a temperatura ambiente hasta que la mezcla esté completamente en solución.
- Preparar solución de bloqueo como se describe. PBS 1 x, agregar surfactante no iónico 0,1% detergente, 0.15% de 2, 5 M pH de glicina 7.4, suero de cabra normal 10% 3% albúmina de suero bovino (BSA), 0.2% NaN3, 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 0,25 μg/mL de anfotericina B. preparan una solución de 2.5 M glicina disolviendo 93,8 g de glicina en agua ultrapura hasta un volumen final de 500 mL (pH 7.4) y una solución de 10% NaN3 disolviendo 5 g en 50 mL de agua ultrapura; Luego, en un tubo cónico de 50 mL preparar la solución de bloqueo añadiendo 5 mL de PBS de x 10, 50 μl de un detergente tensioactivo no iónico, 750 μl de la solución madre de glicina, 5 mL de suero de cabra, 1,5 g de BSA, 1 mL de solución NaN3 y 0,5 mL de 100 acciones de x de la penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Añadir agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL y jeringa de filtro de la solución final.
- Quitar y descartar el PBS 1 x del frasco y luego agregar suficiente solución de permeabilización para sumergir completamente los ovarios. Colocar la muestra en solución de permeabilización en un agitador orbital (por ejemplo, nutator) a temperatura ambiente durante 4 horas.
Nota: El tiempo de incubación puede variar según el grosor del órgano. - Reemplazar la solución de permeabilización con suficiente solución de bloqueo para sumergir completamente los ovarios. Sellar el frasco con el plástico adhesivo y dejar el tejido incubando durante un mínimo de 12 h a temperatura ambiente en un agitador orbital.
- Preparar la dilución del anticuerpo primario en solución de bloqueo según el datasheet del fabricante.
Nota: Tenga en cuenta que no todos los anticuerpos son compatibles con el agente de claro. El volumen promedio necesario por muestra es aproximadamente 750 μl.- Para la cuantificación del ovocito, utilice TAp63 (marcador nuclear del ovocito) y MVH (marcador citoplasmáticos célula de germen).
Nota: Los anticuerpos utilizados en las imágenes de inmunofluorescencia son ratón anti-p63 y conejo anti-MVH). La solución del anticuerpo primario puede ser reutilizados 2 x o más si se almacena a 4 ° C entre protocolos de tinción y maneja correctamente para evitar el crecimiento bacteriano.
- Para la cuantificación del ovocito, utilice TAp63 (marcador nuclear del ovocito) y MVH (marcador citoplasmáticos célula de germen).
- Coloque el inserto que contiene el tejido en una placa de 24 pocillos y añadir unos 750 μl de solución de anticuerpo primario. Asegúrese de que los ovarios estén completamente sumergidos. Selle la placa con plástico adhesivo para minimizar la evaporación y dejar el tejido incubar durante 4 días a temperatura ambiente en un agitador orbital.
- Preparar solución de lavado.
- Preparar solución de lavado como se describe. Hacer 1 x PBS, agregar 0.2% PVA 0.15% tensioactivo no iónico, detergente. En un tubo cónico de 50 mL, agregar 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA, 75 μl de tensioactivo no iónico, detergente y agua ultrapura hasta un volumen final de 50 mL.
- Eliminar la dilución del anticuerpo primario y agregue una generosa cantidad de solución de lavado. Asegúrese siempre de sumergir los ovarios. Permiten que los ovarios se sumerja en la solución durante la noche a temperatura ambiente en el agitador orbital.
- Reemplazar la solución de lavado e incubar en Agitador orbital durante 2 h o más.
- Repita el paso 4.9 un tiempo adicional.
- Preparar la dilución del anticuerpo secundario en solución de bloqueo.
Nota: Los anticuerpos secundarios utilizados son colorante fluorescente 488 anti-ratón planteado en cabra y anti-conejo 594 colorante fluorescente en cabra. Consulte el paso 4.5. el volumen promedio necesita por ejemplo. - Retire la solución de lavado de los ovarios y añadir solución de anticuerpo secundario. Proteger las muestras de la luz (placa de envolver con papel de aluminio) y sellar la placa con plástico adhesivo para minimizar la evaporación. Incubar las muestras en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 2 días.
Nota: Seguir protegiendo las muestras de la luz con papel de aluminio durante todos los pasos de incubación posterior. - Retire la solución de anticuerpo secundario de las muestras y agregue solución de lavado. Incubar en un agitador orbital durante 8 h.
Nota: Si desea tinción de 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), añadir 50 ng/mL de DAPI a la primera etapa de lavado (~ 8 h de incubación). - Reemplazar la solución de lavado para un lavado durante la noche.
- Mientras se prepara la solución de claro (ver sección 5), reemplazar la solución con solución fresca de lavado durante la noche y mantener las muestras en el agitador orbital a temperatura ambiente.
5. ovario claro y la proyección de imagen
- Preparar ScaleS(0) solución de limpieza.
- Preparar ScaleS(0) claro solución10 mediante la adición de reactivos en la proporción dada: 40% D-(-) sorbitol (w/v), 10% glicerol, urea de 4,3 M y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO), pH 8.1 (p. ej. en un tubo cónico de 50 mL, agregar 2,5 mL de glicerol, 10 g de sorbitol , 5 mL de DMSO y 12 mL de urea de 9 M para un volumen total de 25 mL. Mezcle la solución por inversión a 50 ° C por 30 min y desgasificar antes del uso.)
- Retire la solución de lavado y sumergir las muestras en la solución de limpieza. Para obtener mejores resultados, mantener las muestras en el agitador orbital.
- Reemplazar la solución de limpieza 2 veces al día hasta que el tejido se vuelve transparentes (aproximadamente 2 días).
- Una vez que el tejido se borra, preparar la muestra para la proyección de imagen retirando cuidadosamente la membrana de insertar que contiene los ovarios cultivados con una fina punta de bisturí y colocar la muestra en un portaobjetos de vidrio.
- Proceder a las muestras en un microscopio capaz de seccionar óptico de la imagen.
6. ovocito cuantificación
Nota: Hay muchos programas diferentes que son capaces de cuantificar las células. Se describe a continuación es un protocolo para la cuantificación de ovocitos utilizando el paquete de procesamiento de imagen no-comercial, ImageJ FIJI14.
- Usando una proyección de intensidad máxima aplanado de la serie de imagen Z -stack para los marcadores celulares específicos de interés (sin el canal DAPI), convertir la imagen en una imagen de 8 bits blanco y negro en tipo en el desplegable de la imagen menú.
- En el menú desplegable de imagen , resaltar la ficha ajuste y seleccione umbral.
- Ajuste el umbral a un nivel que mejor identifica cada ovocito individual. Una vez que se determina el nivel, haga clic en aplicar para generar una imagen en blanco y negro. Una vez completado, cuantificar la muestra delimitación utilizando el icono ovalado o Freehand .
Nota: FIJI-ImageJ tiene diferentes opciones para ajustar la imagen que se utilizarán para la cuantificación de partículas. Por ejemplo, en proceso | Binario pestaña, hay diferentes opciones que pueden utilizarse para mejorar la detección de lo que se contará. En la figura 4, las opciones utilizadas para individualizar mejor los folículos fue Erode, seguido por tapar agujerosy por último cuenca. - En el menú analizar , seleccione analizar partículas. Configurar los parámetros de acuerdo a la resolución deseada.
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Resultados
Este protocolo incluye 6 pasos principales tras disección de ovarios, como se indica en la figura 1. Figura 2 , Figura 3 , Figura 4 destacar las características más novedosas de este protocolo, que incluyen optimización de tejido para los ovarios y todo tejido cuantificación de ovocitos con ImageJ de FIJI.
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Discusión
El estudio de mamífero reproducción requiere utilizar y cuantificar las células especializadas que no son habitualmente susceptibles de cultivo celular. Sin embargo, sistemas de cultivo ex vivo son efectivos en mantener ovario folículo viabilidad1,15. Durante cultura de ovario, el tejido requiere una mayor superficie para el intercambio de nutrientes a través de la difusión. Por lo tanto, 5 - viejo ratón ovarios son ideales en tamaño y forma de cultivo. ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Rebecca Williams y Johanna Dela Cruz de la imagen de BRC de Cornell y Andrew Recknagel para sugerencias y asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado a institutos nacionales de la subvención de salud S10-OD018516 (al centro de la proyección de imagen de Cornell), T32HD057854 a J.C.B. y R01-GM45415 a J.C.S.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Micro tijera de disección 4.5", recta, puntas afiladas | Roboz | RS-5912 | Micro tijera de disección |
| Pinzas estilo joyero 4-3/8", estilo 5 | Integra Miltex | 17-305X | Pinzas de punta fina |
| Micro Tijeras de Iris 4", rectas, puntas afiladas | Integra Miltex | 18-1618 | Micro tijera de disección de iris o micro tijera de disección de resorte |
| 1X Minimal Medios esenciales (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Serium bovino fetal | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| antibiótico-antimicótico (100X) | Gibco | 15240062 | utilizado en el paso 1.3.1 |
| Placa tratada con cultivo de tejidos de 35 mm | Corning | 430165 | |
| Nunc&comercio; Placa portadora de 24 pocillos para insertos de cultivo celular | ThermoFisher Scientific | 141006 | Tamaño de poro: 8μ m |
| Paraformaldehído (PFA) | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15710 | Solución al 16% |
| 1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Mezclador Nutator GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | agitador tridimensional |
| Suero de cabra normal | VWR | 103219-578 | |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Azida sódica (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Solución de borohidruro de sodio (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Utilice la solución, en lugar de la en forma de tableta o polvo |
| Alcohol polivinílico (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Soluble en agua fría |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polietilenglicol terc-octilfenil |
| éter Filtros de jeringa | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Jeringas | BD | 309695 | |
| Ratón anticuerpo anti-p63 (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilución 1:500 |
| Anticuerpo anti-MVH de conejo | Abcam | ab13840 | Dilución 1:600 |
| Alexa Fluor® anti-ratón de cabra 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilución 1:1000 |
| Alexa Fluor® anti-conejo de cabra 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilución 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Software de procesamiento de imágenes | ||
| Pipetas de transferencia de plástico desechables | VWR | 414044-034 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
