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Artículo de método

Un protocolo para adquirir la Tenocyte degenerativa de los seres humanos

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DOI:

10.3791/57634

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9 de junio de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

In vitro uso de tenocytes degenerativa es indispensable la investigación de la eficacia del novedoso tratamiento de la Tendinopatía. Sin embargo, la mayoría estudios utilizan solamente el modelo animal o una tenocyte saludable. Proponemos el siguiente protocolo para aislar tenocytes degenerativa humana durante la cirugía.

Resumen

Tendinopatía, una condición dolorosa que se desarrolla en respuesta a la degeneración del tendón, va en aumento en los países desarrollados debido al aumento de la actividad física y mayor esperanza de vida. A pesar de su creciente prevalencia, la patogenia subyacente sigue siendo confusa, y el tratamiento es generalmente sintomático. Recientemente, se investigaron numerosas opciones terapéuticas, incluyendo factores de crecimiento, células madre y terapia génica, con la esperanza de mejorar la potencia curativa del tendón degenerativo. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se llevaron a cabo sólo en modelos animales o tenocytes humana saludable. A pesar de algunos estudios utilizando tenocytes patológica, al mejor de nuestro conocimiento no existe ningún protocolo que describe cómo obtener tenocytes degenerativa humana. El objetivo de este estudio es describir un protocolo estándar para la adquisición de tenocytes degenerativa humana. Inicialmente, el tejido del tendón fue cosechado de un paciente con epicondilitis lateral durante la cirugía. Luego se tomaron muestras de biopsia del tendón extensor carpi radialis brevis correspondiente a los cambios estructurales observados en el momento de la cirugía. Todos los tendones cosechados parecen opaco, gris, friable y edematosa, que hacía visualmente distinta de los sanos. Tenocytes eran cultivados y utilizados para experimentos. Mientras tanto, la mitad de los tejidos cosechados fueron analizada histológicamente, y se ha demostrado que compartían las mismas características claves de Tendinopatía (angiofibroblastic displasia o hiperplasia). Un análisis secundario por immunocytochemistry confirmó que las células cultivadas tenocytes con la mayoría de las células que tienen las manchas positivas para mohawk y tenomodulin las proteínas. Luego se determinaron las cualidades de la naturaleza degenerativa de tenocytes comparando las células con el control sano con un ensayo de proliferación o qRT-PCR. La tenocyte degenerativa muestra una mayor tasa de proliferación y similares patrones de expresión de gene de la Tendinopatía que coincidió con los informes anteriores. En general, este nuevo protocolo podría proporcionar una herramienta útil para futuros estudios de Tendinopatía.

Introducción

Tendinopatía es una condición músculo-esquelética degenerativa crónica que se desarrolla en varias partes del cuerpo. Recientemente, el número de casos de tendinopathy ha aumentado considerablemente en el mundo desarrollado debido a la creciente participación en los deportes recreativos y mayor esperanza de vida1,2. La causa de la Tendinopatía es considerada multifactorial y estas causas incluyen la isquemia, lesiones de radicales libres de oxígeno, un desequilibrio entre inervaciones vasoconstrictor y vasodilatador, interno micro-se rasga y los cambios neuro-regulación3 ,4,5,6,7,8. Mayoría de los tratamientos para tendinopathy sólo aliviar sus síntomas. Además, tratamientos sin regeneración de los tejidos requieren mucho tiempo para la rehabilitación y logran una respuesta limitada de tendones lesionados, que impone un desafío clínico para los médicos9.

La incompetencia de las opciones actuales de tratamiento junto con la falta de capacidad de tendón degenerativo de self-heal tiene investigadores a tomar interés en explorar estrategias alternativas del tratamiento. Recientemente, nuevos estudios registrados muchos resultados prometedores para la mejora de la eficacia curativa de los tendones Tendinopatía mediante factores de crecimiento, células madre terapia y terapia de gene10,11,12.

A través de una revisión de la literatura, encontramos que los estudios implicados pueden dividirse en dos categorías basadas en sus análisis de materiales: modelos animales como una rata, un ratón o un conejo; y modelos humanos. En relación con el modelo animal, actualmente existen dos técnicas populares para generar tendinopathy: inducción química de lesión o sobrecarga del modelo mecánico. Sin embargo, cada modelo animal fue limitado en la reproducción de la Tendinopatía humana compleja patología13,14.

Mayoría de los papeles con muestras humanas se analizaron histológicamente o realiza el en vitro experimento basado en un tenocyte humano sano en lugar de una tenocyte degenerativa15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. sólo unos pocos trabajos registrados que usaron una tenocyte degenerativa humana, pero no describió en detalle el protocolo usado para obtener la tenocyte degenerativa de la humana22,23. En este contexto, cabe señalar que resultados exitosos en el modelo animal o el tejido sano/tenocyte no pueden necesariamente predecir eficacia humana o dosificación eficaz debido a la degeneración del tendón es un proceso complicado y la patogenesia es aún no completamente entendido.

En conjunto, es necesario describir el protocolo estándar para la obtención de la tenocyte degenerativa del tejido humano sin causar efectos adversos al donante. Este artículo describe un protocolo sobre cómo adquirir la tenocyte degenerativa humana. Para validar el protocolo, los tejidos cosechados fueron analizados histológicamente. Entonces, el cultivo de células fue confirmado como la tenocyte degenerativa por usar inmunocitoquímica (ICC), una reacción en cadena de polimerasa de tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y un análisis de viabilidad.

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Protocolo

El protocolo se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y el protocolo fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el centro médico de CHA Bundang.

1. cosecha de tejido degenerativa del tendón del paciente

  1. Diagnosticar la epicondilitis lateral por tomar una historia médica y el uso de hallazgos del examen físico: sensibilidad sobre el origen tendinoso cerca del epicóndilo lateral; dolor evocado por la extensión resistida de la articulación de la muñeca.
  2. Utilice los siguientes criterios de inclusión: mayores de 18 años de edad; una historia de la epicondilitis lateral por un mínimo de seis meses; recalcitrantes para tratamiento no quirúrgico; al menos tres meses han transcurrido desde la inyección de corticosteroides, plasma rico en plaquetas o toxina botulínica
  3. Excluir los siguientes: mujeres embarazadas; pacientes con antecedentes de enfermedad de la columna cervical, artritis de codo, enfermedades reumatológicas, cirugía en el codo y el síndrome de atrapamiento del nervio; negarse a donar tejidos de pacientes.
  4. Técnica quirúrgica
    Nota: Ver figura 124.
    1. Después de la anestesia general por intubación endotraqueal e isoflurano, poner el brazo sobre la mesa y aplicar un torniquete. Luego aplique a betadine agente en el brazo entero y cubra con una hoja quirúrgica aséptica.
    2. Exponga el codo lateral mediante una incisión de 3 a 5 cm con Nº 15 bisturí hoja sólo anteromedial del epicóndilo lateral y proximal al nivel de la articulación.
    3. Visualmente identificar la interfaz de aponeurosis del extensor y del extensor carpi radialis longus (ECRL) y haga una incisión División 2-3 mm en profundidad entre la aponeurosis ECRL y extensor con una hoja de bisturí Nº 15 en la interfaz identificada.
    4. Extraiga el ECRL anterior, que traerá el origen patológico del extensor carpi radialis longus brevis (ECRB) debajo en visión directa.
    5. Identificar visualmente el tejido patológico degenerativo por su característico color grisáceo opaco y el tejido generalmente edematoso y friable.
    6. Después de la identificación, cuidadosamente resecar todo el tejido degenerativo agudamente con bisturí Nº 15 y hojas de mini.
    7. Incrustar el tejido resecado (alrededor de 1 cm3) en tampón fosfato salino (PBS) inmediatamente y eliminar todo el tejido circundante excepto tejido de tendón con cuidado en unos 10 mL de PBS tan pronto como sea posible.
    8. En casos con exostosis ósea en el epicóndilo lateral, eliminar la exostosis con una gubia y alisar con una escofina. Hacer varios agujeros (diámetro 1,6 mm, aproximadamente 6-8 agujeros) en el cóndilo anterolateral para mejorar suministro vascular. Esto es opcional.
    9. Cerrar la herida capa por capa utilizando material de sutura no absorbible.
  5. Control sano tenocyte
    1. Obtener tenocytes sanos el tendón restante del auto-tendón de la corva o auto-rótula tendón durante la reconstrucción del ligamento cruzado anterior y usarlo como control para el siguiente experimento25.
      Nota: El número de muestras utilizadas en este estudio fueron tres en cada grupo.

2. histología

  1. Almacenar cerca de la mitad del tejido recolectado en formalina 10% tamponada neutra en una campana química o equivalente.
  2. Incrustar el tejido en un bloque de parafina (4 – 5 mL) y sección en secciones de 4 – 5 μm coronal.
  3. Mancha de las secciones de control y degenerativo tendón con tinción de hematoxilina y eosina (H & E) y la mancha azul de Alcian en pH 2.5. Realizar tinción H & E en un aparato de tinción automatizado como sigue.
    1. Desparafinizar usando xileno (3 veces, 5 min, respectivamente).
    2. Hidratación de alcoholes graduales al agua (100% de alcohol, 4 min 100% de alcohol, 3 min alcohol de 95%, 2 min; 70% de alcohol, 1 min; agua, 2 min).
    3. Mancha en hematoxilina por 5 min lavar bien en agua durante 2 minutos.
    4. Diferenciar en alcohol ácido al 1% (1% ácido clorhídrico en alcohol al 70%) para 3 s. lavar bien en agua durante 3 minutos.
    5. Neutralizar el HCl por inmersión en un amoníaco 0.5% por 10 s, seguido de un lavado con agua 3 minutos.
    6. La mancha en Eosion durante 5 minutos.
    7. Deshidratar con alcoholes (alcohol al 80%, 30 s, alcohol al 95%, 1 min, 100% alcohol 1 min, 100% alcohol 2min).
    8. Claro en el xileno (3 veces, 2 min, 2 min y 3 min, respectivamente).
    9. Monte con una diapositiva de cubierta.
  4. Realizar immunohistochemitry (IHC) utilizando el kit de detección de refinar de polímero de bonos según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores.
    1. Después de la parafina con xileno, realizar un procedimiento de recuperación de antígeno mediante enlace solución de recuperación del epítopo durante 30 min a 100 ° C. La solución de recuperación del epítopo Bond contiene un tampón citrato basa y surfactante (1 L, pH 5.9 – 6.1).
    2. Quench peroxidasas endógenas por incuba el tejido con agua oxigenada por 5 min.
    3. Incubar las secciones durante 15 min a una temperatura ambiente (21-22 ° C) con anticuerpos primarios contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) o mohawk (1: 200).
    4. Realizar el anticuerpo secundario marcado con un sistema de rábano poliméricas libres de biotina peroxidasa-linker anticuerpo conjugado.
      1. Uso secundario conejo anti ratón IgG en suero animal, 10% (v/v) en solución 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one Tris-buffer saline/0.09% localizar anticuerpos de ratón.
      2. Uso de anti-conejo polímero poli-HRP-IgG (< 25 μg/mL) con suero animal 10% (v/v) en tampón Tris saline/0.09% localizar anticuerpos de conejo.
      3. Uso 3, 3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride hidrato en una solución de estabilizador para visualizar el complejo a través de un precipitado marrón.
      4. Contratinción con < 0.1% hematoxilina (azul) para visualizar los núcleos celulares.
  5. Observe los portaobjetos teñidos con H & E, Alcian azul manchas e IHC para VEGF, tenomodulin y mohawk bajo microscopio de luz y obtener imágenes microscópicas representativas de cada diapositiva en el campo de un gran aumento (400 X).

3. Tenocyte cultura

  1. Preparación de tejido
    1. Preparar la muestra de tendón eliminando todo el tejido circundante con micro-tijeras y pinzas.
    2. Lavar con PBS y pique en trozos pequeños (de 1 mm3 o menos).
    3. Digerir tejido para 1 h en 30 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 30 mg/mL de colagenasa II a 37 ° C.
    4. Pasar las células a través de un tamiz celular de 100 μm.
    5. Desactivar colagenasa II agregando 1 mL de suero bovino fetal (FBS).
    6. Centrifugue a 196 x g durante 5 minutos.
  2. Cultivo de células
    1. 3 x 105 células de semillas en un plato de 100 mm y de la cultura con DMEM suplementado con 10% FBS y solución antibiótico-antimicótico 1% a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 para 1 semana.
    2. Cambiar el medio de cultivo cada tres días hasta que se produce el 80% de confluencia. Cultura saludable control y muestras de células degenerativas hasta paso cuatro y use para el experimento.

4. inmunocitoquímica (ICC)

  1. Transfiera 200 μL de cultivo de células (2 x 105 células) en los ocho pocillos de un portaobjetos de la cámara y hacer crecer las células a la confluencia con la adición de medio fresco por 1 día.
  2. Lavar las células con PBS y se fijan con 500 μl de formaldehído al 4% por pozo.
  3. Incube los portaobjetos con 0.5% Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos para la permeabilización de las membranas.
  4. Bloque en PBS con 1% albúmina de suero bovino y 0.05% TWEEN-20 mohawk y tenomodulin, respectivamente.
  5. Incubar en la oscuridad con anticuerpo monoclonal de ratón anti-mohawk (dilución 1: 100) y el anticuerpo del anti-tenomodulin de cabra (dilución 1: 100) a 4 ° C durante la noche.
  6. Incubar los anticuerpos secundarios (Alexa 555-anti cabra (1: 200) para tenomodulin; Ratón de 488-anti Alexa (1: 200) para mohawk) en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente.
  7. Monte con 0,5 μl de un medio de montaje de fluorescencia.
  8. Analizar utilizando un microscopio de fluorescencia (400 X).

5. proliferación ensayo

  1. Viabilidades de la célula de medida utilizando tetrazolio soluble en agua (WST) -1.
    1. Semilla sanas y degenerativas de las células en 96 placas pozos a una densidad de 2 x 103 células por pozo para 24, 72 y 120 h.
    2. Después de la incubación, añadir 10 μl de la solución de WST-1 de 10% a cada pocillo.
    3. Incubar las placas durante 3 h a 37 ° C en 5% CO2.
    4. Medir la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Tomar lecturas de al menos tres veces en todos los puntos de tiempo para cada muestra.
  2. Medir celular ADN la cantidad usando el ensayo de BrdU.
    1. Semilla tanto saludable y células degenerativas en 96 placas bien con una densidad de 2 x 103 células por pozo para 24, 72 y 120 h.
    2. Después de la incubación, añadir 10 μl de solución de BrdU de 10% a cada pocillo.
    3. Incubar las placas durante 3 h a 37 ° C en 5% CO2.
    4. Añadir 100 μL/pocillo de la solución de fijación/desnaturalizar (60 – 70% de etanol, 0.1 – 0.5% de hidróxido de sodio) y mantener la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    5. Añadir 100 μL/pocillo preparado 1 x solución de detección de anticuerpos y mantener la placa a temperatura ambiente durante 1 hora.
    6. Eliminar la solución y lave la placa tres veces con el 1 x de tampón de lavado.
    7. Añadir 100 μL/pocillo preparado 1 x solución de anticuerpo secundario conjugado con HRP y mantenga la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    8. Retire la placa de la solución y lavar tres veces con el 1 x de tampón de lavado.
    9. Añada 100 μl de sustrato TMB de 50%.
    10. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    11. Añada 100 μl de solución de parada.
    12. Medir la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
      Nota: Tomar lecturas al menos tres veces en todo momento puntos para cada muestra.

6. estadístico análisis

  1. Recopilar y analizar datos utilizando SPSS.
  2. Describa los datos por la media ± error estándar de la media.
  3. Prueba de Mann Whitney U uso.
  4. Considerar las diferencias estadísticamente significativas cuando el valor p es menor que 0.05 (p < 0,05).

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Resultados

Análisis histológicos revelaron que el tejido recolectado de epicondilitis lateral tenía las características de un tendón de tendinopathic. Sección H & E de Tendinopatía degenerativa del tendón reveló un paquete de colágeno desorganizado con pérdida de polaridad y estructuras bien recto, fuertemente lleno de fibra paralela. Signos histológicos sugestivos de degeneración como mayor celularidad y núcleos agrandados sin la forma típica del huso eran comunes en las muestras. Además, los p...

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Discusión

Varios estudios anteriores han reportado cómo crear modelos animales de tendinopathic crónica con diferentes procedimientos como la colagenasa o inyección kartogenin, caminadora funcionando y más26,27. Aunque numerosos estudios mostraron efectos terapéuticos prometedores basados en estos modelos animales, experimentos con la tenocyte degenerativa humana sería cruciales en el campo de la Tendinopatía para reproducir la eficacia del tratamiento. En este artículo, s...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por una donación de Corea salud tecnología R & D proyectos a través de la Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), que fue financiado por el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI16C1559).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BisturíKisanbioKS-Q0306-15Nº 15
MinicuchillaCastor374769
Dulbecco's Engineer's medium (DMEM)Gibco11995065
suero fetal bovino (FBS)Gibco16000044
50 mM de ácido ascórbico-2-fosfatoSigma-AldrichA5960
Solución antibiótica-antimicóticaGibco15240062
4% formaldehídoBio-soluciónBP031
Triton X-100 Sigma-AldrichX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa cruz biotechnologysc-515878
Tenomodulin (N-14)Santa cruz biotechnologysc-49325
Medio de montaje de fluorescenciaDAKOS3023
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
BrdU Kit de ensayo de proliferación celularde señalización celular#6813
TRIzol ReactivoInvitrogen15596018
iScript Kit de síntesis de ADNc Bio-Rad170-8891
TaqMan Mezcla Maestra de Expresión GénicaBiosystems Aplicados4369016
GAPDHThermo Fisher Scientific
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher Scientific
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBThermo Fisher ScientificHs99999903_m1
Filtros celulares (100 µ m) Corning352360
Plato de cultivo de 100 mmThermo Fisher Scientific8188207
Portaobjetos de cámara de 8 pocillosThermo Fisher Scientific154534
96 pocillos transparente de fondo plano de poliestireno tratado con TC Microplacas Corning3596
Nikon Eclipse 50i Lector de microplacas Nikon
VERSA max Molecular Devices
CFX96 Sistema de detección de PCR en tiempo realBio-Rad
Solución de formalina, tamponada neutra, 10%Sigma-AldrichHT501128
ParafinasLeica Biosystems3801340
EtanolJUNSEI CHEMICAL90303-2185
HematoxilinaDAKOCS70030-2
EosinaDAKOCS70130-2
Azul alciánDAKOAR16011-2
Ácido cítricoSigma-Aldrich251275
XilenoJUNSEI CHEMICAL25165-0430
Peroxidasas endógenas DAKOS200380-2
bálsamo de CanadáJUNSEI CHEMICAL23255-1210
Hoja de micrótomoFEATHERA35
Vidrio deslizanteSUPERIOR 1000612
Cubierta de vidrioMarienfeld-Superior101050
VEGFSanta cruz biotechnologysc-7269
SPSS SoftwareIBMVer. 18.0
Centrífuga multipropósitoLABOGENE1248R
PBS Gibco 14190250 Tecnología Hs02786624_g1 Hs00243225_m1

Referencias

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