Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) han estado jugando un papel esencial en la expansión de nuestro conocimiento sobre el desarrollo animal, gene funciones en vivoy los mecanismos de progresión de la enfermedad^1,2. Del germline GEMMs tradicionalmente se desarrollan de dos formas. La primera es la creación de ratones transgénicos mediante inyección pronuclear del plásmido de ADN seguida por el trasplante de cigotos en las hembras seudopreñadas. El otro es la generación de ratones knock-out/knock-in por la recombinación homóloga en células madre embrionarias y el desarrollo de quimeras. Condicional knockout de genes en un tipo específico de tejido o células de interés consiste en la cría de alelos genéticamente con Cre y flox para varias generaciones. Todo el proceso puede ser costoso y desperdiciador de tiempo, especialmente si el objetivo es atacar múltiples genes tejido específica. Recientemente, se han aplicado tecnologías de edición de gene como clusters regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) a varios órganos de los ratones para inducir alteraciones genéticas específicas de tejido para el cáncer autóctono modelado^{3, 4,5,6,7} o mutaciones de la enfermedad correcta en situ^8,9. En estos estudios, la entrega de los vectores de gRNA generalmente se logra a través de infección adenoviral o lentivirales del órgano o hidrodinámica inyección en la vena de la cola. La relativa facilidad de la entrega de los componentes CRISPR para el pulmón y el hígado ha mejorado la comodidad y eficiencia de cáncer en estos órganos en comparación con los modelos tradicionales de ratón basado en Cre-Lox.

El urotelio de la vejiga es donde se originan la mayoría los tumores de vejiga. La entrega de vectores de DNA en el urotelio de la vejiga para terapia de modelado o gen del cáncer se ve entorpecida por una capa de glicosaminoglicanos de la superficie urotelial apical, que actúa como una barrera para la adherencia del virus infeccioso^10,11. Varios agentes pretratamiento Syn3 como dodecil-β-d-maltoside se han utilizado para interrumpir esta barrera y mejorar adenovirus Infección eficiencia^12,13,14. No se ha divulgado si virus adeno-asociados (AAVs) efectivamente pueden infectar la vejiga. En general, un método basado no sería deseable. Aquí, describimos un nuevo método desarrollado en el laboratorio para la eficiente entrega de plásmido de ADN en el urotelio de ratón a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Porque nuestro enfoque no implica pretratamiento químico de la capa de glicosaminoglicanos o producción del virus, significativamente simplifica la entrega de plásmidos de ADN en el urotelio de la vejiga de ratón y debe facilitar varios estudios en vivo de enfermedades de la vejiga.

Todos los procedimientos aquí descritos se realizaron conforme a las directrices y reglamentos de la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California Santa Cruz.

1. plásmido y preparación de herramientas

1. Para cada vejiga transfectar, preparar al menos 20 μl del plásmido de ADN (1 μg/μl).
2. Añadir 1 μl de azul de tripano a 20 μl de solución de plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipeta para mezclar bien.
3. Autoclave de todo quirúrgico instrumentos y esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y guantes con etanol al 70% con frecuencia o utilizar un esterilizador de bolas de cristal cuando realice los pasos siguientes para mantener condiciones estériles.

2. anestesia Animal

1. Utilice un sistema de anestesia superior tabla para anestesiar el animal con isoflurano. Encienda el tanque de O₂ y ajustar el flujómetro de oxígeno de 1 L/min.
2. Colocar un ratón C57BL/6J femenino adulto en la cámara de inducción. Encender y ajustar el vaporizador de isoflurano al 3% para la inducción. El ratón debe estar en anestesia en 2 minutos administrar analgésico de la buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea al quitar el ratón de la cámara de inducción para la analgesia preventiva.
   Nota: En el presente Protocolo, ratones femeninos se utilizan, como son más fáciles de trabajar con durante la cateterización de la uretra. El protocolo también funciona para ratones machos, pero se necesita mucho cuidado al realizar el paso 3.
3. Aplicar pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad. Coloque el ratón anestesiado hacia arriba sobre una almohada con la nariz en el cono de nariz. Gire el interruptor de circuito de aire para dejar isoflurano a través del cono de nariz.
4. Sujetar la cabeza y el cono de la nariz con cinta adhesiva. Ajustar el vaporizador de isoflurano al 2% para mantenimiento.
5. Sujetar las extremidades con cinta adhesiva. Realizar pruebas del pellizco del dedo del pie para asegurarse de que el animal está en anestesia profunda y luego afeitarse la zona abdominal.

3. orina agotamiento y lavado de vejiga

1. Aplique lubricante a la sonda (24G, longitud de 2,11 cm, diámetro externo de 0,045 cm) y asegúrese de que su superficie externa está cubierta totalmente.
2. Inserte el catéter en la abertura de la uretra y empuje lentamente hasta llegar a la vejiga, momento en el que la orina debe salir a través del catéter. Presione suavemente el abdomen para ayudar a la disminución de la orina.
   1. Comprobar si el catéter se inserta correctamente en la vejiga observando automático orina salida. Evite puncionar la pared de la uretra y la vejiga y aplique lubricante varias veces si es necesario.
3. Descartar la orina con una pipeta en un vaso de residuos.
4. Pipetear 80 μl de tampón fosfato salino (PBS) en el extremo externo del catéter, con el otro extremo en la vejiga. Cuidadosamente coloque una jeringa de 1 mL a la sonda. Empuje suavemente la jeringa para inyectar el PBS de la vejiga. Deje algunos PBS en el catéter para evitar la creación de burbujas de aire en la vejiga.
5. Quite la jeringa. Esperar para que PBS drenar fuera de la vejiga. Presione suavemente el abdomen para evacuar a PBS.
6. Descartar el PBS en el catéter con una pipeta en el vaso de residuos.
7. Repita dos veces más PBS lavado (pasos 3.4-3.6).
   Nota: Es fundamental trabajar suavemente durante estos pasos de lavado. Sangre en el catéter o el fracaso de automático hacia fuera-flujo de líquido indica generalmente la uretra se perfora a través. También es importante evitar la introducción de burbujas de aire, ya que reducirá la eficacia de la electroporación.

4. plásmido entrega

1. Etanol al 70% se aplica al abdomen de ratón y utilizar un bisturí para hacer una incisión vertical de 1 cm para abrir la piel abdominal sobre la vejiga.
2. Pipeta de al menos 20 μl del plásmido más solución de azul de tripano en el extremo externo del catéter y conecte la jeringa.
3. Inyecte la solución de plásmido en la vejiga. Si la vejiga se vuelve azul, la inyección es exitosa. Deje un poco de líquido en el catéter para evitar la creación de burbujas de aire en la vejiga.
4. Agarrar el orificio uretral externo con unas pinzas y retire el catéter y la jeringa. Utilice una cuerda para apretar el orificio uretral externo. Hacer dos lazos con la cadena y luego atar con dos nudos.
   Nota: Estrechamiento de la uretra es importante para la prevención de retroflujo de líquido de plásmido.
5. Encienda el generador de electroporación con los siguientes parámetros: 33V, 50 ms tiempo de trabajo y 950 ms tiempo.
6. Mantenga la vejiga con las pinzas y pellizcar la vejiga con dos electrodos. Empuje el pedal de pie para llevar a cabo la electroporación.
   Nota: Los impulsos eléctricos se establecen se produzca 5 veces con intervalos cortos después de cada pulsación del pedal. El ratón puede twitch en este proceso. Empujar el pedal más de una vez puede aumentar la eficiencia de la entrega, pero demasiados impulsos eléctricos pueden dañar la integridad del tejido del urothelium.
   1. Evite cualquier contacto entre las pinzas y los electrodos, ya que esto va a generar una chispa.

5. recuperación

1. La sutura la abertura abdominal y piel con sutura quirúrgica estéril y clips. Aplicar yodo en la herida.
2. Eliminar el animal en el sistema de isoflurano. Administrar el analgésico de la buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor post-surgical.
3. Mantener el animal en la almohada y volver a la jaula casera después de la recuperación completa. Compruebe el animal al menos una vez al día para la movilidad normal, beber y la alimentación comportamientos y no hay signos de infección hasta que la incisión haya sanado y luego retire los clips. Administrar las inyecciones subsecuentes de buprenorfina analgésico si el animal muestra síntomas de dolor tales como reducir la preparación, mayor agresividad y vocalización.

Para demostrar el éxito de la entrega del gene en el urotelio de la vejiga, se utilizó el plásmido de15 pCAG-GFP para la electroporación. 20 μl de solución de azul de tripano y plásmido fue inyectado a través de la uretra y se administraron 5 pulsos eléctricos. Después de 48 h, diseca la vejiga de ratón y observaron manchas de fluorescencia de GFP bajo el microscopio de fluorescencia de la disección, mientras que un negativo control de vejiga que no se someten a electroporación no mostraron ninguna señal GFP (figura 1A). Cuando realizamos la tinción de inmunofluorescencia de los tejidos de la vejiga seccionada con citoqueratina (CK) 5, CK18, y anticuerpos GFP, encontramos que la GFP estaba presente en paraguas, intermedio y las células basales de la señal, pero no en el músculo de la capa (figura 1B), lo que indica buena especificidad de la entrega del plásmido en el urotelio. Aproximadamente el 15% de las células uroteliales son GFP+, y tal carácter clonal debe ser ideal para modelado desde tumores generalmente inician desde las células individuales de cáncer.

Figura 1: entrega exitosa de plásmido pCAG-GFP en el urotelio de la vejiga ratón. (A) comparación de una vejiga que experimentó la electroporación (derecha) a una vejiga de control negativo (izquierda) mostrando que la electroporación con éxito dado que la vejiga vuelta verde. Inmunofluorescencia (B) la coloración de los tejidos de la vejiga seccionado mostrando el patrón de expresión del mosaico de células GFP+ en paraguas (CK18+), intermedia (CK5+CK18+) y basal (CK5+) capas urotelial. Barra de escala en A corresponde a 1 mm y en el B a 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no declaran intereses que compiten.