Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Resumen

Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

Resumen

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) son extremadamente valiosos en revelar nuevos biológicos penetraciones en los mecanismos de iniciación y progresión de enfermedades como el cáncer. Ratones transgénicos y condicional knockout se han utilizado con frecuencia para la sobreexpresión del gen o la ablación de tejidos específicos o tipos en vivo. Sin embargo, generación de modelos de línea germinal del ratón puede ser lentas y costosas. Los avances recientes en gene de la edición de tecnologías y la factibilidad de entrega de plásmidos de ADN por infección viral han permitido la rápida generación de germline no autóctonas ratón cáncer modelos para varios órganos. La vejiga es un órgano que ha sido difícil para vectores virales acceder, debido a la presencia de una capa de glicosaminoglicanos cubriendo el urotelio. Aquí, describimos un nuevo método desarrollado en el laboratorio para la eficiente entrega de plásmidos de ADN en el ratón vesical urotelio en vivo. A través de la instilación intravesical de plásmido de DNA pCAG-GFP y electroporación de vejiga quirúrgico expuesta, mostramos que el plásmido de ADN puede ser entregado específicamente en las células uroteliales de vejiga de expresión transitoria. Nuestro método proporciona una manera rápida y conveniente para la sobreexpresión y knockdown de genes en la vejiga de ratón y puede aplicarse a la construcción de GEMMs de cáncer de vejiga y otras enfermedades urológicas.

Introducción

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) han estado jugando un papel esencial en la expansión de nuestro conocimiento sobre el desarrollo animal, gene funciones en vivoy los mecanismos de progresión de la enfermedad^1,2. Del germline GEMMs tradicionalmente se desarrollan de dos formas. La primera es la creación de ratones transgénicos mediante inyección pronuclear del plásmido de ADN seguida por el trasplante de cigotos en las hembras seudopreñadas. El otro es la generación de ratones knock-out/knock-in por la recombinación homóloga en células madre embrionarias y el desarrollo de quimeras. C....

Protocolo

Todos los procedimientos aquí descritos se realizaron conforme a las directrices y reglamentos de la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California Santa Cruz.

1. plásmido y preparación de herramientas

1. Para cada vejiga transfectar, preparar al menos 20 μl del plásmido de ADN (1 μg/μl).
2. Añadir 1 μl de azul de tripano a 20 μl de solución de plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipeta para mezclar bien.
3. Autoclave de todo quirúrgico instrumentos y esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y guantes con etanol al 70% con frecu....

Resultados

Para demostrar el éxito de la entrega del gene en el urotelio de la vejiga, se utilizó el plásmido de¹⁵ pCAG-GFP para la electroporación. 20 μl de solución de azul de tripano y plásmido fue inyectado a través de la uretra y se administraron 5 pulsos eléctricos. Después de 48 h, diseca la vejiga de ratón y observaron manchas de fluorescencia de GFP bajo el microscopio de fluorescencia de la disección, mientras que un negativo control de vejiga que no se someten a el.......

Discusión

La electroporación aumenta la permeabilidad de la membrana de la célula y es una poderosa tecnología para gene i¹⁶. Entrega del gene en roedores vivos por la electroporación se ha utilizado con frecuencia en Neurobiología campos^{17,18,19,20,21}. Sus posibles aplicaciones en muchos otros órganos no se han explorado extensivamente. A nuestr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD 1mL TB Jeringa	Fisher	148232E
	Sigma	B9275-50MG
Pinzas Dumont	Roboz Surgical Instr	RS-5005	Tratar con etanol al 70% antes del uso quirúrgico
ECM830 SQ Electroporador	de onda Harvard Apparatus 450052
Exel International Safelet Safelet Catéteres intravenosos	Fisher Scientific	14-841-21	24G, 2,11 cm de longitud, 0,045 cm de diámetro exterior
Tijeras de microdisección extrafinas	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Tratar con etanol al 70% antes del uso quirúrgico
Isoflurano	Vet one	501017
K& H Alfombra de descanso calentada para animales pequeños, 9 por 12 pulgadas	Amazon	n/a	Cubra la alfombra térmica con toallas de papel
Pomada oftálmica	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Puntas de pipeta 200 µ L	USA Scientific	1111-0206
Puntas de pipeta, ajuste universal; 0,1 a 10 y micro; L Fisher		02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plásmido CAG-GFP	Addgene	16664
Pinza de platino 5 mm	Aparato Harvard	450489	mm de diámetro
Tijeras	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Tratar con Etanol al 70% antes del uso quirúrgico
Cordón de cuerda	Amazon	n/a	Artesanía Mandala 150D 210D 0,8 mm Costura de cuero de 1 mm Cordón de hilo encerado plano
Cinta, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Lubricante veterinario	PBS salud animal	353-736
Tinte azul de tripán	Life Technologies	15250061
V-1 Tablero de mesa sistema de anestesia	VetEquip	901806
Vicryl violeta sutura 18" FS-2 corte 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidona Yodada 10%	Walgreens	953982
Pinza para heridas	Fisher	018045
Aplicador de pinzas para heridas	Fisher	01804

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