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Artículo de método

Modelo murino de aspiración orofaríngea de neumonía bacteriana asociada a la ventilación y adquirida en el Hospital

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DOI:

10.3791/57672

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28 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

En este artículo

Resumen

Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes en humanos. Un modelo apropiado en vivo es fundamental para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica de la novela. Con este modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea, uno puede examinar la patogenesia y nuevos tratamientos contra las infecciones mortales.

Resumen

Modelos murinos de infección son fundamentales para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica novedosa para combatir agentes patógenos causales. Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes que presentan los pacientes en la clínica y así garantiza un modelo apropiado en vivo . Neumonía típica modelos utilizan la inoculación intranasal, que deposita excesiva organismos fuera del pulmón, causando complicaciones fuera del objetivo y los síntomas, tales como sinusitis, gastritis, enteritis, trauma físico o micropartículas de la bruma para imitar el aerosol propagación más típica de la neumonía viral, tuberculosa o micótica. Estos modelos no reflejan con exactitud la patogenia de la neumonía bacteriana típica o healthcare-adquirida en la comunidad. En contraste, este modelo murino de neumonía por aspiración orofaríngea imita el recorrido de la gota en neumonía adquirida en el cuidado de la salud. Suspensión en la orofaringe de ratones anestesiados inocular 50 μl de las bacterias hace que aspiración reflexiva, que produce neumonía. Con este modelo, uno puede examinar la patogenesia de patógenos causantes de neumonía y nuevos tratamientos para combatir estas enfermedades.

Introducción

Infección de vías respiratoria inferiores es la enfermedad contagiosa más mortífera del mundo y la causa más común de muerte en los países en desarrollo1. Estas infecciones representan a nivel mundial, más de 3,2 millones de muertes de1. Además, neumonía nosocomial es una de las formas más comunes y mortales de salud infecciones adquiridas y es causada por los patógenos más resistentes a los antibióticos2,3. La ruta típica de adquisición de neumonía bacteriana tanto adquiridas en la comunidad y neumonía nosocomial es la aspiración de contenido orofaríngeo en el alvéolo. Modelos murinos utilizados para estudiar estas enfermedades a menudo utilizan la inoculación intranasal4, depositando gran parte de las bacterias fuera de los pulmones, causando síntomas como sinusitis o trauma físico, que son incongruentes con la enfermedad y las complicaciones fuera del objetivo progresión en humanos que los modelos fueron diseñados para emular. Otros modelos pueden utilizar cámaras de inhalación y los dispositivos micromisting, que más exactamente imitan a neumonías virales, tuberculosas y micóticas, pero exactamente no recapitular la ruta normal de adquisición de las neumonías bacterianas típicas.

El modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea puede utilizarse para simular la ruta natural y patogenia de la neumonía bacteriana. Por inoculación 50 μl de la suspensión bacteriana en la orofaringe de ratones anestesiados con una pipeta, sobreviene la aspiración reflexiva, que produce neumonía infecciosa. Usando este modelo, uno puede examinar la patogenesia de patógenos causantes de neumonía y nuevos tratamientos para combatir estas enfermedades con un modelo de fidelidad mayor, más análogo a las infecciones de neumonía de aspiración observadas en humanos. Además, a diferencia de modelos similares que infectan a través de la cavidad bucal5,6, este modelo asegura que el inóculo completo llegue a los pulmones en lugar del intestino, donde puede causar inflamación externa e infecciones, como gastritis y la enteritis. Por último, a diferencia del otro modelo publicado que requiere un laringoscopio y que inocula a través de la tráquea7, este modelo no obstruye la vía aérea con una aguja de la sonda y no requiere de inyección para la entrega de inóculo. Por el contrario, la inoculación se basa en el reflejo de la aspiración natural del ratón.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales deben ser aprobados por el investigador institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).

1. preparación del inóculo bacteriano

  1. Aislar colonias bacterianas.
    1. Racha de una cepa bacteriana (p. ej., a. baumannii "HUMC1") en medio de agar estéril adecuada (por ejemplo, agar soja tríptico), teniendo cuidado de generar colonias aisladas.
    2. Incubar en condiciones apropiadas (por ejemplo, durante la noche a 37 ° C).
  2. Crecer el cultivo durante la noche.
    1. Seleccione a un representante de Colonia aislada de la placa de agar con un asa de inoculación estéril y se usa para inocular 10 mL de medio de caldo estéril adecuada (por ejemplo, caldo de soja tríptica).
    2. Permita que la muestra llegar a la fase estacionaria en las condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche en un frasco cónico tapa de ventilación, 50 mL).
  3. Crecer la subcultura.
    1. Transferir 100 μL de la cultura durante la noche a 10 mL de caldo estéril fresca con ayuda de una pipeta.
    2. Permiten llegar a la fase exponencial/registro en las condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 ° C con agitación a 200 rpm durante 3 horas en un frasco cónico tapa de ventilación, 50 mL).
  4. Lave la subcultura.
    1. Retire la subcultura de su entorno de incubación.
    2. Centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las bacterias.
    3. Aspirar y descartar el sobrenadante.
    4. Añadir 10 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) al pellet y vortex vigorosamente, hasta que completamente suspendidas.
    5. Repita los pasos 1.4.2 - 1.4.4 dos veces, para un total de 3 lavados.
  5. Ajustar la concentración de la suspensión bacteriana.
    1. Usando un espectrofotómetro que mide la densidad óptica a 600 nm (OD600), medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana.
    2. Añadir PBS estéril en la suspensión bacteriana hasta que la densidad óptica del inóculo a un OD600 de 0.5, utilizando la ecuación C× V = Cf× Vf, donde "C" es la concentración, "V" es el volumen, "" es inicial, y "f" es final. * Cf debe ser siempre 0,5; Vf es la variable a resolver.
    3. Si la suspensión bacteriana cae por debajo de un OD600 0.5, centrifugar a 4.000 × g por 5 min a las bacterias de la pelotilla y extraiga una cantidad apropiada del sobrenadante a un OD600 de 0.5.
    4. Realizar diluciones seriadas en PBS estéril (p. ej., tres diluciones 1: 100 para lograr 1 × 10-6) y la placa de agar estéril para determinar el coeficiente de correlación que revela la concentración bacteriana en la formación de Colonia unidades por mL (UFC/mL) a un OD600 de 0.5.
      Nota: El valor de este coeficiente de correlación puede variar para cada cepa de cada especie y debe ser determinado antes de la preparación del inóculo para una infección.
    5. Después de determinar el coeficiente de correlación, utilizarlo para crear un inóculo de la concentración deseada (p. ej., 2 × 108- 1 × 109 UFC/mL); Si el inóculo deseado es mayor que el OD600 0.5, centrifugar la suspensión bacteriana en 4.000 × g por 5 min a las bacterias de la pelotilla y extraiga una cantidad apropiada del sobrenadante para alcanzar la concentración deseada.
    6. Realizar en vivo estudios piloto para determinar la virulencia de cada cepa bacteriana en cada cepa de ratón, estos valores pueden variar entre aislamientos bacterianos de la misma especie y ratones de diferentes fondos genéticos. Para varias especies Gram-negativas, LD100 en ratones es generalmente 1-5 × 108 UFC/ratón, aunque algunas cepas son letales en inóculos inferiores.
  6. Congelar alícuotas idénticas para uso futuro como inóculo en la demanda, precisa, como previamente publicados8 (opcional).
    1. Preparar 1 L de inóculo bacteriano como se describe anteriormente, transferencia a dos frascos cónicos de 500 mL y centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos.
    2. Deseche 450 mL del sobrenadante de cada frasco cónico y resuspender el pellet de bacterias en el sobrenadante restante.
    3. Transferir el inóculo bacteriano concentrado a un vaso de precipitados de 250 mL que contiene una barra de agitación magnética y mezclar continuamente en la parte superior una placa de agitación 300 RPM.
    4. Cuidadosamente transfiera exactamente 600 μL del inóculo bacteriano concentrado (p. ej., 1 × 1010 UFC/mL) usando una pipeta a un frasco de 1,6 mL criogénico que contiene exactamente 300 μL de estéril de H2O y 300 μL de glicerol estéril; mezclar y almacenar a-80 ° C.
      Nota: El glicerol necesario para almacenamiento puede confundir los resultados experimentales y causar exceso de mortalidad, por lo que es necesario lavar a cabo.
    5. Cuando esté listo para su uso, descongelar la muestra 10 min a temperatura ambiente.
    6. Transferir 1 mL a un frasco cónico de 50 mL, añadir 9 mL de PBS estéril y centrifugar a 4.000 x g durante 5 minutos para que sedimenten las bacterias. Aspirar el sobrenadante y resuspender la cantidad predeterminada de UFC (× 1 mL congelada stock concentración en UFC/mL) en un volumen adecuado de PBS para alcanzar la concentración deseada para el inóculo infeccioso.

2. anestesiar ratones

  1. Ketamina/xilacina
    Nota: La anestesia con ketamina/xilacina tiene una larga duración, que ofrece el tiempo suficiente para el investigador que es nuevo en esta técnica para completar el procedimiento de inoculación antes de que el ratón se despierta.
    1. Preparar 10 mL de solución inyectable combinando 8,5 mL de pharmaceutifcal grado PBS, 1 mL de 100 mg/mL ketamina solución (concentración final 10 mg/mL) y 0.5 mL de xilacina solución stock de 20 mg/mL (concentración final 10 mg/mL).
    2. Administrar 10 μL/g por inyección intraperitoneal de (IP) (por ejemplo, 250 μL de un ratón de 25 g).
    3. Aplicar ungüento oftálmico en los ojos de los ratones anestesiados con ketamina/xilacina porque sus ojos son propensos a daños durante largos periodos de la anestesia.
    4. Coloque el ratón en una jaula y vigilar hasta que despierta de la anestesia.
      Nota: El animal no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
  2. Isoflurano
    Nota: Ratones rápidamente despiertan de la anestesia isoflurano-inducida después de ser eliminado de la cámara de inducción, por lo que este método de anestesia sólo debe utilizarse después de ser competente en el procedimiento de inoculación.
    1. Colocar los ratones ingenuos en una cámara de tamaño adecuado de la inducción con flujo de oxígeno.
    2. Después de que la cámara está sellada, anestesiar los ratones utilizando un vaporizador de precisión para añadir isoflurano en el 4% (v/v) por menos de 5 min; la anestesia para confirmar eliminación de un ratón de la cámara de inducción y medir cuánto tarda en despertarse de la anestesia (~ 60 s).
      Nota: Tenga en cuenta que anestesia los tiempos pueden variar basado en las directrices y algunos animales pueden requerir más de 5 minutos para ser completamente anestesiada.
    3. Mantener la anestesia hasta 10 minutos ajustando la concentración de isoflurano al 2-3%; Si la duración total de la anestesia es > 15 minutos, aplicar pomada oftálmica en los ojos de los ratones anestesiados.
    4. Coloque el ratón en una jaula y vigilar hasta que despierta de la anestesia, como en el paso 2.1.

3. inocular/infectar ratones

  1. Suspender un ratón anestesiado, colgando de sus incisivos superiores sobre una cuerda fuerte y delgada (por ejemplo, seda dental) fijado a un objeto fijo a una altura aproximadamente dos veces del ratón longitud de cuerpo (p. ej., 20 cm) por encima de la superficie de funcionamiento (p. ej. Banco de laboratorio).
  2. Tire suavemente de la lengüeta del ratón de su boca con unas pinzas estériles, punta Roma. Transferencia de la lengua a un dedo enguantado estéril para evitar aplastamiento accidental de la lengua del ratón. Mantener la lengua fuera de la boca, permitiendo el acceso a la orofaringe y prevención de la ingestión del inóculo al lado.
  3. Mientras sujeta la lengua del ratón, colocar el inóculo de 50-μL (suspensión bacteriana) en la orofaringe utilizando una micropipeta; la orofaringe está situada en el cruce de la cavidad bucal y la faringe hacia la parte posterior de la boca.
    Nota: Es muy importante entregar sólo líquido transfiriendo a la primera parada de la micropipeta. El ratón dejará de respirar durante unos segundos cuando el inóculo se coloca en la orofaringe; Finalmente, aspiración reflexiva hará que el ratón inhalar la suspensión bacteriana, indicada por la crepitación característico de líquido en los pulmones, que resulta en la infección por neumonía.
  4. Si el inóculo no se coloca muy atrás lo suficiente como para bloquear la respiración normal, pellizcar las narinas con pinzas a la fuerza de aspiración reflexiva a través de la boca y posterior inhalación del inóculo.
  5. Después de la inoculación, soltar la lengua, quitar el mouse de la cadena de suspensión, colocarlo en una jaula y monitorear hasta que despierta de la anestesia, como en el paso 2.1.

4. monitoreo de la progresión de la enfermedad

Nota: Debido al sufrimiento de los animales, varios indicadores deben utilizarse para indicar cuando ratones moribundos; eutanasia se debe realizar esta determinación, de conformidad con un protocolo previamente aprobado de IACUC; diversos marcadores de la trata incluyen la temperatura corporal, pérdida de peso, aspecto, marcha y otros biomarcadores que pueden obtenerse de la sangre (por ejemplo, a través de iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.

  1. Eutanasia a los ratones según protocolo previamente aprobado de IACUC (p. ej., de CO2 seguido por dislocación cervical).
  2. Retire los pulmones de ratón sacrificaron mediante la reducción de la tráquea, la arteria pulmonar y vena pulmonar cerca de los pulmones.
    1. Microscopia
      1. Colocar los pulmones (o porción) en un molde de la muestra.
      2. Llenar el molde de la muestra con temperatura óptima de corte (O.C.T.) compuesto, sumergir completamente el tejido.
      3. Congelación de la muestra a-80 ° C.
      4. Enviar la muestra a un laboratorio de patología para la sección y montar en portaobjetos para microscopía.
    2. Carga bacteriana
      1. Pesa el tejido pulmonar con una balanza analítica.
      2. Transferir el tejido pulmonar al frasco cónico de 50 mL que contiene 2-5 mL de PBS estéril (dependiendo del tamaño del tejido).
      3. Homogeneizar el tejido pulmonar con un homogeneizador de tejidos.
      4. Realizar diluciones seriadas del homogeneizado de la PBS estéril para lograr aproximadamente 1.000 ufc/mL, basado en la carga bacteriana esperada en los pulmones.
        1. Por ejemplo, si se espera que 1 × 109 UFC/mg, realizar tres diluciones 1: 100: transferir 100 μL de homogenado a 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; se trata de la primera dilución 1: 100. Transferir 100 μL de la primera dilución 1: 100 en 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; Esta es la segunda dilución 1: 100. Transferir 100 μL de la dilución 1: 100 segundo a 9,9 mL de PBS y agitar con vortex; Esta es la dilución 1: 100 tercer y final.
        2. Si se desconoce la carga bacteriana en los pulmones, realizar una serie de diluciones para capturar el rango esperado.
      5. Añadir placa sobre agar estéril.
        1. Preparar caldo de soja tríptica el estéril (TSB) con las placas de agar (TSA): cosechadora 30 g de TSB, 15 g de agar, 1 L de agua, mezclar con un agitador magnético y calentar hasta que hierva a ~ 100 ° C durante 5 minutos dejar enfriar y luego autoclave en el ciclo líquido durante 15 minutos dejar enfriar ~ 55 ° C, la transferencia recién esterilizada 10 mL TSA a cajas Petri estériles y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Deje seca de sobremesa para 2-5 d o descubierto debajo de un gabinete de 10 min de bioseguridad.
        2. Transferir 100 μL de la dilución a una caja de Petri que contenga estéril TSA y repartidos en TSA con perlas de vidrio o esparcidor.
        3. Guarde la caja Petri durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada (es decir, que contiene un vaso de 1 L al descubierto llenada de agua de la incubadora de 37 ° C)
      6. Determinar homogeneizado de pulmón UFC/mL en placas de agar base (por ejemplo, 100 unidades formadoras de colonias en placa de TSA con 100 μL de dilución del tercer y último descrito sería 100 UFC/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).
      7. Calcular el tejido pulmonar de UFC/mg base dividiendo homogeneizado de pulmón UFC/mL de homogeneizado de tejido/mL de pulmón mg (por ejemplo, si muestra descrita anteriormente utilizado 100 mg de tejido pulmonar homogeneizado en 5 mL de PBS, luego 1 × 109 UFC/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).

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Resultados

Con cuidado, siguiendo el protocolo, pueden obtenerse fácilmente reproducibles y robustos de datos. Es importante apegarse estrictamente a la personalizada inóculo preparación protocolo para experimentos para ser comparado con una entre sí. También es importante manejar adecuadamente los ratones durante el proceso de infección. Asegúrese de colocar ratones en una cámara de anestesia desprovisto de isoflurano. Ratones se asuste si se colocan en una cámara que ha sido previamente llenada co...

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Discusión

Sin duda, los ratones no son seres humanos miniatura. Resultados obtenidos en modelos de ratón deben ser considerados en contexto y posteriormente interpretadas para su aplicación a seres humanos, basada en las diferencias y similitudes entre las dos especies6. También es importante elegir la cepa de ratón apropiado como algunos son más susceptibles a algunas infecciones que otros; lo mismo se aplica a la cepa del patógeno de elección16.

Es impre...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas en los institutos nacionales de salud [Grant número R01 AI117211 AI130060 R01, AI127954 R21 y R42 AI106375 a BS] y nos Food and Drug Administration [contrato HHSF223201710199C a BML].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarBD214530Combine con TSB para hacer perlas TSA
, vidrio de borosilicatoKimble135003Esterilizar horneando o esterilizando en autoclave antes de cada uso
Vaso de precipitados, 250 mLPyrex1003Utilizado durante la alícuota precisa de inóculos bacterianos concentrados
CentrífugaSorvallST 40RCapaz de 4.000 veces; g a 4 y grados;
C Cámara para anestesiaKent Scientific CorporationVetFlo-0720Tiene capacidad para hasta 5 ratones
Cryomold, tamaño intermedioSakura Tissue-Tek4566Moldes de muestras de vinilo desechables, 15 veces; 15&veces;
Hilo dentalOral-B37000469537Amarre al poste estable aprox. 6" por encima de la altura
PinzasVWR82027-440Se utiliza para extraer suavemente la lengua de la boca del ratón
Homogeneizador para tejido pulmonarAutoclave Omni InternationalTM125-115 antes delprimer uso; enjuague entre muestras
Isoflurano para anestesiaAbbott10015516Se pueden utilizar medicamentos alternativos; modificar el procedimiento en consecuencia
Cartucho iSTATAbbott03P79-25Hay varios cartuchos disponibles para satisfacer sus necesidades
Ketamina, 100 mg/mLWestern Medical Supply4165Diluir 1:10 en PBS a 1 mg/mL y combinar con xilacina a 1 mg/mL
Pomada para los ojosAkornLágrimas RenovadasEvite tocar el ojo con la punta del dispensador
Temperatura óptima de corte (O.C.T.) CompuestoFisher Scientific23-730-571Se utiliza para congelar muestras de pulmón a -80 &0 grados; C para preparar el corte de patologías
Placa de Petri VWR25384-302Poliestireno, desechable, esterilizado, 100 veces; 15 mm
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Corning21-031-CMPBS de Dulbecco sin calcio y magnesio Puntas de
pipeta, 200-μ LVWR10017-044Autoclave antes de usar
Pipeta, 200-μ LGilsonPipetman P200Autoclave y calibrar antes de usar
Dilector, Célula BacterianaBel-ArtF377360006Esterilizar horneando o esterilizando en autoclave antes de cada uso
Barra agitadora, magnética, 7,9 mm Diámetro y veces; 38,1 mm LongitudVWR58948-150Se utiliza para agitar inóculos bacterianos concentrados durante la alícuota
Placa de agitación, magnéticaCorningPC-620DSe utiliza para agitar inóculos bacterianos concentrados durante la alícuota
Caldo de soja tríptico (TSB)BD211822Combinar con agar para hacer TSA
Vialón, Cónico, Estéril, 50 mLCorning431720Se utiliza para preparar inóculos bacterianos
Viasco, Cónico, Estéril, 500 mLCorning431123Se utiliza para concentrar inóculos para preparar inóculos congelados
Vial criogénico, 2,0 mlCorning430659Se utiliza para el almacenamiento criogénico de inóculos bacterianos concentrados de
xilacina, 20 mg/mLAkornAnaSed inyectableDiluir 1:20 en PBS a 1 mg/mL y combinar con ketamina a 1 mg/mL
de 5 mm de la mesa

Referencias

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