Summary
هذا العمل يوفر طريقة لتصنيع الأنظمة الأساسية المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية وتطبيق polyacrylamide الجزئي المجالات الخرز الصغير للتضخيم بكر ميكروسفيري. طريقة PCR ميكروسفيري يجعل من الممكن الحصول على أمبليكونس الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل دون فصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل.
Abstract
ميكروفلويديكس المستندة إلى الحبرية تمكين موثوق بها إنتاج متجانسة الجزئي المجالات الخرز الصغير في قناة موائع جزيئية، وتوفير المساحة الخاضعة للرقابة ومورفولوجية ميكروسفيري التي تم الحصول عليها. ميكروسفيري كوبوليميريزيد مع تحقيقا أكريديتي-الحمض النووي كانت مختلقة بنجاح. يمكن استخدام أساليب مختلفة مثل اللامتكافئ بكر والهضم [ااكسونوكلس] وعزله على المغلفة ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز لتوليف الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (سدنا). ومع ذلك، هذه الأساليب لا يمكن أن كفاءة استخدام كميات كبيرة من ssDNA تنقية عالية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول ميكروسفيري-بكر بالتفصيل كيف سدنى يمكن أن تكون كفاءة تضخيم وفصلها عن دسدنا ببساطة عن طريق بيبيتينج من أنبوب تفاعل PCR. يمكن تطبيق تضخيم ssDNA الكواشف المحتملة لمصفوفة دنا والحمض النووي-سيليكس (تطور منهجي من يغاندس بتخصيب أسي) العمليات.
Introduction
واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (سدنى) على نطاق واسع واعتبرت كعنصر التعرف جزيئي (مخاطر) بسبب خصائصه الجوهرية للحمض النووي DNA التهجين1،2. يمكن أن يؤدي تطوير النظم الاصطناعية ssDNA للتطبيقات البيولوجية مثل الحمض النووي [ميكروارس]3، أوليجوثيرابيوتيكس، والتشخيص، والاستشعار الجزيئية متكاملة تستند إلى تفاعلات مكملة4،5.
وحتى الآن، جزيئات البوليمر ميكرومتر-مقياس تم بنجاح أثبتت استخدام أجهزة موائع جزيئية. العديد من التقنيات موائع جزيئية قد ثبت أن تكون قوية لإنتاج عالية متجانسة الجزئي المجالات الخرز الصغير على التدفق المستمر في6،البيئة microchannel7.
في دراسة لي et al. وذكر 8، منصة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية لتوليف موائع جزيئية كوبوليميريزابل اليغو-ميكروسفيري وسدنا التضخيم. منهاج موائع جزيئية تتكون من طبقتين PDMS (بولي دايمثيل سيلوكسان): جزء العلوي مع شبكة قناة موائع جزيئية لتوليد ميكروسفيري ومن أسفل جزء مسطح. وهذه تتألف من ثلاثة أنواع من قنوات فلويديك PDMS: 1) تدفق تركز القناة لتوليد الحبرية و 2) قناة السربنتين لخلط الحلين 3) قناة بلمرة متسلسل للتصلب ميكروسفيري. حالما يتم إدخال تدفقين قابلة للامتزاج في قناة فلويديك PDMS واحدة، يمكن أن يجبر التدفقات من خلال هيكل الفوهة الضيقة. سلوك تدفق مثل الهندسة القناة، ومعدل التدفق، واللزوجة تؤثر على حجم ومورفولوجية ميكروسفيري. ولذلك، يمكن تقسيم التيار الرئيسي السائل microscale مونوسفيريس9،10.
هنا، يتم توفيرها بروتوكول بكر ميكروسفيري مفصلة لتضخيم سدنى. أولاً، يتم وصف عملية تصميم الأجهزة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية. ثم، هو شرح الطريقة في بولياكريلاميدي التي يمكن فونكتيوناليزيد الجزئي المجالات الخرز الصغير مع قالب الحمض النووي عشوائية بطريقة متكاملة. وأخيراً، يرد بروتوكول ميكروسفيري-بكر لتضخيم ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تصنيع منصة موائع جزيئية PDMS
- إعداد 20 مل من سائل PDMS prepolymer بخلط البوليمر الأساسي ومحفِّز في حجم بنسبة 10:1. من أجل 10 مل سائل PDMS على العفن سو-8 إعداد على رقاقة سيليكون في الجزء العلوي من الشبكة موائع جزيئية. الجزء المسطح السفلي، من أجل نفس الحجم من السائل PDMS على رقاقة السيليكون دون بنية العفن.
ملاحظة: الشبكة موائع جزيئية مصممة في برنامج CAD وتحويلها بعد ذلك إلى النبائط بغية اختﻻق رئيسي باستخدام عملية الطباعة التصويرية النموذجية (انظر الأرقام تكميلية). هذا الرئيسي يتكون من العفن سو-8 سلبي مقاوم الضوء على رقاقة السيليكون11. - ضع اثنين رقائق السليكون مغلفة بسائل prepolymer PDMS على صفيحة وعلاج عند 75 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- يدوياً تقشر طبقة PDMS شُفي من العفن سو-8. قم بمحاذاة قطرها 1.5 مم جولة أداة ثقب اللكم إلى ميناء النفط على الشبكة موائع جزيئية المنسوخة نسخاً متماثلاً لربط قنوات تدفق حجم ميكرون مع عينات السوائل الماكرو. لكمه من أصل من خلال الثقب يدوياً.
- كرر هذا اللكم العملية ثلاث مرات لتشكيل الحلول اثنين والمنفذ منفذ.
- إجراء المعالجة السطحية ماء على كل من العلوي والسفلي PDMS الطبقات باستخدام المفاوض كورونا اليد12 لعدة ثوان لكل عينة.
- المكدس اثنين البلازما-معاملة طبقات PDMS والحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام لوحة الساخن لعملية الربط PDMS إلى PDMS. الإمداد الماء المضغوط استخدام مضخة الحقن إلى ثلاثة مداخل الموانئ للترابط الهيكلي واختبار التسرب من الجهاز ملفقة.
2-إنتاج Polyacrylamide اليغو-الجزئي المجالات الخرز الصغير
- تعد حبة-المخلوط بالتفصيل في الجدول 1.
- دوامة والطرد المركزي أكريديتي سدنى القياسية بإيجاز المسمى acrylamide:bis (19:1) حل الأسهم والتحقيق (Ap، 100 ميكرومتر).
- إعداد الحل أنا بخلط 25 ميكروليتر من الاكريلاميد 40% مكررا الحل 10 ميكروليتر من سدنى (أكريديتي التحقيق)، 10 ميكروليتر من المخزن المؤقت x TBE 5 (1.1 "م تريس"؛ 25 مم يدتا بورات 900 مم) و 5 ميكروليتر من المياه. إعداد الحل الثاني مع 50 ميكروليتر من فوق كبريتات الأمونيوم 20%.
- إعداد اثنين المحاقن منفردة مليئة بالحل الأول والحل الثاني، وجبل لهم على مضخة لإدخال التدفقات الحل إلى منصة موائع جزيئية. إعداد مختلطة مع 0.4% زيت معدني تيميد للتجميد السطحية ميكروسفيري.
ملاحظة: تيميد المعروف جيدا كعامل استقرار الحرة الراديكالية. الجذور الحرة يمكن تسريع معدل تكوين البوليمر مع فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) من أجل تحفيز البلمرة الاكريلاميد. - ملء زجاجة زجاج مع 4 مل الزيت المعدني لتوليد تدفق مستمر.
- إدراج أنبوبين لميناءين في غطاء الزجاجة الزجاج كخزان موائع جزيئية: منفذ هوائي لتطبيق الهواء المضغوط في زجاجة زجاج من ضاغط هواء وميناء السوائل لتوريد الزيت المضغوط لشبكة القناة الصغيرة من الزجاجة. قم بتوصيل أنابيب بين زجاجة زجاجية وميناء النفط في الجهاز موائع جزيئية.
- قم بتوصيل الأنابيب منافذ الحل اثنين في الجهاز موائع جزيئية بغية توفير الحلول اثنين من مضخات الحقن. إدراج أنابيب إلى المنفذ منفذ من أجل نقل ميكروسفيري التي تم إنشاؤها في الكأس.
- تعيين معدل تدفق المضخة حقنه إلى 0.4-0.7 مل/حاء ضبط الهواء المضغوط ضغط الضاغط استخدام منظم (82-116 كيلو باسكال). تعيين سرعة الدوران (500 لفة في الدقيقة) على شريط مغناطيسي محرض في الكأس الزجاج على طبق ساخن. تشغيل المضخة المحاقن وإمداد الهواء المضغوط إنشاؤها بواسطة ضاغط خارجي إلى القمقم الزجاج باستخدام عنصر التحكم صمام الكهرومغناطيسي13ON/OFF.
- نلاحظ تكوين الجزئي المجالات الخرز الصغير في الهندسة تركز تدفق والتجميد الجزئي المجالات الخرز الصغير الذي تم إنشاؤه في الكأس الزجاج مجهر رقمي.
ملاحظة: سرعة الإنتاج وحجم ميكروسفيري تعتمد على فلووراتي للحلول والضغوط التي مورست لتدفق الزيت المعدني (الجدول 2).
3-أداء Polyacrylamide اليغو-الجزئي المجالات الخرز الصغير بحساب
- للتقدير الكمي هيموسيتوميتير، تأخذ كمية صغيرة (حوالي 100 ميكروليتر) من المحلول polyacrylamide اليغو-الجزئي المجالات الخرز الصغير والمكان في هيموسيتوميتير الزجاج، وملء بلطف بتعليق ميكروسفيري أعلى البئر دائرة العد.
ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل، انظر http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - استخدام عداد حصيلة مجهر واليد إلى الاعتماد الجزئي المجالات الخرز الصغير في مجموعة واحدة من الساحات 16. ثم نقل هيموسيتوميتير إلى المجموعة التالية من الدائرة والقيام بالعد حتى يتم عد كل أربع مجموعات من زوايا 16.
- تحديد عدد ميكروسفيري المتوسط وحساب عدد الجزئي المجالات الخرز الصغير في تعليق حبة الأصلي.
- نقل 100 ميكروليتر من الجزئي المجالات الخرز الصغير إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إزالة المادة طافية عن طريق سينتريفوجينج (400 س ز) لطيف وبيبيتينج.
4-إجراء التهجين الحمض النووي على سطح أوليجوميكروسفيري بولياكريلاميدي
ملاحظة: مطابقة الحمض النووي تحقيقا مع 5 '--NH2-مجموعة بدلاً من تعديل 5'--أكريتيدي هو تضاف إلى الحل الأول واختبارها للجزئي المجالات الخرز الصغير المحتوية على Ap بالتوازي. وتظهر نتائج التهجين الحمض النووي في الشكل 2. يجب وضع حل المسابر (cAp) المسمى Cy3 اليغنوكليوتيد مكملة في غرفة مظلمة.
- ريسوسبيند Cy3-كاب 100 ميكروليتر من 1xTE المخزن المؤقت باستخدام (المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات: 10 ملم تريس و 1μM يدتا، pH 8.0) بغية تحقيق تركيز نهائي من 100 ميكرومتر. على سبيل المثال، ريسوسبيند بمول 1 من كاب في 100 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات والنقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مغطاة برقائق الألومنيوم.
ملاحظة: لتسلسل حبلا، انظر الجدول 3. - إضافة 100 ميكرومتر من كاب Cy3 إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل تحتوي على كوبوليميريزيد Ap الجزئي المجالات الخرز الصغير.
- اضغط الأنبوبة عدة مرات لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام ح 1.
- تجاهل المادة طافية وإزالة المخزن المؤقت المتبقية عن طريق بيبيتينج.
- شطف ثلاث مرات مع 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
- ريسوسبيند الجزئي المجالات الخرز الصغير بلطف التنصت على أنبوب ميكروسينتريفوجي. ثم كرر الخطوة 4، 4.
- مكان الجزئي المجالات الخرز الصغير على الشريحة الزجاجية (75 مم × 50 مم) وتغطي برقائق الألومنيوم قبل التصوير.
5-غير المتناظر PCR لتضخيم ssDNA
- إعداد مزيج كاشف PCR غير المتناظر لتضخيم سدنا يتم تحليلها. ذوبان الجليد الكواشف في الجدول 4 على الجليد. لا تحتفظ بإنزيم بوليميراز بوليميراز (50 ش/ميليلتر) على الجليد، ولكن بدلاً من تخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
- بلطف من دوامة كل الكواشف والطرد المركزي بإيجاز ثم أنابيب في 10,000 ز x 10 s.
- الجمع بين جميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 4-
- وضع العينات في ثيرموسيكلير وبدء PCR غير المتماثلة الظروف التالية: 25 دورات (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 52 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 s)، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، عقد في 4 درجات مئوية.
6-ميكروسفيري-بكر لتضخيم ssDNA
ملاحظة: هذا المقطع يصف البروتوكول لتضخيم ssDNA في أنبوب تفاعل PCR. ردود فعل ميكروسفيري-بكر أجريت في 50 ميكروليتر من حجم رد الفعل. وترد في الجدول 5تسلسل التفصيلية التي تستخدم لتضخيم ssDNA. في هذه الحالة، يمكن أن يصلب Ap على سطح الجزئي المجالات الخرز الصغير بقوالب الحمض النووي عشوائية بطريقة متكاملة. هذا خطوة هامة جداً لإنتاج خيوط الحمض النووي التكميلية (العقاقير حبلا الحمض النووي، الشكل 3). الحمض النووي الموسع هو استخدامه كقالب للتضخيم بكر ميكروسفيري.
- إعداد مزيج كاشف ميكروسفيري-PCR. ذوبان الجليد الكواشف في الجدول 6 على الجليد؛ ومع ذلك، لا تحتفظ بإنزيم بوليميراز بوليميراز على الجليد. قم بتخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
- بلطف من دوامة كل الكواشف والطرد المركزي بإيجاز ثم أنابيب في 10,000 ز x 10 s.
- الحصول على حوالي ~ 25 الجزئي المجالات الخرز الصغير عن طريق العد المجهري.
ملاحظة: يتم احتساب عدد الجزئي المجالات الخرز الصغير في أنبوب رد فعل واحد استخدام مجهر خفيفة مع 40 X التكبير. وتستخدم حوالي 25 ~ الجزئي المجالات الخرز الصغير للتضخيم بكر ميكروسفيري. معلومات أكثر تفصيلاً في الخطوة 3. - الجمع بين جميع الكواشف كما هو موضح في الجدول 6-
- وضع العينات في ثيرموسيكلير وبدء PCR غير المتماثلة الظروف التالية: 25 دورات (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 52 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 s)، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، عقد في 4 درجات مئوية.
- إضافة 8 ميكروليتر من 6 × تحميل المخزن المؤقت التضخيم التالية، وتحميل 15 ميكروليتر من كل عينة إلى 2% [اغروس] هلام. ثم، تنفيذ التفريد في 100 الخامس لمدة 35 دقيقة في 1 x TAE (تريس-خلات-يدتا، 40 مم خلات تريس، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.2) المخزن المؤقت.
7-[كنفوكل] مجهرية اقتناء
ملاحظة: يتم تصويرها نتائج التهجين مسبار الحمض النووي ميكروسفيري تحت مجهر [كنفوكل]. يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام إيماجيج.
- إصلاح المهجن الجزئي المجالات الخرز الصغير إلى مرحلة المجهر في حامل.
- حدد الليزر (ليزر الهيليوم/نيون، 543 خط nm) وقم بتشغيله في السيطرة على الليزر.
- حدد العدسة الهدف في مراقبة المجهر.
- حدد عامل التصفية المطلوب Cy3 والقناة في تكوين عنصر التحكم.
- بدء التجربة ومراقبة العينة. إعدادات للمجهر [كنفوكل] ملخصة في الجدول 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
منهاج موائع جزيئية البوليمرية ملفقة على أساس الحبرية يتكون من طبقتين PDMS (الشكل 1a). وتستخدم ثلاثة أنواع من شبكات قناة موائع جزيئية لتوليد الجزئي المجالات الخرز الصغير: الهندسة 1) تدفق التركيز كما هو مبين في الشكل 1 باءو 2) قناة السربنتين لخلط الحل الأول والحل الثاني 3) قناة بلمرة ميكروسفيري التصلب. وكان ارتفاع كل القنوات 60 ميكرومتر. وكانت طول القناة لخلط والبلمره 74.35 و 94.45 ملم، على التوالي. عرض microchannel لتدفقات السوائل قابلة للامتزاج اثنين وواحد لتدفق الزيت المعدني كانت 100 ميكرومتر و 200 ميكرومتر، على التوالي. وكان هيكل الفوهة المستخدمة في تكوين ميكروسفيري 50 ميكرومتر طول وعرض ميكرو 25. زاوية هيكل الناشر كان 37°. نظام تحكم هوائي المستندة إلى مختبر للتدفق المستمر للزيوت المعدنية والمحاقن مضختين لتدفق الحل (الشكل 1 ج) تستخدم لتوليد الجزئي المجالات الخرز الصغير في منهاج موائع جزيئية (الشكل 1 د). سرعة الإنتاج الجزئي المجالات الخرز الصغير كان حوالي 30 الجزئي المجالات الخرز الصغير في الثانية عندما كان معدل التدفق للحلول والضغط التطبيقية في 0.6 مل/ساعة و 108 الجيش الشعبي الكوري، على التوالي (الجدول 2). قطره في القناة الصغيرة هو 78.7 ± 2.5 م. يمكن التلاعب توليف على التدفق الجزئي المجالات الخرز الصغير بنجاح باستخدام جهاز موائع جزيئية. وقيست أحجام حبة بعد التورم. وكان متوسط قطر الجزئي الناجم عن ذلك المجالات الخرز الصغير 150.4 ± م 12.8. وكانت الاختلافات الحجم حوالي 8.5 في المائة. الجزئي المجالات الخرز الصغير الخضوع تورم في الماء، ونتجت عن ذلك زيادة هائلة حجم.
يمكن أن تختلف الخاصية كوبوليميريزابل من ميكروسفيري. نحن إدراج تحقيق 5 ' أكريديتي-الحمض النووي في حل ميكروسفيري (الحل الأول، انظر الجدول 1). عقب البلمرة المشارك، هو المسمى مسبار الحمض النووي تكميلية مع صبغة الفلورسنت، Cy3، في درجة حرارة الغرفة ل 1 h. كونفوكال المجهري يمكن استخدامها لإثبات توليف أوليجوميكروسفيريس كوبوليميريزابل التهجين النحو الوظيفي وكذلك على سطح الجزئي المجالات الخرز الصغير. الصور الفلورية ميكروسفيري مبينة في الشكل 2. إذا هي فونكتيوناليزيد الجزئي المجالات الخرز الصغير بشكل صحيح مع المسبار 5 ' أكريديتي-الحمض النووي، ينبغي أن يؤدي في تغطية النشاط الفلورسنت على السطح خلال التجربة التهجين. إذا لم يحدث كوبوليميريزيشن بشكل صحيح، سوف يحمل الصورة الضوئية ميكروسفيري التلوث الداخلي داخل الجزئي المجالات الخرز الصغير. كما هو مبين في الشكل 2، ليس هناك تدخل من اتجاه عشوائي الداخلية. هذه النتيجة سمح لنا بإجراء العرض التقديمي مسبار الحمض النووي في الترتيب (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد وبكر ميكروسفيري. تجدر الإشارة إلى أن الحمض النووي مطابق التحقيق مع 5 '--NH2-لا كوبوليميريزي المجموعة بدلاً من تعديل 5'-أكريتيدي أثناء التوليف على تدفق ميكروسفيري8.
عند العمل مع الجزئي المجالات الخرز الصغير، معالجة سطح ثلاثي الأبعاد مع الحمض النووي اليغو-تحقيق هو كثير أسرع عملية14. ولذلك، منصة توليف ميكروسفيري على تدفق يمكن أن توفر أداة للتضخيم ssDNA وتنقية، كما هو مبين في الشكل 3. القالب الشعور المضادة الحمض النووي (-، قالب التكميلية) يمكن توسيعها بإضافة عشوائية الدنا القالب (+، القالب). وفي هذه الحالة، توفر في البداية كوبوليميريزيد 5 '--وكالة اسوشييتد برس نهاية 3'--يا بلمرة الحمض النووي بعد الصلب لقالب مكملة لها (76 nt). يمكن أن يؤديها بكر ميكروسفيري في microtube بكر واحدة استخدام فونكتيوناليزيد الجزئي المجالات الخرز الصغير وقالب الحمض النووي عشوائي وكتاب علامة إلى الأمام. من أجل التمييز بين أمبليكونس سدنا ما ينجم عن ذلك من عشوائية الدنا القالب (+ قالب، 76 nt)، التمهيدي إلى الأمام قد علامة النوكليوتيدات 24 إضافية. إذا لم يكن لديه الدليل التمهيدي إلى الأمام تسلسل علامة إضافية، من الصعب جداً على الاعتراف بين أمبليكونس سدنى وقالب الحمض النووي عشوائية أولية.
وأجريت تجربة بكر غير متماثل. كنا قادرين على مراقبة الملوثات دسدنا كما هو مبين في الشكل 4. وفي معظم الحالات، من الضروري عزل ssDNA استخدام المغلفة ستريبتافيدين المغناطيسي الخرز والهضم [ااكسونوكلس]. ومع ذلك، يجعل ميكروسفيري-بكر الاستخدام الكفء لكتاب واحد (العلامة إلى الأمام التمهيدي) تتراكم سدنى في المرحلة مائي. ومن المتوقع أن الملوثات دسدنا سوف نعلق على سطح الجزئي المجالات الخرز الصغير. ولذلك، يمكن الحصول على أمبليكونس سدنى من خلال بيبيتينج دون الحاجة إلى استخدام الطرد المركزي. وقد تجلى ssDNA الناتجة مقارنتها على علامات حجم الاصطناعية (76 nt ssDNA و 100 nt ssDNA) عن طريق التحليل الكهربي جل.
رقم 1: منهاج موائع جزيئية. (أ) (ب) توسيع العرض للهندسة تركز تدفق، (ج) الإعداد التجريبية، منصة موائع جزيئية ملفقة، و (د) القبض على الصور التي تبين استمرار توليد الجزئي المجالات الخرز الصغير. 1: هيكل الصغير قناة لتدفق تركز الهندسة، 2: لخلط الحلول، 3: للتصلب ميكروسفيري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: قراءات الفلورسنت من التهجين الحمض النووي على السطح من الجزئي المجالات الخرز الصغير- 5 '--أكريديتي--تعديل الحمض النووي المسابر (Ap) كانت قادرة على التهجين مع Cy3 تكميلية المسمى الحمض النووي المسابر (cAp). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التوضيح البروتوكول بكر ميكروسفيري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مقارنة بين بكر غير المتناظر التقليدية وبكر ميكروسفيري. م؛ علامة سدنى (76mer 100mer)، ولين 1؛ غير المتناظر بكر، لين 2؛ ميكروبيدس--PCR. طبع بإذن من العمل السابق8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | وحدة التخزين في مزيج (μL) | التركيز النهائي | |
| الحل أنا | 40% من محلول Acrylamide:bis (19:1) | 25 | 10 ٪ |
| 100 ميكرومتر أكريديتي مسبار (Ap، 5 '--أكريديتي--(تتتتتت، تسلسل رابط) أغا وافق به CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ميكرومتر | |
| 5 X TBE العازلة (تريس-قاعدة-يدتا) | 10 | 0.5 X | |
| المياه | 5 | - | |
| الحل الثاني | فوق كبريتات الأمونيوم 20% | 50 | 10 ٪ |
| الحل الثالث | تيميد (N،N، ′ن،ن′-تيتراميثيليثيلينيدياميني) | 8 | 0.40 في المائة |
| الزيوت المعدنية | 1000 | - | |
الجدول 1. مكونات مزيج كاشف لتوليف ميكروسفيري بولياكريلاميدي في التدفق.
| ظروف التشغيل | ميكروسفيري سرعة الإنتاج |
|
| فلووراتي الحل | ضغط الزيت | |
| (مل/ساعة) | (الكوري) | (/ثانية) |
| 0.4 | 82 | 7.1 |
| 0.5 | 94 | 13.3 بوصة |
| 0.6 | 108 | 28.9 |
| 0.7 | 116 | 36.5 |
الجدول 2. موجز للظروف التشغيلية والمنتجة ميكروسفيري.
| مسبار الحمض النووي | تسلسل |
| Cy3 المسمى مسبار اليغنوكليوتيد التكميلية (cAp) | 5-Cy3-أجاتاجتاجتجكاتكت-3 ' |
| العلامة (24 أول nt)-إلى الأمام التمهيدي | 5-الكبد صرفة ACG CAC قانون AGG تأت هفوة آتا التقييم القطري المشترك بنا TCA تأت توري-3 ' |
الجدول 3. تسلسل المعلومات المسابر الحمض النووي.
| كاشف | وحدة التخزين لرد فعل س 1 (μL) | التركيز النهائي |
| قالب الحمض النووي عشوائي | 1 | 1 نانوغرام/ميكروليتر |
| التمهيدي إلى الأمام العلامة | 1 | 0.4 ميكرومتر |
| عكس التمهيدي | 1 | ميكرومترات 0.02 |
| 10 × بوليميراز المخزن المؤقت | 5 | 1 X |
| 10 ملم دنتب | 4 | 2.5 مم |
| ت تق (1000U) | 0.2 | 1 U |
| المياه | 37.8 | - |
| المجموع | 50 | - |
الجدول 4. غير المتناظر PCR كاشف مزيج المكونات في ل 20 رد فعل.
| قالب | التسلسل | طول (nt) |
| قالب الحمض النووي عشوائي | 5-آتا التقييم القطري المشترك بنا تأت العلامة أغا TCA توري (تسلسل عشوائي، مير 40) ﻷعمالهم دايمنشن TCT الجهاز المركزي للمحاسبات 3 ' | 76 |
| التمهيدي إلى الأمام العلامة (العلامة-F) | 5-الكبد صرفة ACG CAC قانون AGG تأت هفوة آتا التقييم القطري المشترك بنا TCA تأت توري-3 ' | 42 |
| عكس التمهيدي | 5-أغا وافق به CAC نقل واكتساب التكنولوجيا كبار المستشارين التقنيين TCT-3 ' | 18 |
الجدول 5. معلومات تسلسل لبكر ميكروسفيري.
| كاشف | وحدة التخزين لرد فعل س 1 (μL) | التركيز النهائي |
| Ap-الجزئي المجالات الخرز الصغير | الجزئي المجالات الخرز الصغير ~ 25 | - |
| قالب الحمض النووي عشوائي | 1 | 1 نانوغرام/ميكروليتر |
| التمهيدي إلى الأمام العلامة | 1 | 0.4 ميكرومتر |
| 10 × بوليميراز المخزن المؤقت | 5 | 1 X |
| دنتب 10 ملم | 4 | 2.5 مم |
| ت تق (1000U) | 0.2 | 1 U |
| المياه | 37.8 | - |
| المجموع | 50 | - |
الجدول 6. كاشف ميكروسفيري-بكر خلط المكونات في رد 50 لتر.
| وضع الالتقاط بالماسح | الطائرة |
| تحجيم | X: 2.49 ميكرومترات، ص: 2.49 ميكرومتر |
| حجم مكدس | X: 1272.79 ميكرومترات، ص: 1272.79 ميكرو |
| مسح التكبير | 0.7 |
| والهدف | المفوضية الأوروبية خطة-نيوفلوار 10 ×/0.3 M27 |
| في المتوسط | 1 |
| الثقب | Ch2: 104 أم |
| عوامل التصفية | Ch3: ليرة لبنانية 420 |
| شق شعاع | MBS: HFT 488/543، DBS1: مرآة، DBS2: NFT 515، FW1: لا شيء |
| الطول الموجي | 543 nm 100، 0 ٪ |
الجدول 7. إعدادات للمجهر [كنفوكل].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ملوثات دسدنا قضية رئيسية في التضخيم ssDNA. ما زال من الصعب على تقليل التضخيم دسدنا التقليدية غير المتناظر PCR التضخيم15. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من التحسينات التقنية لتوليد سدنا مكنتنا من زيادة كفاءة إنتاجية عينة، العزلة سدنا ما زالت إشكالية نظراً لارتفاع التكاليف وغلة تنقية غير مكتملة.
بكر غير المتناظر واحدة من أصعب الطرق المستخدمة عند العمل مع سدنى. وينطبق هذا الأسلوب كميات غير متكافئة من التمهيدي(مثلاً نسبة 20:1) من أجل توليد كميات كبيرة من سدنا. ومع ذلك، من الصعب جداً تحسين كل التضخيم كرد فعل تسفر عن سدنى. وبالتالي، يجب القضاء على المنتجات الثانوية (dsDNA) من المحصلات4.
من أجل توليد ssDNA دون خطوات انفصال إضافية، قمنا بإصدار polyacrylamide الجزئي المجالات الخرز الصغير لفضح المسابير الحمض النووي استناداً إلى أسلوب كوبوليميريزيشن أكريديتي. وكان تكييف طريقة الحجز الحمض النووي لدينا بسهولة باستخدام منصة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية. وأنتجت بنجاح أوليجوميكروسفيريس كوبوليميريزيد بعد أقطار microscale. ونتيجة لذلك، استخدمت ميكروسفيري-بكر لتضخيم سدنا في رد فعل أنبوب واحد. وبطبيعة الحال، التكيف مع هذا الإجراء للتجارب الأخرى بكر، يشيع التعديلات اللازمة (مثلاً، تغيير في دورة التضخيم، الصلب درجة الحرارة، وتسلسل قالب) مطلوبة. وفي الختام، ميكروسفيري-PCR وردت تفاصيلها هنا، جعلها متاحة للتنمية الحشري وتسلسل الحمض النووي وتحليل الحمض النووي ميكرواري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
هذه الدراسة معتمد من قبل مشروع بعنوان "التعاونية برنامج بحوث للعلوم الزراعية وتطوير التكنولوجيا (المشروع رقم PJ0011642) "بتمويل من" إدارة التنمية الريفية "، جمهورية كوريا. وأيد هذا البحث أيضا جزئيا على منحة (جبهة الخلاص الوطني-2017R1A2B4012253) برنامج بحوث العلوم الأساسية عبر الوطنية بحوث مؤسسة (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل، جمهورية كوريا. كما أيده هذا البحث منحة (N0000717) لبرنامج التعليم الإبداعي و "التقارب الصناعية" الممولة من وزارة التجارة والصناعة والطاقة، وجمهورية كوريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al.
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
