Summary
Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.
Abstract
Basato su goccia microfluidica consentono la produzione affidabile di microsfere omogenee nel canale di microfluidica, fornendo controllata, dimensioni e morfologia delle microsfere ottenute. Una microsfera copolimerizzato con una sonda di DNA coprocoltura con successo è stato fabbricato. Diversi metodi quali la PCR asimmetrica, digestione esonucleasi e isolamento su biglie magnetiche rivestite con streptavidina possono essere utilizzati per sintetizzare DNA a singola elica (ssDNA). Tuttavia, questi metodi non possono utilizzare in modo efficiente grandi quantità di altamente purificato ssDNA. Qui, descriviamo un protocollo di PCR di microsfere dettagliare come ssDNA può essere amplificato in modo efficiente e separato da dsDNA semplicemente pipettando da una provetta di reazione di PCR. L'amplificazione di ssDNA può essere applicato come potenziali reagenti per i microarray del DNA e DNA-SELEX (sistematica evoluzione di ligandi di arricchimento esponenziale) processi.
Introduction
DNA a singola elica (ssDNA) è stato ampiamente considerato come un elemento di riconoscimento molecolare (MRE) grazie alle sue proprietà intrinseche per l'ibridazione DNA-DNA1,2. Lo sviluppo di sistemi sintetici ssDNA può portare ad applicazioni biologiche quali DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostica e molecolare di rilevamento integrato basato su interazioni complementari4,5.
Fin qui, le particelle di polimero di scala micrometrica sono state dimostrate con successo utilizzando dispositivi microfluidici. Diverse tecniche di microfluidica hanno dimostrati di essere potente per la produzione di microsfere altamente omogenee il flusso continuo in ambiente microchannel6,7.
Nello studio di Lee et al. 8, una piattaforma di microfluidica gocciolina-basato per la sintesi di microfluidica di amplificazione oligo-microsfere e ssDNA qui è stato segnalato. La piattaforma microfluidica è costituito da due strati PDMS (polidimetilsilossano): una parte superiore con una rete di canali microfluidici per la generazione di microsfere e un fondo piatto a parte. Questi consistono di tre tipi di canali fluidici PDMS: 1) un flusso di canale per la generazione di goccia, 2) un canale serpeggiante per la miscelazione di due soluzioni e 3) un canale di polimerizzazione sequenziale per solidificazione di microsfere di messa a fuoco. Una volta due flussi immiscibili vengono introdotti in un singolo canale fluidico PDMS, i flussi possono essere forzati attraverso la struttura di orifizio stretto. I comportamenti di flusso come geometria del canale, portata e viscosità influiscono sulla dimensione e la morfologia delle microsfere. Pertanto, il principale flusso di liquido può essere diviso in Microscala monospheres9,10.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato microsfera-PCR per l'amplificazione di ssDNA. In primo luogo, un processo di progettazione di dispositivi microfluidici basati su goccia è descritto. Quindi, è spiegato il modo in cui poliacrilammide microsfere possono essere funzionalizzate con modello casuale di DNA in maniera complementare. Infine, un protocollo di microsfere-PCR per amplificare ssDNA è mostrato.
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Protocol
1. realizzazione di una piattaforma di Microfluidic PDMS
- Preparare 20 mL di liquido prepolimero PDMS con polimero di base e catalizzatore in un rapporto di volume di 10:1. Versare 10 mL del liquido PDMS su uno stampo SU-8 preparato su un wafer di silicio per la parte superiore della rete microfluidica. Per la parte inferiore piatta, versare lo stesso volume di liquido PDMS sul wafer di silicio senza una struttura di stampo.
Nota: La rete di microfluidica è progettata in un programma CAD e poi convertita in un photomask al fine di fabbricare un master utilizzando il processo di fotolitografia tipico (vedere Figure supplementari). Questo master è composto lo stampo di SU-8 photoresist negativo sui wafer di silicio11. - Posizionare due wafer di silicio rivestito con liquido prepolimero PDMS sulla piastra calda e della cura a 75 ° C per 30 min.
- Manualmente rimuovere lo strato PDMS curato dallo stampo SU-8. Allineare un diametro di 1,5 mm tondo attrezzo di perforazione del foro per il porto di olio sulla rete replicata microfluidici per l'interfaccia dei canali di flusso micron-scala con i campioni di liquido macro. Pugno l'attraverso-foro manualmente.
- Ripetere questo processo tre volte per la formazione delle due soluzioni e la porta di uscita di punzonatura.
- Eseguire trattamento superficiale idrofilico sulla tomaia e strati di PDMS fondo utilizzando un palmare corona treater12 per alcuni secondi per campione.
- Stack due trattati del plasma PDMS strati e calore a 90 ° C per 30 minuti utilizzando una piastra calda per il processo di incollaggio PDMS-a-PDMS. Fornire l'acqua pressurizzata utilizzando la pompa a siringa in tre porte di ingresso per l'incollaggio strutturale e la prova di perdita del dispositivo fabbricato.
2. produzione di poliacrilammide Oligo-microsfere
- Preparare la miscela di microsfere indicata nella tabella 1.
- Vortice e brevemente centrifuga la coprocoltura standard ssDNA etichettati sonda (Ap, 100 μM) e acrylamide:bis (19:1) soluzione di riserva.
- Preparare soluzione ho mescolando 25 μL di 40% di acrilammide bis soluzione, 10 μL di ssDNA (coprocoltura sonda), 10 μL di tampone di x TBE 5 (1,1 M Tris; borato di 900 mM e 25 mM EDTA) e 5 μL di acqua. Preparare soluzione II con 50 μL di persolfato dell'ammonio 20%.
- Preparare due siringhe individualmente riempito con soluzione soluzione II e io e montarli sulla pompa per introdurre flussi di soluzione nella piattaforma microfluidica. Preparare l'olio minerale mescolato con 0,4% TEMED per solidificazione superficiale delle microsfere.
Nota: TEMED è ben noto come stabilizzatore del radicale libero. I radicali liberi possono accelerare il tasso di formazione del polimero con ammonio persolfato (APS) al fine di catalizzare la polimerizzazione di acrilammide. - Riempire una bottiglia di vetro con 4 mL di olio minerale per generare un flusso continuo.
- Inserire due tubi a due porte nel tappo della bottiglia di vetro come un serbatoio di microfluidica: il raccordo pneumatico per l'applicazione dell'aria compressa in bottiglia di vetro dal compressore d'aria e la porta di fluido per fornire l'olio pressurizzato alla rete micro canale dalla bottiglia di vetro. Collegare i tubi tra la bottiglia di vetro e la porta di olio nel dispositivo microfluidico.
- Collegare i tubi ai porti due soluzione nel dispositivo microfluidico al fine di fornire le due soluzioni dalle pompe a siringa. Inserire tubi di mandata al fine di trasferire la microsfera generato nel becher.
- Impostare la portata della pompa a siringa a 0,4 - 0,7 mL/h. regolare aria compressa la pressione del compressore utilizzando un regolatore (82-116 kPa). Impostare la velocità di rotazione (500 giri/min) della barra di agitatore magnetico in bicchiere di vetro su un piatto caldo. Azionare la pompa a siringa e fornire l'aria compressa generata da un compressore esterno nella bottiglia di vetro utilizzando il controllo ON/OFF di una valvola elettromagnetica13.
- Osservare la formazione di microsfere nella geometria del flusso-messa a fuoco e solidificazione delle microsfere generate in bicchiere di vetro con un microscopio digitale.
Nota: La dimensione e velocità di produzione delle microsfere dipendono la portata delle soluzioni e la pressione applicata per il flusso di olio minerale (tabella 2).
3. esecuzione di poliacrilammide Oligo-microsfere conta
- Per la quantificazione di un emocitometro, prendete una piccola quantità (circa 100 µ l) di soluzione acquosa di poliacrilammide oligo-microsfere e posto sul vetro emocitometro e riempire delicatamente la sospensione di microsfere fino al pozzo della camera del conteggio.
Nota: Per ulteriori dettagli, vedere http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer. - Utilizzare un microscopio e mano tally contatore per contare le microsfere in un unico set di 16 quadrati. Spostare l'emocitometro al gruppo successivo della camera, quindi portare il conteggio fino a quando tutte le quattro serie di 16 angoli sono contati.
- Determinare il numero medio di microsfere e calcolare il numero delle microsfere in sospensione originale perlina.
- Trasferire 100 μL di microsfere a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Rimuovere il sopranatante mediante centrifugazione (400 x g) dolce e pipettaggio.
4. eseguire l'ibridazione del DNA sulla superficie del poliacrilammide Oligomicrosphere
Nota: Un'identico DNA sonda con un 5'-NH2-gruppo invece di 5'-acrytide modifica viene aggiunto nella soluzione ho e testato per Ap-contenente microsfere in parallelo. Risultati di ibridazione del DNA sono mostrati nella Figura 2. La soluzione di sonde (PAC) di oligonucleotidi complementari Cy3-etichetta dovrebbe essere posizionata in una stanza buia.
- Risospendere Cy3-cAp con 100 μL di tampone 1xTE (buffer di TE: 10 mM Tris e 1μM EDTA, pH 8.0) al fine di ottenere una concentrazione finale di 100 μM. Ad esempio, risospendere 1 pmol PAC in 100 mL di buffer di TE e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga coperta con carta stagnola.
Nota: Per le sequenze di strand, vedere la tabella 3. - Aggiungere 100 μM di Cy3-PAC a un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL contenente microsfere Ap-copolimerizzati.
- Toccare il tubo di un paio di volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 h.
- Scartare il surnatante e rimuovere residui buffer tramite il pipettaggio.
- Lavare tre volte con 500 μL di tampone di TE.
- Risospendere le microsfere toccando delicatamente il tubo del microcentrifuge. Quindi, ripetere il passaggio 4.4.
- Posizionare le microsfere sul vetrino (75 x 50 mm) e coprire con un foglio di alluminio prima di formazione immagine.
5. asimmetrica PCR per amplificare ssDNA
- Preparare una miscela di reagenti PCR asimmetrica per amplificare ssDNA per essere analizzati. Scongelare i reagenti in tabella 4 su ghiaccio. Non tenere l'enzima polimerasi di Taq (50 U / µ l) sul ghiaccio, ma piuttosto conservare a-20 ° C fino a quando necessario.
- Vortice di delicatamente tutti i reagenti e quindi brevemente Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 s.
- Combinare tutti i reagenti come descritto tabella 4.
- I campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s), 85 ° C per 5 min, tenere a 4 ° C.
6. microsfere-PCR per amplificare ssDNA
Nota: Questa sezione descrive il protocollo per l'amplificazione ssDNA in una provetta di reazione di PCR. Reazioni di microsfere-PCR sono state effettuate in 50 µ l di volume di reazione. Le sequenze dettagliate utilizzate per amplificare ssDNA sono elencate nella tabella 5. In questo caso, Ap sulla superficie di microsfere può tempri casuale modelli del DNA in modo complementare. Si tratta di un passo molto importante per la produzione di filamenti di DNA complementare (filo del DNA antisenso, Figura 3). Il DNA esteso è usato come un modello per l'amplificazione di PCR di microsfere.
- Preparare la miscela reagente microsfera-PCR. Scongelare i reagenti in tabella 6 su ghiaccio; Tuttavia, non tenere l'enzima della polimerasi di Taq sul ghiaccio. Conservare a-20 ° C fino a quando necessario.
- Vortice di delicatamente tutti i reagenti e quindi brevemente Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 s.
- Ottenere circa ~ 25 microsfere attraverso conteggio al microscopio.
Nota: Il numero delle microsfere in provetta di uno reazione vengono calcolato utilizzando un microscopio con ingrandimento 40x. Circa 25 ~ microsfere sono utilizzate per l'amplificazione di PCR di microsfere. Informazioni più dettagliate sono nel passaggio 3. - Combinare tutti i reagenti come descritto tabella 6.
- I campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s), 85 ° C per 5 min, tenere a 4 ° C.
- Amplificazione di seguente, aggiungere 8 μL di 6 x buffer di caricamento e caricare 15 µ l di ciascun campione in gel di agarosio al 2%. Quindi, eseguire l'elettroforesi a 100 V per 35 min in 1 x TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.
7. microscopio confocale acquisizione
Nota: I risultati dell'ibridazione della sonda di microsfere-DNA sono imaging sotto un microscopio confocale. Analisi dell'immagine viene eseguita utilizzando ImageJ.
- Difficoltà ibridate microsfere sul palco del microscopio in un supporto.
- Selezionare il laser (laser a Elio/Neon, 543 nm linea) e accenderlo a controllo laser.
- Selezionare la lente dell'obiettivo nel controllo del microscopio.
- Selezionare il filtro desiderato per Cy3 e canale a controllo di configurazione.
- Iniziare l'esperimento e osservare il campione. Impostazioni per il microscopio confocale sono riassunti nella tabella 7.
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Representative Results
La piattaforma di fabbricato polimerici microfluidici basati su gocciolina è costituito da due strati PDMS (Figura 1a). Vengono utilizzati tre tipi di reti di canali microfluidici per la generazione di microsfere: geometria 1) flusso di messa a fuoco, come mostrato in Figura 1b, 2) un canale serpeggiante per miscelare la soluzione io e soluzione II e 3) un canale di polimerizzazione per microsfere solidificazione. L'altezza di tutti i canali era 60 μm. La lunghezza di canale per la miscelazione e la polimerizzazione erano 74,35 e 94,45 mm, rispettivamente. Le larghezze di microchannel per due flussi fluidi immiscibili e quello per il flusso di olio minerale erano 100 μm e 200 μm, rispettivamente. La struttura di orifizio utilizzata per microsfere formazione era di 50 μm di lunghezza e 25 μm larghezza. L'angolo della struttura diffusore era 37°. Un sistema di controllo pneumatico lab-basata per flusso continuo dell'olio minerale e due pompe a siringa per il flusso di soluzione (Figura 1C) sono stati utilizzati per la generazione di microsfere nella piattaforma microfluidica (Figura 1D). La velocità di produzione delle microsfere era circa 30 microsfere al secondo quando la portata delle soluzioni e pressione applicata erano a 0,6 mL/h e 108 kPa, rispettivamente (tabella 2). Il suo diametro nel canale micro è 78,7 ± 2,5 m. La sintesi del-flusso di microsfere possono essere manipolata con successo utilizzando il dispositivo microfluidico. Formati del branello sono stati misurati dopo il gonfiore. Il diametro medio delle microsfere risultante era 150,4 ± 12,8 m. Le variazioni di dimensioni erano circa 8,5%. Le microsfere sono sottoposti a gonfiore in acqua, risultante in un aumento di dimensioni enormi.
La proprietà qui di microsfere può essere variata. Abbiamo inserito una sonda 5'-coprocoltura-DNA nella soluzione di microsfere (soluzione io, Vedi tabella 1). In seguito Co-polimerizzazione, una sonda di DNA complementare è etichettata con colorante fluorescente, Cy3, a temperatura ambiente per 1 h. confocale microscopia può essere utilizzata per dimostrare la sintesi di oligomicrospheres qui pure come funzionale ibridazione sul superficie di microsfere. Immagini fluorescenti delle microsfere sono mostrati nella Figura 2. Se microsfere sono correttamente funzionalizzate con la sonda di 5'-coprocoltura-DNA, essi dovrebbe provocare copertura di attività fluorescente sulla superficie durante l'esperimento di ibridazione. Se copolimerizzazione non si è correttamente, l'immagine ottica microsfere esibirebbe contaminazione interna all'interno le microsfere. Come illustrato nella Figura 2, non c'è nessuna interferenza di orientamento casuale-interno. Questo risultato ci ha permesso di realizzare la presentazione di sonda di DNA in un 3-dimensionale (3D) disposizione e microsfere-PCR. Dovrebbe essere notato che un identico DNA sonda con un 5'-NH2-gruppo anziché una modifica di 5'-acrytide non ha fatto olefina durante la sintesi del-flusso di microsfere8.
Quando si lavora con microsfere, manipolando la superficie 3D con una oligo-sonda di DNA è un molto più veloce di processo14. Pertanto, una piattaforma di sintesi su flusso microsfera può fornire uno strumento per l'amplificazione di ssDNA e purificazione, come indicato nella Figura 3. Il modello di DNA anti-senso (-, modello complementare) può essere esteso con l'aggiunta di un modello casuale di DNA (+ modello). In questo caso, l'inizialmente copolymerized 5'-Ap fornisce un'estremità 3'-OH per la polimerizzazione del DNA dopo ricottura al suo modello complementare (76 nt). Microsfere-PCR può essere eseguita in una singola microprovetta PCR utilizzando microsfere funzionalizzate, un modello casuale di DNA e un Tag-forward primer. Al fine di distinguere gli ampliconi di ssDNA risultante dal modello casuale di DNA (template, 76 + nt), il primer forward ha un tag aggiuntivo 24 del nucleotide. Se il primer forward non dispone di una sequenza di tag aggiuntivi, è molto difficile da riconoscere tra ampliconi ssDNA e il modello iniziale casuale del DNA.
È stato effettuato un esperimento PCR asimmetrico. Siamo stati in grado di osservare il dsDNA contaminanti come mostrato nella Figura 4. Nella maggior parte dei casi, è necessario isolare ssDNA utilizzando biglie magnetiche rivestite con streptavidina e digestione esonucleasi. Tuttavia, microsfere-PCR rende efficace l'utilizzo di un singolo primer (Tag-forward primer) ad accumulare ssDNA in fase acquosa. Si prevede che il dsDNA contaminanti attribuirà alla superficie delle microsfere. Di conseguenza, ssDNA ampliconi possono essere ottenuta attraverso pipettaggio senza la necessità di centrifugazione. Il ssDNA risultante è stata dimostrata confrontandolo con gli indicatori sintetici dimensioni (76 nt ssDNA e 100 nt ssDNA) attraverso analisi di elettroforesi del gel.
Figura 1: la piattaforma microfluidica. (a) fabbricato microfluidici piattaforma, (b) vista della geometria del flusso-messa a fuoco, set-up sperimentale (c), allargata e (d) catturato immagini che mostrano la generazione continua di microsfere. 1: struttura del canale micro per il flusso di geometria, 2 di messa a fuoco: per la miscelazione di soluzioni, 3: per solidificazione di microsfere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: lettura fluorescente di ibridazione del DNA sulla superficie di microsfere. 5'-coprocoltura-modifica di sonde di DNA (Ap) sono stati in grado di ibridare con Cy3 complementari sonde di DNA (PAC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: illustrazione del protocollo PCR microsfera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: confronto tra microsfera-PCR e PCR asimmetrica convenzionale. M; marcatore di ssDNA (76mer e 100mer), Lane 1; PCR asimmetrica, Lane 2; Microsfere-PCR. Ristampato con il permesso dal precedente lavoro8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Volume nel mix (μL) | Concentrazione finale | |
| Soluzione ho | Soluzione al 40% Acrylamide:bis (19:1) | 25 | 10% |
| Sonda di coprocoltura 100 μM (Ap, 5' - coprocoltura-(TTTTTTT, sequenza del linker) AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3') | 10 | 10 ΜM | |
| 5 x tampone TBE (Tris-base-EDTA) | 10 | 0.5 X | |
| Acqua | 5 | - | |
| Soluzione II | 20% ammonio persolfato | 50 | 10% |
| Soluzione III | TEMED (N,N,N″, ″N-tetrametiletilendiammina) | 8 | 0,40% |
| Olio minerale | 1000 | - | |
Tabella 1. Componenti della miscela reagente per sintesi di microsfere di poliacrilammide il flusso.
| Condizione operativa | Microsfere velocità di produzione |
|
| Portata di soluzione | Pressione olio | |
| (mL/h) | (kPa) | (/ sec) |
| 0.4 | 82 | 7.1 |
| 0,5 | 94 | 13.3 |
| 0.6 | 108 | 28,9 |
| 0,7 | 116 | 36.5 |
Tabella 2. Sintesi delle condizioni operative e le microsfere prodotte.
| Sonda di DNA | Sequenze |
| Cy3 etichettato sonda oligonucleotide complementare (PAC) | 5'-Cy3-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' |
| Tag (prime 24 nt)-forward primer | 5'-GGT AAT ACG CAC ATTO TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' |
Tabella 3. Informazioni sulla sequenza di sonde di DNA.
| Reagente | Volume per reazione 1x (μL) | Concentrazione finale |
| Modello casuale di DNA | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| Reverse primer | 1 | 0,02 |
| Taq tampone 10x | 5 | 1 X |
| 10 mM di dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Acqua | 37,8 | - |
| Totale | 50 | - |
Tabella 4. Reagente di PCR asimmetrica miscelare i componenti in reazione a 20 L.
| Modello | Sequenza | Lunghezza (nt) |
| Modello casuale di DNA | 5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT (sequenza Random, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Tag-Forward primer (Tag-F) | 5'-GGT AAT ACG CAC ATTO TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Reverse primer | 5'-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabella 5. Informazioni sulla sequenza di microsfere-PCR.
| Reagente | Volume per reazione 1x (μL) | Concentrazione finale |
| AP-microsfere | ~ 25 microsfere | - |
| Modello casuale di DNA | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward primer | 1 | 0,4 ΜM |
| Taq tampone 10x | 5 | 1 X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Acqua | 37,8 | - |
| Totale | 50 | - |
Tabella 6. Microsfere-PCR reagente mescolare componenti nella reazione di 50 L.
| Modalità di scansione | Aereo |
| Rappresentazione in scala | X: 2,49 μm, y.: 2.49 μm |
| Dimensione dello stack | X: 1272.79 μm, y: 1272.79 μm |
| Eseguire la scansione dello zoom | 0,7 |
| obiettivo | CE Plan-Neofluar 10 x / 0,3 M27 |
| Media | 1 |
| Foro stenopeico | CH2: 104 um |
| Filtri | CH3: LP 420 |
| Beam Splitter | MBS: HFT 488 / 543, DBS1: specchio, DBS2: NFT 515, FW1: nessuno |
| Lunghezza d'onda | 543 nm 100.0% |
Tabella 7. Impostazioni per il microscopio confocale.
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Discussion
Contaminanti di dsDNA sono un problema importante in ssDNA amplificazione. Rimane difficile minimizzare dsDNA amplificazione in convenzionale di amplificazione in PCR asimmetrica15. Inoltre, anche se miglioramenti tecnici per la generazione di ssDNA hanno permesso di aumentare l'efficienza di rendimento del campione, ssDNA isolamento è ancora problematico a causa di suoi alti costi e rendimenti di depurazione incompleta.
PCR asimmetrica è uno dei più impegnativi metodi utilizzati quando si lavora con ssDNA. Questo metodo si applica importi disuguali di primer (ad es., rapporto di 20: 1) al fine di generare grandi quantità di ssDNA. Tuttavia, è molto difficile ottimizzare ogni reazione di amplificazione per produrre ssDNA. Così, i sottoprodotti (dsDNA) devono essere eliminati dal risultanti4.
Al fine di generare ssDNA senza passaggi aggiuntivi di separazione, abbiamo prodotto poliacrilammide microsfere per esporre le sonde del DNA sulla base del metodo di copolimerizzazione coprocoltura. Il nostro metodo di fissaggio del DNA è stato adattato facilmente utilizzando una piattaforma microfluidica gocciolina-basato. Oligomicrospheres copolymerized aventi diametri su microscala con successo sono state prodotte. Di conseguenza, microsfere-PCR è stato usato per amplificare il ssDNA in una singolo tubo di reazione. Naturalmente, per adattare questa procedura per altri esperimenti PCR, comunemente necessarie regolazioni (per esempio, cambiando il ciclo di amplificazione, ricottura temperatura e sequenze di modello) sono necessarie. In conclusione, microsfere-PCR è stato dettagliato qui, rendendolo disponibile per lo sviluppo di analisi biologica, sequenziamento del DNA e l'analisi di DNA microarray.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Questo studio è supportato da un progetto intitolato "programma di ricerca cooperativa per agricoltura Science & Technology Development (progetto n ° PJ0011642) "finanziato dal governo di sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata sostenuta in parte anche da una sovvenzione (NRF-2017R1A2B4012253) del programma di ricerca scienza base attraverso la Fondazione di ricerca nazionale (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione, Repubblica di Corea. Questa ricerca è stata anche sostenuta da una sovvenzione (N0000717) del programma di educazione per creativi e convergenza industriale finanziato dal Ministero del commercio, industria ed energia, Repubblica di Corea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
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