Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar el potencial de membrana mitocondrial de las células después de ser expuestos a hipoxia/reoxygenation con o sin un agente protector.

Resumen

Oportuna y eficiente la reperfusión de la arteria coronaria ocluida es la mejor estrategia para disminuir el tamaño del infarto miocardio en pacientes con un segmento ST elevado de infarto de miocardio. Sin embargo, la reperfusión por sí puede provocar más muerte de cardiomiocitos, un fenómeno conocido como lesión de la reperfusión. La apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial (mPTP), con la disminución del potencial de membrana mitocondrial (MMP), o la despolarización mitocondrial, es reconocida universalmente como el paso final de daño por reperfusión y es responsable de mitocondrial y de la muerte de los cardiomiocitos. JC-1 es un colorante catiónico lipofílico que se acumula en las mitocondrias dependiendo del valor de MMP. Cuanto más alto es el MMP, más JC-1 se acumula en la mitocondria. Las crecientes cantidades de JC-1 en la mitocondria pueden ser reflejadas por un cambio de emisión de fluorescencia verde (~ 530 nm) a rojo (~ 590 nm). Por lo tanto, la reducción de la relación de intensidad de fluorescencia roja/verde puede indicar la despolarización de las mitocondrias. Aquí, tomamos ventaja de JC-1 para medir la MMP o la apertura del mPTP en miocitos cardiacos humanos después de la hipoxia/reoxygenation, detectado mediante citometría de flujo.

Introducción

Enfermedad coronaria es la principal causa de muerte en todo el mundo. El tratamiento de elección para reducir lesión isquémica y limitar el tamaño del infarto en pacientes con segmento ST elevan de infarto de miocardio es oportuna y eficaz la reperfusión miocárdica mediante intervención coronaria percutánea (ICP) primaria^{1, 2}. Sin embargo, la reperfusión causa daño adicional, que puede suponer hasta un 30% del tamaño final del infarto³. Se reconoce universalmente que el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) no es sólo central en mitocondrial daño y muerte celular dur....

Protocolo

1. preparación de reactivos y soluciones

1. Preparar el medio completo de miocitos cardiacos humanos (HCMs) añadiendo 25 mL de mezcla de suplemento del medio de crecimiento del miocito a 500 mL de medio de crecimiento del miocito según las instrucciones del fabricante. Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de usar.
2. Preparar solución de Tongxinluo (TXL) disolviendo polvo ultrafino TXL en suero glucosa-libre de Dulbecco modificado medio de águila (DMEM) y ajustar la concentración de TXL a 400 μg/mL mediante la adición de DMEM (para más detalles, véase¹¹). Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de usar.
3. Prepar....

Resultados

Antes de realizar el ensayo de JC-1 para evaluar los cambios de MMP, se recomienda encarecidamente que se realizaron experimentos confirmar las condiciones de éxito establecido por los investigadores. Como se muestra en los resultados de citometría de flujo (figura 2), en comparación con el grupo normal, hipoxia/reoxygenation (H/R) indujo significativamente la apoptosis de HCMs (anexina V + /PI±), indicando que habíamos establecido un modelo basado en la célu.......

Discusión

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza tinte JC-1 para evaluar la MMP de células después de estar expuesto a H/R. detectado por análisis de JC-1, MMP de células es independiente de factores tales como tamaño mitocondrial, forma y densidad que puede influir en la fluorescencia del solo-componente señales de¹⁴. En consecuencia, los resultados del ensayo de JC-1 son relativamente confiables. Además, es conveniente y ahorro de tiempo para realizar el ensayo de JC-1. Este ensayo tiene un requisito .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1	Beyodtime, China	C2006	En el kit hay solución madre JC-1 (200 veces), tampón de tinción estándar (5 veces) y CCCP (10 mM)
Polvo ultrafino Tongxinluo	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Anexina V-FITC / PI Kit	Becton-Dickinson, EE. UU.	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, EE. UU.	11966-025
Miocito cardíaco humano	Promocell, Alemania	C-12810
Medio de crecimiento de miocitos (SupplementMix)	Promocell, Alemania	C-39275
Medio de crecimiento de miocitos (listo para usar)	Promocell, Alemania	C-22070	utilizado con el medio de crecimiento de miocitos SupplementMix
GENbox	BioMé rieux, Marcy l' Etoile, Francia	96127	2.5L
(AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL  COMPAÑÍA, INC. , Japón	C-1
Indicador anaeróbico	BioMé rieux, Marcy l' Etoile, Francia	96118
Citómetro	de flujo Becton-Dickinson, EE. UU.	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, EE. UU		Versión8.0.1
Tubo de muestra	Corning science, EE. UU.	352054	12 * 75 mm
PBS	Hyclone, EE. UU	SH30256.01

Catalizador de . .