Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

Summary

El objetivo de este protocolo es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos aislados del tejido intestinal humano no fijado, recién resecado usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Este protocolo implica preparación de flash-congeladas muestras de tejido intestinal humano, cryosectioning, coloración etanólico y deshidratación, LCM y la extracción de RNA.

Abstract

El propósito de este método es obtener muestras de RNA de alta integridad de ganglios entéricos de interpretaciones, recién resecado tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). Hemos identificado cinco pasos en el flujo de trabajo que son cruciales para la obtención de RNA aislados de ganglios entéricos con suficiente calidad y cantidad de RNA-seq. En primer lugar, preparar el tejido intestinal, cada muestra debe tener todo exceso de líquido eliminado por borrar antes de aplanar la serosa tanto como sea posible a través del fondo de grandes moldes base. Las muestras entonces se congelan rápidamente encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. En segundo lugar, al seccionar los tejidos, es importante posicionar cryomolds para que las secciones intestinales paralelas el plano completo del plexo mientérico, produciendo así la mayor superficie de ganglios entéricos por diapositiva. Tercero, en la LCM, polietileno napthalate (PEN)-diapositivas de membrana ofrecen la mayor velocidad y flexibilidad en las formas no uniformes de ganglios entéricos el recoger los ganglios entéricos. En cuarto lugar, para la clara visualización de ganglios entéricos dentro de las secciones, colorantes compatibles con etanol, como el violeta de cresilo, ofrecen excelente preservación de la integridad del RNA en relación con tintes acuosos. Finalmente, para la extracción del ARN de los ganglios capturados, observamos diferencias entre los kits comerciales de extracción RNA que rindieron superior cantidad de RNA y de calidad, eliminando la contaminación del ADN. Optimización de estos factores en el protocolo actual en gran medida acelera el flujo de trabajo y da muestras de los ganglios entéricos con excepcional calidad de RNA y la cantidad.

Introduction

Este método está diseñado para obtener muestras de RNA de alta calidad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar suficiente RNA calidad y rendimientos para ARN de secuencia (RNA-seq) y está destinado a ser utilizado con tejido intestinal humano recién resecado, interpretaciones, flash-congeladas.

Trastornos de la motilidad gastrointestinal y tripas funcionales afectan uno de cada cuatro personas en los Estados Unidos. El sistema nervioso entérico (ENS), también conocido como el segundo cerebro¹

Protocol

Se describen aquí todos los protocolos han sido aprobados por la Vanderbilt University institucional de junta (IRB).

1. preparación antes de la llegada de tejido

1. Obtener la aprobación IRB apropiado y coordinar con agencias de donación de órganos humanos para obtener tejido intestinal recién resecado, interpretaciones de los donantes que cumplen todos los criterios de investigación para el estudio.
   Nota: Este protocolo puede ser adaptado para su uso con ratones y otros roedores modelos.
   1. Inmediatamente tras la resección de cada segmento intestinal, deje correr el lumen con PBS frío o medio de almacenamiento de tejido para....

Results

Hemos hecho varias mejoras en los protocolos que permiten la colección relativamente rápida de ganglios entéricos de muestras intestinales humanas usando LCM, cumpliendo con los estándares para RNA-seq. En primer lugar, hemos optimizado la congelación rápida de los segmentos de tejido intestinal en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco en 2 MB (figura 1B). Se obtuvo el mejor éxito durante cryosectioning.......

Discussion

Este procedimiento permite la eficiente recopilación de numerosos ganglios entéricos como fuente para obtener RNA para RNA-seq. Aquí, hemos acelerado los procesos descritos en los protocolos existentes al máximo preservar integridad del RNA. Como todos los pasos de este procedimiento son interdependientes, es importante eliminar todos los problemas desde el inicio del estudio y que todas las muestras se preparan como semejantemente uno al otro como sea posible, para obtener confiable RNA-seq.

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalina con tamponamiento neutro	Sigma	HT501128-4L
2-Metilbutano	Fisher	O3551-4
jeringa de 3 mL	BD	309628
tubos cónicos de 50 mL, polipropileno	Corning	05-526B
Moldes base 37x24x5mm, desechables	Ciencias de Microscopía Electrónica 5025511
Belzer UW  Solución de almacenamiento en frío	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM tapas	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press' n Sello	Contento	N.A.
Acetato violeta Cresyl Acros	Organics	AC405760025
tabla	de cortar Ciencias de la Microscopía Electrónica 63308
Etanol, 190 pruebas	Pharmco-AAPER	111000190
Etanol, 200 pruebas Pharmco-AAPER		111000200
Portaobjetos de microscopio de vidrio	Fisher	12-550-343
Guantes, puño extendido	Microflex
Batas, quirúrgicas-desechables	Kimberly-Clark	19-088-2116
Bandeja, 20 L (bandeja esterilizadora grande de polipropileno)	Nalgene	1335920B
Toallitas Kimwipes (grandes)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (pequeño)	Kimberly-Clark	34133
Sistema de microdisección por captura láser (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Mandril de criostato Leica, grande,  40 mm	Servicio de Instrumentación de Patología del Sureste	N.A.
Microscopio óptico	Olympus	CX43
Objetivo de microscopio (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Objetivo de microscopio (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Tamices	moleculares Acros Organics	AC197255000
Agua libre de nucleasas	Ambion	AM9937
Kit de extracción de ARN PicoPure	Applied Biosystems	12204-01
Mortero de pellets	Kimble Kontes 4621973
PEN membrana LCM portaobjetos	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Tubos sin RNasa, 1,5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
Kit de extracción de ARN "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
Kit de extracción de ARN "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
Método de extracción de ARN "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
Kit de extracción de ARN "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, pantalla facial desechable	Fisher	17-310
Tijeras, quirúrgica, 14,5 cm "afilada-afilada"	Fine Science Tools	14002-14
Filtro de jeringa, acetato de celulosa (0,2 μ m)	Nalgene	190-2520
Medio de congelación de tejidos	generales Cuidado de la salud	TFM-5
Xilenos	Fisher X3P1GAL