Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

Este método está diseñado para obtener muestras de RNA de alta calidad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano usando el microdissection de la captura de láser (LCM). El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar suficiente RNA calidad y rendimientos para ARN de secuencia (RNA-seq) y está destinado a ser utilizado con tejido intestinal humano recién resecado, interpretaciones, flash-congeladas.

Trastornos de la motilidad gastrointestinal y tripas funcionales afectan uno de cada cuatro personas en los Estados Unidos. El sistema nervioso entérico (ENS), también conocido como el segundo cerebro¹, es a menudo en el centro de estos trastornos, como juega un papel fundamental en la homeostasis intestinal y la motilidad. Manipulación de la motilidad intestinal generalmente está limitado a la resección quirúrgica del tejido agangliónico/noncontractile, modificación dietética crónica y/o medicamentos. Sorprendentemente, el transcriptoma completo de la ENS adultos queda ser secuenciado, limitando enormemente nuestra capacidad para identificar las moléculas dentro de la ENS que pueden ser dirigidos farmacéuticamente o utilizados en terapias con células madre.

Hay relativamente pocos métodos para aislar RNA ganglios entéricos humanos. El primer enfoque, disociación celular²requiere incubación altas temperaturas y tiempos de incubación; tanto que se conocen para promover la degradación del RNA y alterar el transcriptoma^2,3. Un enfoque alternativo, LCM, más confiablemente conserva el transcriptoma y protege la integridad del RNA. Aunque varios estudios han utilizado LCM para recoger los ganglios del tejido intestinal humano fresco congelado^4,5,6, estos enfoques tampoco fueron obstaculizados por la pobre cantidad y calidad de RNA, eran muy intensivas, o necesaria modificación de la tinción o técnicas de extracción de RNA para trabajar en nuestras manos. Otros protocolos de LCM diseñados para la preservación de RNA que se encuentran en productos de LCM manuales proporcionan mejoras adicionales^7,8, pero la adaptación era necesario cuando se aplica al aislamiento de los ganglios entéricos^{8, 9}. por estas razones, hemos desarrollado un protocolo optimizado basado en estos recursos que rinde cantidades sustanciales de RNA de alta integridad de ganglios entéricos humanos, tiene un flujo de trabajo relativamente rápido y produce resultados consistentes a través de una gran número de muestras.

En este estudio, presentamos una sinopsis de los procedimientos optimizados que facilitan el aislamiento de ARN de alta integridad de ganglios entéricos de tejido intestinal humano resecado. Nuestro método incorpora cinco aspectos importantes. Primeras, recién resecado, interpretaciones muestras intestinales humanas deben recortarse en tamaño, tienen todo el exceso de humedad quitada con un pañuelo de laboratorio y aplastada en un molde grande de base antes de la congelación de flash encima de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano (2 MB). En segundo lugar, histologic secciones del intestino deben estar preparadas para obtener el plano completo del plexo mientérico en un portaobjetos, que ofrece una gran capacidad de carga de ganglios entéricos. Éxito con este paso depende en gran medida del proceso de preparación del tejido. En tercer lugar, la estructura no uniforme de los ganglios en la ENS requiere el uso de polietileno napthalate (PEN) membrana diapositivas⁶, que ofrecen la mayor velocidad y precisión durante el proceso de la LCM. Tintes en cuarto lugar, compatible con etanol, como el violeta de cresilo, puede usarse para preservar la integridad del RNA mientras manchaba los ganglios entéricos. Por último, el proceso de extracción de RNA es fundamental para un resultado exitoso con RNA-seq. Buscamos un enfoque de extracción de RNA que produce alta integridad del RNA, maximiza rendimientos RNA cuando a partir de pequeñas colecciones de ganglios entéricos, elimina la contaminación de ADN y conserva especies de RNA como muchos como sea posible.

Tomados en conjunto, optimización de estos factores en el presente estudio grandemente acelera el flujo de trabajo y da muestras de ganglios entéricos con la excepcional cantidad de RNA y la calidad. Resultados han sido en gran parte constantes entre un grupo considerable de muestras, indicando que la consistencia de este enfoque. Además, hemos utilizado estos enfoques secuenciar con éxito decenas de muestras de RNA de los ganglios entéricos. Las estrategias aquí destacadas también ampliamente adaptables para la realización de LCM de deseada de los ganglios o núcleos de periférico y sistema nervioso central y otros casos que requieren el aislamiento del ARN de alta calidad.

Se describen aquí todos los protocolos han sido aprobados por la Vanderbilt University institucional de junta (IRB).

1. preparación antes de la llegada de tejido

1. Obtener la aprobación IRB apropiado y coordinar con agencias de donación de órganos humanos para obtener tejido intestinal recién resecado, interpretaciones de los donantes que cumplen todos los criterios de investigación para el estudio.
   Nota: Este protocolo puede ser adaptado para su uso con ratones y otros roedores modelos.
   1. Inmediatamente tras la resección de cada segmento intestinal, deje correr el lumen con PBS frío o medio de almacenamiento de tejido para quitar el material residual luminal o heces.
   2. Después de lavado y desechar los residuos en un receptáculo biológico apropiado, sumergir el tejido en un volumen suficiente de tejido de almacenamiento medio (por ejemplo, 3 - 5 veces el volumen del tejido intestinal) y guardar en plástico a prueba de agua etiquetadas individualmente contenedores, sumergidos en hielo o refrigerado hasta su uso).
   3. Proceso el tejido dentro de 18-26 horas desde el momento de la recogida para evitar la degradación de RNA substancial.
      Nota: Dependiendo de la limpieza del segmento intestinal y de almacenamiento de información, es posible prorrogar el plazo sugerido.
2. Preparar todos los materiales necesarios para la recolección de tejido humano por adelantado, como se indica en el presente Protocolo (consulte la Tabla de materiales para información más detallada). Asegúrese de que todos los necesarios equipos de protección personal se usa en todo momento.
3. Preparar cubos de hielo seco con una mezcla de hielo seco como se muestra en la figura 1.
   1. Aplastar el suficiente hielo seco para llenar 4 cubos de hielo circular estándar y un cubo de hielo rectangular. Uno de los cubos estándar debe tener laboratorio pequeño (11 x 21 cm) tejidos colocan en la superficie del hielo seco. Si es posible, utilizar cajas nuevas, sin abrir de los tejidos de laboratorio.
   2. Hacer una mezcla de hielo seco por powderizing 2 L de hielo seco en un cubo de hielo rectangular limpio.
   3. Añadir previamente refrigerado 2 MB hasta la superficie del hielo seco. Ligeramente la mezcla y aplanar la mezcla usando una tapa de caja de punta de pipeta a la superficie de la forma de la mezcla en un canal rodeado de grandes piezas de hielo seco a lo largo de los lados de la cubeta rectangular.
   4. Lugar varios bloques finas de hielo seco a lo largo de los bordes de la cubeta de hielos para fomentar la congelación más rápida. Debe haber espacio para moldes base de ≥4 caber holgadamente en el cubo de mezcla de hielo seco en un momento dado.
      1. Opcionalmente, pila el cubo de hielo dentro de otro cubo de hielo rectangular llena ¼ con hielo seco. Esta posición ayuda a aislar mejor la mezcla de hielo seco y evita la necesidad de ajustes frecuentes de hielo seco y 2 MB durante el procedimiento.
   5. Coloque los cubos de hielo seco en una línea de montaje en el siguiente orden: 1) hielo seco mezcla cubo, cubo de hielo 2) laboratorio tejido seco, 3 y 4) normales seco cubos de hielo, cubo de hielo seco 5) rectangular (figura 1A).

2. preparación del tejido Intestinal humano congelado de Flash

Nota: Todo este proceso puede tomar entre 45-80 minutos por el segmento intestinal, dependiendo de la calidad del tejido intestinal. También se recomienda recoger muestras de control de calidad para evaluar la calidad del RNA y la histología antes de proceder a la LCM.

1. Llenar una bandeja grande con hielo mojado y coloque las tablas de corte quirúrgico sobre el hielo seco.
2. En esta configuración, chill un vasos de precipitado de 500 mL y 100 mL para almacenar los segmentos cortados y tejidos en la solución de almacenamiento en frío. Base pre-chill moldes en las placas de corte para que estén listos para recibir el tejido.
3. Al recibir el tejido intestinal fresco, retirar de los medios de comunicación en la que el tejido es transportado y retener en los vasos previamente enfriados. Deje algún espacio en estos vasos para el almacenamiento temporal del tejido intestinal y segmentos recortados, que se prepararán en los pasos posteriores.
4. Cortar el segmento intestinal a una longitud de aproximadamente 20 cm, que proporciona un amplio tejido (40-60 cm²) para generar RNA para aplicaciones posteriores y las muestras de control de calidad. Dependiendo de la integridad del tejido, puede ser factible realizar aislamiento de RNA para el procesamiento de aguas abajo con una longitud mucho más pequeña (es decir, 5 cm de intestino).
5. Corte lejos adiposo y tejido conectivo del intestino con tijeras quirúrgicas. Adiposo a lo largo de la serosa intestinal residual pone en peligro la capacidad de aplanar totalmente tejido en pasos posteriores. Recorte cuidadosamente el tejido, para evitar mellar la serosa durante la extracción de grasa y tejido conectivo, que estructuralmente puede dañar el plexo mientérico o hacer el exterior del tejido aplanar irregularmente para seccionamiento.
6. Haga una incisión longitudinal a lo largo de toda la longitud de la muestra intestinal, preferentemente en el sitio de fijación mesentérica.
7. Disecar y descartar la tenia coli del colon, por lo que se aplana más fácilmente, al ser liberado de la tensión.
8. Splay el lado de la mucosa del intestino hacia abajo sobre una tabla de corte frío y cortar tiras de 1,25 cm de ancho de toda la longitud del tejido.
   Nota: Tejido Intestinal a menudo se expande después de recortar, por lo que este tamaño debe ajustarse en consecuencia.
9. Almacenar temporalmente las tiras en solución de tejido-almacenamiento refrigerado.
   Nota: Usamos solución de almacenamiento en frío Belzer UW porque tiene una larga vida útil, es relativamente económica y puede ser almacenado a temperatura ambiente hasta que se necesite.
10. Retire una tira de tejido de la solución de almacenamiento en frío y cortar en segmentos ~1.5-2 cm largo.
11. Secar rápidamente los segmentos intestinales en una pila de trapos de laboratorio, para eliminar el exceso de líquido y prevenir la formación de cristales de hielo a lo largo de la serosa intestinal durante la congelación de flash. Si el tejido no se seca suficientemente, será difícil obtener secciones de alta calidad desde el plexo mientérico.
12. Haceos el borrado piezas intestinal mucosa-lado en un pre-frío, grande, desechable plástico molde básico (37 x 24 x 5 mm).
13. Alisar cuidadosamente cada segmento ligeramente estirando el tejido sobre la superficie del molde base y usando fórceps curvado suavemente presione hacia abajo y expulsar cualquier burbuja de aire que puede quedar atrapado debajo de la serosa. Tenga en cuenta que el tejido se expande y aplanar. Si es necesario, recortar los segmentos y corte las muestras restantes en un tamaño más pequeño.
    Nota: Si el tejido está sobrecargado, esto distorsionará el plexo mientérico. Después se eliminan todas las burbujas de aire, evaluar el espesor de la muestra antes de la congelación. Si es necesario, empuje los bordes del interior de muestras hasta la muestra intestinal acerca a su grosor original.
14. Coloque el molde base cargado sobre la superficie del hielo seco, mezcla de 2 MB. El tejido debe congelarse completamente en 30-60 s, dependiendo del tamaño y grosor del segmento intestinal.
15. Secar la parte inferior del molde base quitar residual 2-MB frotando rápidamente el molde básico de los tejidos de laboratorio previamente enfriados en el segundo cubo de hielo seco.
16. Transferir la muestra seca a la tercera tina de hielo seco y enterrarlo debajo de la superficie del hielo seco hasta que esté listo para ser envuelto.
17. Observar rápidamente la parte inferior del molde base antes de envolver, para examinar la calidad de la preparación de la muestra. Tome nota de las muestras que no aparecen planas o burbujas de aire grandes, como estas deben evitarse para cryosectioning y LCM.
18. Envolver la muestra en papel de aluminio previamente marcados que se pone en la cima de hielo seco en un cubo para que la envoltura de tejido se produce mientras se mantiene completamente congelado.
19. Envolver la muestra con una capa de envoltura de plástico, para reducir al mínimo la deshidratación de tejidos durante el almacenamiento a-80 ° C.
20. Almacenar las muestras en el cubo rectangular hasta que están listos para el congelador.
21. La etiqueta y enfriado previamente cajas de congelador a-80 ° C para almacenamiento inmediato de muestras después de la recolección.
22. Tomar una pequeña porción de tejido de cada segmento intestinal para la evaluación de la integridad del RNA antes de realizar la LCM.
    1. La etiqueta de un tubo libre de Rnasa de 2mL para cada segmento, con ≥500 μl de tampón de lisis. Recomendamos utilizar el Kit de extracción de ARN "D", figuran en la Tabla de materiales.
    2. Homogeneizar un pedazo pequeño (2 mm x 2 mm) del intestino en un micro-homogeneizador de tejidos estándar (20-40 s, hasta que no queden trozos de tejido). Entonces, inmediatamente congelar el ARN lisado en hielo seco y conservar a-80 ° C hasta proceder a la extracción de RNA.
    3. Opcionalmente, incruste algunas de las secciones en el medio de congelación de tejido (TFM) como una copia de seguridad. Preparar las secciones de tejido de la misma manera exacta descrita en esta sección, pero sumergir las muestras en TFM dentro el molde base antes de la congelación de flash.

3. Cryosectioning

1. Antes de cryosectioning, preparar todos los materiales necesarios para la coloración y la deshidratación y transferir las muestras de tejido deseada del congelador de-80 ° C en un cubo de hielo seco.
2. Preparar el criostato para uso a la temperatura de corte óptimo (-18 a-22 ° C) y limpiar las superficies con etanol al 100% y tratamiento de la hoja y bandeja con solución de descontaminación de Rnasa del cepillo.
3. Para adherir mejor la muestra de la tirada, utilice el siguiente enfoque.
   1. Colocar pinzas en hielo seco durante al menos 30 s antes de abrir la muestra intestinal y colocándola en la superficie del hielo seco serosa-lado-para arriba.
   2. Verter un montículo de 3-5 mm de medio de congelación de tejido (TFM) sobre un soporte de muestra grande criostato y transferir inmediatamente la muestra intestinal serosa hacia arriba en el TFM.
   3. Transferir rápidamente las mordazas al hielo seco y cubrir con hielo seco molida después de permitir que el TFM para adherirse a la muestra para s 2-5 a temperatura ambiente. Asegúrese de que el TFM permanezca por debajo del plano del plexo mientérico.
      Nota: Idealmente, la superficie externa de la mucosa intestinal completamente adherirá a TFM antes TFM comienza a congelar sin descongelación de la muestra.
4. Monte el soporte del espécimen en cabeza del espécimen del criostato y alinear a la pieza con la hoja del criostato, tal que el plano del plexo mientérico será paralelo a la cuchilla de corte.
5. Establecer el espesor de seccionamiento en el criostato a 8 μm. El propósito de alinear perfectamente la muestra es obtener la mayor superficie posible del plexo mientérico en cada diapositiva. Este espesor se recomienda para tejidos humanos y roedores, pero se puede ajustar según sea necesario.
6. Sección a través de la serosa y longitudinal del músculo hasta alcanzar el plexo mientérico.
   1. Para localizar el plexo mientérico, montar una sección de la muestra sobre un portaobjetos y mancha la sección con un colorante acuoso, como el 1% de violeta de cresilo o azul de toluidina, etcetera.
   2. Ver la sección de un microscopio óptico con aumento de 40-2000 X para identificar a la unión entre las capas musculares longitudinal y circular. Parámetros del microscopio se encuentran en la Tabla de materiales. Al principio de seccionamiento, la serosa se caracterizará por la presencia de tejido conectivo. Algunos remanente de la grasa mesentérica también puede estar presente a lo largo de la serosa. Entonces comienza una hoja de la capa muscular longitudinal externa. Al llega a la frontera entre las capas musculares longitudinal y circular, se observará una porción de los ganglios entéricos.
      Nota: En las siguientes secciones varias, el plexo mientérico se convertirá en muy evidente, con grandes áreas de los ganglios que están presentes dentro de una sola sección (figura 2C). Si el tejido no es completamente plano al principio de seccionamiento, sólo una parte de los ganglios estará presente en cada sección en un momento dado. A veces, la muestra intestinal puede tener un plexo mientérico inherentemente desigual, a pesar de los tejidos que aparecen perfectamente plana. Esto es especialmente cierto para las muestras de duodeno. En nuestra experiencia, estas muestras pueden tomar mucho más tiempo para procesar con LCM, pero suficiente RNA puede ser recogida dentro de sesión de un día. La ubicación exacta del plexo mientérico puede variar considerablemente entre las muestras, basadas en el tejido y su preparación antes de la congelación.
7. Comenzar a colectar las secciones seriales para LCM, con colecciones óptimo proporcionando el mayor número de neuronas y glia por diapositiva. Dependiendo de la superficie de la muestra, se pueden combinar varias secciones en una sola diapositiva PEN-membrana.
8. Monte las secciones sobre diapositivas de membrana de pluma, enfriadas brevemente en el criostato para s 5-10. Durante el montaje, el tejido se derrite sólo ligeramente, máximo preservar integridad del RNA.

4. coloración

Nota: Para tener una visión general del proceso de tinción, refiérase a la tabla 1. Utilizadas todas las soluciones se preparan en frascos cónicos de 50 mL estándar. Tratar la parte exterior de los tubos con solución de descontaminación de ARNasas no parece mejorar los resultados (datos no mostrados).

1. Preparar una solución saturada de violeta de cresilo de 4% en etanol al 95% por lo menos un día de anticipación y resuspender completamente el violeta de cresilo antes de cargar la jeringa.
   Nota: La concentración de etanol deba reducirse para tinción efectiva, como se describe en la sección de discusión. No hemos probado si el uso de etanol 50% o 75% durante la tinción perceptiblemente reduce integridad del RNA. Violeta de cresilo es sensible a la luz y por lo tanto debe ser protegido de la luz.
2. Después de montar las secciones del plexo mientérico en el portaobjetos, inmediatamente sumerja el portaobjetos en un frasco cónico de etanol al 95% (previamente enfriada a-20 ° C) durante 30 s.
   1. Si las secciones no adhirió completamente a la diapositiva en el paso anterior, calentar ligeramente la parte inferior de la corredera con una mano enguantada (una toallita de laboratorio debe ser colocado entre la diapositiva y guante), para la completa adherencia antes de sumergirse en etanol al 95%. Esta solución puede ser reutilizada por al menos 3-6 diapositivas sin reducir la integridad del RNA.
3. Poner la diapositiva hacia arriba en un paño de laboratorio colocado encima de un recipiente previamente tratadas, libres de Rnasa⁸.
4. Llenar una jeringa de 3mL con 4% violeta de cresilo y acoplar un filtro de jeringa de 0,2 μm.
   Nota: Se recomiendan filtros de acetato de celulosa.
5. 6-10 gotas de tintura directamente sobre el tejido las secciones⁸ e incube durante 10-30 s, o hasta que suficiente tinte se mantiene cuando la manchada. Mientras que la coloración, gire suavemente el contenedor de la diapositiva con la mano para asegurarse de que las secciones de tejido son uniformemente cubiertas con manchas.
6. Vierta fuera de la mancha e inmediatamente la mancha de la diapositiva en un frasco de etanol al 75%. Varias veces sumergir el portaobjetos hasta que el exceso de tinte en su mayoría ha filtrado de la muestra. Esto puede tomar entre 10-20 s.
7. Finalizar la tinción sumergiendo repetidamente la muestra en un frasco de etanol al 95% para 10 s. Sumerja la muestra varias veces hasta que se ha quitado toda mancha exceso.
   1. Modificar la duración de la extracción, según sea necesario, para optimizar la tinción de los ganglios. Si se retira demasiada mancha, la muestra se convierte también transparente y pueden ser difícil de visualizar
      Nota: Este protocolo de tinción se ha optimizado basado en varias publicaciones^5,8,10,,¹¹ que requiere modificación antes de que se obtuvieron resultados satisfactorios. Por lo tanto, la concentración de etanol utilizado en el tinte y durante el proceso de extracción debe ser modificada, cuando sea necesario, para obtener un resultado óptimo.

5. deshidratación

1. Inmediatamente sumerja el portaobjetos en etanol al 100% 2 - 3 veces, para un total de 10-20 s.
2. Sumerja el portaobjetos en etanol anhidro 100% para al menos 30 s. Como el etanol anhidro es muy higroscópico, añadir tamices moleculares (8-12 mesh) al frasco de etanol al 100% antes de iniciar el procedimiento para eliminar toda el agua absorbido y por lo tanto más totalmente deshidratar la muestra⁵.
3. Sumergir varias veces el portaobjetos en xileno para 15-20 s. Este paso elimina completamente la capa de etanol en la diapositiva. Añadir tamices moleculares antes de tiempo en los tubos de xileno, para absorber completamente el exceso agua y etanol moléculas⁵.
   PRECAUCIÓN: Xilenos se clasifican como irritante a los ojos y tracto respiratorio superior y deben utilizarse en una campana de humos químicos.
4. Sumerja el portaobjetos en xileno (con tamices moleculares, malla de 8-12) durante al menos 10 minutos.
   Nota: Puede tomarse un breve descanso después de este paso, si es necesario. Las muestras pueden dejarse en xileno para 4-5 horas sin efectos perjudiciales a la coloración, rendimiento e integridad de LCM o ARN.
5. Opcionalmente, individualmente preparar varias diapositivas adicionales en este momento. Si prepara una segunda ronda de diapositivas después de completar la LCM en todas las diapositivas preparadas, el tejido en el criostato deba ser rectificado, debido a la deshidratación de la superficie del tejido. Uno a cuatro secciones deben descartarse antes de secciones usables se pueden recoger.

6. Microdissection de la captura de láser (LCM)

1. Quitar la corredera de xileno y secado con aire en una campana de vapores químicos durante al menos 1 min Inserte un cartucho de casquillos LCM en la platina del microscopio LCM. Cargar la diapositiva en el escenario y adquirir una imagen Resumen de la diapositiva.
2. Identificar la ubicación deseada para la LCM y carga una tapa en la diapositiva.
3. Alinee el laser infrarrojo (IR) y ajustar su poder y duración para hacer un 20-30 μm de diámetro captura punto.
4. Ubique el láser (UV) ULTRAVIOLETA y establecer una velocidad de corte adecuada y la intensidad.
5. Esquema de los ganglios deseados para ser recogido con el software de la LCM, asegurándose de que permanezca dentro del límite de la zona de coleccionable en la tapa (representada en la descripción de la diapositiva del programa como un círculo verde).
6. En cada uno de los rastros, ajustar los puntos de IR que hay al menos uno IR punto cada 100-500 μm.
7. Presione el botón de corte de IR/UV para continuar con la colección de todos los ganglios marcados.
8. Una vez que se completen colecciones, mueva la tapa a una nueva ubicación y repetir el proceso de recolección o examinar la tapa de la LCM en la estación de control de calidad una vez que la tapa está suficientemente lleno con los ganglios (o hasta que se alcanza el límite de tiempo recomendado de 60-80 minutos).
9. Si desechos están presentes en la tapa, limpie lejos usando un pincel de punta fina que ha sido previamente tratado con solución de descontaminación de Rnasa, enjuagarse con agua libre de nucleasas y completamente secas.
10. Cuidadosamente examine la tapa por el ojo o con aumentos en un microscopio de campo brillante para todos los desechos se ha eliminado. Si los desechos no pueden sacarse a través del uso de la brocha previamente tratada, luego use una pipeta fina (libre de ARNasas) para Raspe los residuos.
11. Asegure la tapa en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL llenado con 230 μl de tampón de lisis de RNA (RLT Buffer del Kit de extracción de ARN "B", con β-mercaptoetanol añadido a una concentración de 10 μl/mL).
12. Invierta la tapa, brevemente vortex e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
13. Centrifugar a ≥ 5.000 x g por 5 min y entonces traslado la microcentrífuga tubo para hielo seco.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Lisados de RNA pueden almacenarse a-80 ° C sin un efecto sustancial sobre la degradación del RNA durante al menos 1 semana. Si aislamiento de RNA se lleva a cabo el mismo día, luego enfriar las muestras en hielo hasta que estén listos para la extracción.
14. Realizar todas las colecciones adicionales dentro del límite de tiempo máximo recomendado de 80-90 min después de retirar la corredera del xileno. Como las secciones deshidratadas están expuestas a la humedad ambiente, RNasas gradualmente pueden ser reactivados. Limitar el periodo de recolección puede reducir al mínimo esos efectos y máximo preservar la integridad del RNA.

7. aislamiento de RNA

1. Preparar un sitio de trabajo libre de Rnasa para extracciones de RNA.
2. Preparar todos los tubos y los reactivos según el manual para el Kit de extracción de ARN.
   Nota: Si bien hay muchos kits disponibles para el aislamiento de RNA después de LCM, hemos tenido mejor éxito utilizando el Kit de extracción de ARN "B", aparece en la lista de materiales. Vea la figura 5 para una comparación lado a lado de los reactivos de extracción de RNA.
3. Extraer muestras del congelador de-80 ° C y descongelar rápidamente en un baño de agua de 37 ° C.
4. Inmediatamente vortex descongelar las muestras para 2-3 s distribuir las sales de guanidinio tiocianato.
5. Combinar cada muestra con un volumen igual de etanol al 70%. La piscina juntos, lisados de 2 o más si es necesario, para alcanzar una suficiente concentración de RNA.
6. Proceder según las instrucciones del fabricante en el manual para el proceso de extracción de RNA, utilizando el protocolo optimizado para microdissected muestras.
7. Eluir el RNA en el paso final en el volumen mínimo recomendado de agua libre de nucleasas (14 μL).
8. Tras aislamiento de RNA, alícuota 1-2 μl de ARN de cada muestra en un nuevo previamente etiquetado tubo libre de Rnasa calidad evaluación/control de calidad con un dispositivo de microfluidos que puede visualizar pequeñas cantidades de RNA, como un equipo Bioanalyzer. Alícuota un adicional 1 μL en un tubo separado para la cuantificación con un kit de cuantificación de RNA de alta sensibilidad.
   1. Ajustar estos pasos, según sea necesario, para obtener una cantidad suficiente de RNA para análisis posteriores (es decir., un mayor número de tapones de LCM antes de la extracción de RNA de la piscina).
9. Tienda de ARN a-80 ° C hasta recoger suficientes muestras para posteriores análisis.

Hemos hecho varias mejoras en los protocolos que permiten la colección relativamente rápida de ganglios entéricos de muestras intestinales humanas usando LCM, cumpliendo con los estándares para RNA-seq. En primer lugar, hemos optimizado la congelación rápida de los segmentos de tejido intestinal en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco en 2 MB (figura 1B). Se obtuvo el mejor éxito durante cryosectioning y LCM posterior colocando segmentos intestinales planos dentro de un molde base, frente a la mucosa hacia arriba (figuras 1B-1C). Que sean los moldes base tan planos como sea posible en la base, como cualquier curvatura hará mucho más difícil obtener una muestra representativa grande de plexo mientérico. Este enfoque genera tejido que fácilmente se secciona a 8 μm de grosor (figura 1E) y permite la eliminación completa de TFM del proceso de tinción. Se encontró que TFM interfiere con el proceso de tinción y por lo tanto oculta la identificación de ganglios entéricos. Colocación del tejido en esta orientación también evita Seccionando a través de la mucosa, que tiene un alto contenido de RNasas12, aunque por nuestra experiencia, parece el uso de manchas etanólico inhibe en gran medida estas RNasas. En los casos donde TFM o temperatura óptima de corte medio (OCT) es necesario, nos pareció más confiable primero aplanar la muestra en la parte inferior del molde base y luego añadir el TFM al molde después de este paso (figura 1D). Esto deja una "ventana" en el que el intestino puede visualizarse fácilmente, haciéndola fácil de alinear a la muestra y producir secciones que son completamente paralelas al plexo mientérico (figura 1E).

Preparación de cryosections longitudinalmente a lo largo del intestino en una orientación paralela al del plexo mientérico (figura 2A), genera las secciones en que la mayor zona de ganglios entéricos por diapositiva son visibles con tinción) Figura 2 C). cuando se aproxime el plexo mientérico (figura 2C), en la aposición de las capas musculares longitudinal y circular (figura 2B), 6-12 secciones seriales pueden ser recogidos (figura 2A, longitudinal) contienen grandes áreas de los ganglios entéricos (figura 2C). Tapas de LCM se pueden cargar a la capacidad de utilizar una sola sección (figura 4D). En contraste, durante la preparación de secciones transversales del intestino congelado (figuras 2A-2B), es sólo una pequeña área del plexo mientérico en cada diapositiva (figura 2B). Muy pocos ganglios entéricos pueden recogerse de las secciones transversales de tejido, resultando en mayor tiempo invertido y mayor costo por muestra total. El enfoque de seccionamiento en paralelo utiliza menos de una quinta parte del número de caps de LCM y diapositivas en comparación con secciones transversales y acelera considerablemente el proceso de recolección.

Antes de LCM, muestras manchadas y completamente deshidratadas para evitar actividad Rnasa durante la recogida de la LCM. Hemos diseñado un experimento para comparar directamente el efecto de manchas acuosas vs etanol manchas sobre la integridad del RNA. En este experimento, dos secciones intestinales se montaron juntos en una sola diapositiva y se procesaron en una de cuatro maneras, con n = 2-3 biológicos repeticiones por grupo. En el primer grupo, secciones intestinales frescas no se montaron sobre un portaobjetos y cada uno fue transferido directamente en tampón de lisis de RNA usando fórceps libre de Rnasa, previamente enfriado en hielo seco (figura 3A). Para todos los grupos restantes, secciones fueron adheridas a una diapositiva, procesadas, raspadas de la diapositiva usando una hoja de afeitar tratados con solución de Rnasa descontaminación y transferidas al tampón de lisis de RNA con pinzas libre de Rnasa. Un homogeneizador de micro estándar fue utilizado Lyse totalmente las muestras en todos los grupos. En el segundo grupo, las diapositivas fueron procesadas a través de todos los pasos, pero tinte no fue utilizado durante el procedimiento de tinción (figura 3B). Grupo tres se procesó con el protocolo descrito, utilizando tintura de violeta de cresilo en 4% (figura 3C). En el cuarto grupo, se utilizó una tinción acuosa, azul de toluidina siguiendo el protocolo para un kit de tinción de base acuosa con una mezcla de azul de toluidina y la hematoxilina (figura 3D). Después de la extracción de RNA, como se describe, se evaluó calidad de RNA con un Bioanalyzer. La única diferencia entre el acuoso y etanólico protocolos de tinción fue la adición de dos incubaciones de agua (30 s cada uno), inmediatamente antes y después de la tinción, que es necesaria para la absorción y retención del tinte. Encontramos que el proceso de adhesión de las secciones de tejido a la diapositiva y procesamiento con los pasos de deshidratación condujo a una reducción leve, inevitable de la calidad del RNA (figuras 3A-3B), pero que de tinción con el colorante etanol, cresil violeta, no más reducir la calidad del RNA (figura 3C). En contraste, la tintura acuosa, azul de toluidina, condujo a sustancial degradación de RNA, probablemente debido a exposición prolongada acuosa que permite la actividad de Rnasa endógena (figura 3D).

Las únicas formas de ganglios entéricos plantean dificultades para IR-LCM estándar con vidrio convencional diapositivas6 (figura 4A). Cuando utilice diapositivas PEN-membrana (figura 4B), las muestras se adhieren a una hoja fina que se extrae de la mayoría de lo portaobjetos de vidrio. El láser UV atraviesa la muestra y la membrana de la pluma, dando lugar a la separación completa de los ganglios de la diapositiva (figura 4C) y el cumplimiento completo de la tapa de LCM (figura 4D). Deseado de las estructuras de cualquier tamaño y forma (> 10-15 μm) puede ser completamente y precisamente recogidos (Cifrado 4E-4 H). Algunas muestras con menos ganglios por sección, la tapa puede ser ≥ movido cuatro veces antes de recoger. En este caso, dos o tres secciones por diapositiva de montaje minimiza el uso de diapositivas PEN-membrana.

Al aislar el RNA de muestras de LCM para RNA-seq, el objetivo es obtener la mayor calidad posible de RNA y la cantidad, eliminando el ADN todos genómico (gDNA). Para identificar un procedimiento ideal de aislamiento de RNA, se realizó una comparación directa con un Kit de extracción de ARN "A" (figura 5A), Kit de extracción de ARN "B" (figura 5B), o método de extracción de ARN "C" con la limpieza de las muestras de RNA por Kit de extracción de ARN "B" (figura 5C). Después de procesar las muestras con el violeta de cresilo optimizado protocolo de tinción, LCM fue utilizado para recolectar muestras circular estandarizadas (de 500 μm de diámetro) del tejido intestinal, tomado de la capa longitudinal del músculo. Cada tapa se asignaron al azar a cada uno de los tres grupos de aislamiento de RNA, se coloca encima de un tubo de microcentrífuga de 0.5-mL Prellenado con el tampón de lisis respectivo de cada kit. Se siguen las instrucciones exactamente como se describe para cada kit, con Kit de extracción de ARN "Un" tampón de lisis que requieren incubación a 42 ° C durante 30 minutos. De los otros kits, temperatura de incubación fue utilizado durante 30 minutos. Todas las muestras fueron brevemente agitó a además de tampón de lisis. Muestras fueron luego enfriadas en hielo hasta que las extracciones se llevaron a cabo el mismo día (n = 4). Nos encontramos con que Kit de extracción de ARN "B" con un paso de digestión de DNA en columna dio lugar a la más alta calidad de RNA y la cantidad, eliminando con eficacia gDNA (figuras 5A-5C). Lo importante es el tampón de lisis de RNA proporcionado por el Kit de extracción de ARN "B" totalmente descompone mediante lisis los ganglios capturados al recoger los ganglios entéricos(figura 5).

En promedio, nuestras muestras de tienen un RIN de 7.49 ± 0,53 (tabla 2). Partituras RIN mayor de 6-7 se consideran de suficiente calidad para RNA-seq (según el perfil específico de RNA)13, que nos da confianza de que nuestras muestras son de suficiente calidad para RNA-seq. teniendo en cuenta que el RIN para estas muestras, una vez recibida, ha sido de 7.4 a 9.5, estos resultados indican que nuestro protocolo optimizado proporciona excelente preservación de la integridad del RNA. Resultados de calidad representativos del RNA de muestras presentadas para RNA-seq se representan en las Figuras 6A-6 C. Resultados de RNA-seq demuestran que nuestras muestras se secuenciaron con éxito y tienen un sesgo modesto 3'-end (figura 6D). Por lo general, un sesgo al más grande en 3' es favorecido en muestras con bajo RIN14; moderado, este efecto se refleja en nuestras muestras. A pesar de esto, los biotipos de gene observadas fueron en gran parte constantes entre todas las muestras (figura 6E), que indica la confiabilidad de los datos.

Figura 1 . Congelación de tejido intestinal óptima. Cubos de hielo seco (A) están dispuestos en el orden representado; i) mezcla de hielo seco, los tejidos de laboratorio ii) colocados sobre hielo seco, cubo de almacenamiento iii) temporal, iv) envoltura cubo, v) pre-congelador cubo, cubo de desbordamiento vi) pre-congelador. (B) hemos optimizado la congelación rápida de segmentos de tejido en grandes moldes de base colocados en la superficie de una mezcla de hielo seco y 2-Metilbutano. (C) A imagen de más arriba de un espécimen totalmente congelado, observado en la configuración que se muestra en el panel B. Intestinal segmentos se colocan acostadas en un molde de base hacia la mucosa del lado arriba. (D) este método de congelación puede ser fácilmente adaptado para su uso con TFM por preparar el tejido de la misma forma, pero añadiendo TFM al molde base antes de congelarlos. La muestra resultante tendrá un plexo mientérico completamente plana, con una serosa que puede visualizarse fácilmente. (E) ambos preparación de tejido enfoques producen secciones del tejido excelente en el espesor recomendado 8 μm. Aquí se muestra el procedimiento con TFM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Orientación adecuada del tejido intestinal proporciona secciones ricas en ganglios entéricos. Durante la preparación de secciones transversales estándar del intestino congelado (A, B), hay solamente un área pequeña del plexo mientérico (B) presente en cada diapositiva. Muy pocos ganglios entéricos pueden recogerse por portaobjetos, que es lento y costoso. En contraste, la preparación de secciones longitudinales en el plano del plexo mientérico (C), ofrece un área superficial mucho mayor de ganglios (C). Secciones de plexo mientérico se obtienen a partir de la serosa y seccionamiento hacia adentro a través del músculo longitudinal (B). Cuando se aproxima el plexo mientérico, en el cruce de la capa de músculo longitudinal y circular (B), pueden recogerse las secciones seriales del 6-12. Cada sección longitudinal del plexo mientérico contiene grandes áreas de los ganglios entéricos (representados en C, utilizando un procedimiento de tinción modificado, sin xileno, preferentemente manchar los ganglios). Tapas de LCM pueden llenarse a capacidad usando una sección de tejido único. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Tinción con un colorante compatible con etanol mejora la calidad del RNA. Calidad de RNA fue medido por el equipo Bioanalyzer y se muestran resultados representativos de dos muestras de cada grupo. Calidad de RNA inicial había medida de frescas, sin montar las secciones (A, sin tratamiento), tenía un número de la integridad del RNA (RIN) de 8.65 ± 0.07. Para las secciones montadas y procesados a través de todos los pasos, pero sin la mancha (B), RIN era 7.95 ± 0.35. Cuando la tinción con violeta de cresilo 4% fue agregado a los pasos de deshidratación, hubo un efecto insignificante sobre el RIN, con un RIN promedio de 7,87 ± 0.35 (C). En comparación, el uso de la mancha acuosa, azul de toluidina (T-azul) y la adición de enjuagues de agua necesaria para el procedimiento (D) resultó sustancialmente reducida calidad de RNA, con un RIN de 6.45 ± 0.21. Cada grupo estaba formado por n = 3 réplicas biológicas excepción de "No tratamiento" y "T-Blue"(n=2). RINs se divulgan aquí como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 . Diapositivas de LCM de membrana de pluma permiten colecciones precisa de ganglios entéricos. Uso de portaobjetos de vidrio ordinario para recoger los ganglios entéricos por LCM tiende a resultar en la recolección de tejido no deseado (A). Los círculos rojos (30 μm de diámetro) indican el tamaño de los puntos de IR LCM utilizados durante el proceso de recolección. La flecha blanca indica una colección de ganglio que tiró un pedazo de tejido muscular adyacente. Diapositivas de pluma-membrana (B), las muestras se adhieren a una hoja fina que se extrae de la mayoría de lo portaobjetos de vidrio. Al cortar con el láser UV-LCM, la muestra y la membrana de la pluma son rebanados, dando por resultado la separación completa de los ganglios de la diapositiva, independientemente de la forma del ganglio (C) y completan adhesión a la tapa del LCM cuando quita de la muestra (D ). Estructuras de cualquiera desea μm de tamaño y forma ≥10-15 puede completamente y precisamente recogidos [(E), inicial del tejido mark-up; Corte del laser (F) IR y UV completada; LCM (G) tapa quitar de sección], como se visualiza en la tapa de LCM (H). El fondo moteado en panel H es inherente a la tapa y no desechos no deseados. La retícula de círculos verdes azul en los paneles E-H es parte del programa de LCM y marcadores de posición para los láseres UV e IR, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 . Selección de un óptimo equipo de aislamiento de RNA. Se muestran resultados de integridad del RNA después de una comparación simultánea de los tres diferentes procedimientos de aislamiento de RNA. Dos parcelas representativas de cada grupo se muestran para ilustrar la variabilidad que puede ocurrir entre muestras procesadas en paralelo. Kit de extracción de ARN "A" (A) produjo muestras con un RIN de 6,83 ± 0,65 y rendimientos moderados de RNA y tendían a tener contaminación del ADN, a pesar de realizar una digestión de la ADNsa de en columna. Kit de extracción de ARN "B" (B) resultó en el mayor medido RIN, a 8,3 ± 0,1. Mientras que el método de extracción de ARN fenol-basado "C" (seguido por la limpieza de las muestras de RNA con Kit de extracción de ARN "B") (C) parece eliminar gDNA y tenía un RIN de 7,5 ± 0.26, hubo grandes contaminantes de bandas, que puedan haber resultado de la fusión de la polímero adhesivo de la tapa del LCM durante el paso de lisis de RNA. Además, los rendimientos de Kit de extracción de ARN "A" y "C" método de extracción de RNA eran consistentemente más bajos que los obtenidos por el Kit de extracción de ARN "B". Lo importante, el RNA tampón de lisis suministrado por Kit de extracción de ARN "B". (con añadido β-mercaptoetanol) totalmente descompone mediante lisis los ganglios capturados (D). Cada grupo tenía n = 3 réplicas biológicas y se presenta aquí como media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 . Resultados representativos. Cuando agrupación de dos tapas de ganglios entéricos por muestra, se obtienen cantidades suficientes de ARN para RNA-seq (> 1 ng) junto con la excelente calidad de RNA. Parcelas representativas de RNA se muestran para una muestra con un RIN de 8.3 (A), 7.5 (B) y 6.9 (C). RNA-seq datos fueron funcionados a través de un programa de evaluación de la calidad, en R. (D) la trama de final sesgo indica que las muestras se secuenciaron con éxito y tienen un sesgo modesto extremo 3'. (E) la trama de biotipo gene también representa que los resultados de secuenciación concuerdan en gran medida entre las muestras. En total, hemos tenido una > tasa de éxito de 95% en la generación de muestras utilizables para RNA-Seq haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Tinción y Resumen del Protocolo de deshidratación. Esta tabla describe nuestro protocolo de tinción optimizado. Tenga en cuenta que mancha cualquier compatible con etanol puede utilizarse en sustitución de violeta de cresilo, si ofrece mejores resultados. En algunos casos, la duración de la coloración y extracción tendrá que ser extendido o acortado. Generalmente, cuanto más el tiempo de fijación, el más rápido el tejido será completamente mancharse. No hemos notado una reducción de la integridad del RNA después de volver a usar frascos hasta 3 veces durante la preparación de los portaobjetos del mismo segmento de tejido.

Tabla 2. Resultados representativos en RNA integridad. Las muestras que aparecen en esta tabla se obtuvieron de los ganglios entéricos humanos. Todas las muestras seleccionadas tienen suficiente calidad de RNA y cantidad para el análisis de RNA-seq. El RIN promedio de todas las muestras listadas en esta tabla es 7.49 ± 0,53. Concentración de RNA también se midió usando el análisis Quant-iT RiboGreen y todas las muestras que se muestra en esta tabla han reunido la cantidad mínima necesaria para nuestro RNA-seq (> 1 ng) experimentos. Pequeñas cantidades pueden utilizarse, dependiendo del procedimiento de amplificación previa. Sin embargo, tales procedimientos son más confiables cuando uno espera hay ser grandes diferencias en la expresión génica entre las muestras o grupos que se comparan; de lo contrario estos resultados pueden enmascarar diferencias verdaderas en algunas aplicaciones de RNA-seq. Por lo tanto, se recomienda generalmente comenzar con más material cuando sea posible.

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.