Summary
このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA の抽出。
Abstract
このメソッドの目的は、腸管神経節レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から収集から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。RNA シーケンスの十分に高い品質と量と腸管神経節から RNA 分離を得るために重要であるワークフローで 5 つのステップを識別しました。まず、腸組織を準備しているとき、各サンプルは大きな基本金型の下に可能な限りの漿膜を平坦化する前にしみが付くことによって削除すべての余分な液体が必要です。サンプルは、スラリー状のドライアイスと 2 methylbutane の上にすぐにフリーズします。第二に、組織を区分するとき、腸のセクション並列スライドごと腸内神経節の最大の表面積降伏、筋間神経叢完全な平面に配置するには、cryomolds 重要です。第三に、LCM、ポリエチレン napthalate (ペン) 中-膜のスライドは、最大速度および腸管神経節を収集するとき、腸管神経節の一様でない図形をアウトラインで柔軟性を提供します。第四に、セクション内で腸管神経節の異なる可視化、エタノール互換染料、クレシル バイオレットのような水性染料を基準にして RNA 整合性の優秀な保存を提供します。最後に、キャプチャした節からの RNA の抽出のため、我々 は DNA 汚染を排除しながら優れた RNA 量が得られた商業の RNA 抽出キットと、品質の違いを観察しました。これらの要因の現在のプロトコルの最適化は大きくワークフローを加速し、例外的な RNA の品質と量と腸管神経節のサンプルが得られます。
Introduction
このメソッドは、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して人間の腸組織から腸管神経節の高品質 RNA サンプルを取得します。ここで説明したプロトコル RNA シーケンス (seq RNA) の十分な RNA の品質と生産性を提供するために最適化されているし、新鮮な切除、固定されていない、フラッシュ冷凍人間の腸組織で使用するものです。
機能性消化管・腸の運動障害、米国のすべての 4 人の影響を与えます。腸神経系 (ENS)、2 つ目の脳の1とも呼ばれます、しばしば、これらの無秩序の中心に腸内の恒常性と運動で重要な役割を果たしています。消化管運動の操作は一般的に結腸/noncontractile 組織、慢性的な食餌療法の修正および/または薬の外科的切除に制限されています。驚いたことに、大人の ENS のにおけるトランスクリプトームの大幅薬学的ターゲットまたは幹細胞療法に活用できる ENS 内の分子を識別するために我々 の能力を制限するシーケンスするままです。
人間の腸管神経節からの RNA を隔離するため比較的少数の方法があります。高い温度と長い潜伏時間; 細胞解離2、最初のアプローチが必要です。両方あるの RNA の劣化を促進し、トランスクリプトーム2,3を変更知られています。代替アプローチ、LCM、詳細は確実にトランスクリプトームを保存し、RNA の整合性を保護します。いくつかの研究は、LCM を使用新鮮凍結ひと腸管組織4,5,6から大脳基底核を収集するが、これらのアプローチが貧しい人々 の RNA の品質や数量に阻まれたか、非常に労働集約的であったか汚れるか、または私たちの手で動作するように RNA 抽出技術の変更を必要とします。マニュアル提供腸管神経節8,の分離に適用されるときに追加改善7、8、しかし適応が必要だった LCM 製品で発見された RNA を保持するために設計された他 LCM のプロトコル9しますこれらの理由から、我々 はひと腸管神経節から整合性の高い RNA の相当な量を生成、比較的高速なワークフロー、大規模な全体で一貫性のある結果を生成するこれらのリソースに基づいて最適化されたプロトコルを開発。サンプルの数。
本研究では人間の腸切除から腸管神経節から整合性の高い RNA の分離を容易にする最適化された手順の概要を提案します。私たちの方法には、5 つの重要な側面が組み込まれています。最初、新鮮な切除、固定されていない人間の腸サンプル研究所組織で除去し、スラリー状のドライアイスと 2-methylbutane (2 MB) 上にフラッシュ凍結する前に大規模な基本金型で平坦化のすべての余分な水分は、サイズに整うべきであります。筋間神経叢に腸の神経節細胞の大規模なペイロードを提供するスライド上の完全な平面を取得には、腸の第二に、組織学的セクションを備える必要があります。この手順での成功は組織の準備プロセスに大きく依存です。第三に、神経節、ENS の不均一構造ポリエチレン napthalate (ペン) 膜スライド6、LCM プロセス中に最大の速度と精度を提供するの使用が必要です。クレシル バイオレットなどの第四に、エタノールと互換性のある染料は、腸の神経節細胞を染色しながら RNA の整合性を維持するために使用ください。最後に、RNA 抽出プロセスは RNA シーケンスで成功を収めるのための重要です私たちは真心を RNA を生成、腸管神経節の小さなコレクションを開始するときに RNA の収量を最大化、DNA 汚染を排除しできるだけ RNA の多くの種を保持 RNA 抽出方法を追求しました。
一緒に取られて、本研究ではこれらの要因の最適化は大きくワークフローを加速し、例外的な RNA の量と質と腸管神経節のサンプルが得られます。結果は、主としてこのアプローチの一貫性を示すサンプルのかなりのグループの間で一貫しています。さらに、正常に腸の神経節細胞からの RNA のサンプルの数十をシーケンス処理するこれらの方法を使いました。ここを強調する戦略には、目的の神経節の LCM あるいは末梢と中枢神経系と高品質 RNA の隔離を必要とするその他の場合の核を実行するため広く適応ことができます。
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Protocol
ここで説明されているすべてのプロトコルは、ヴァンダービルト大学制度審査委員会 (IRB) によって承認されています。
1. 組織の到着前に準備
- 適切な IRB の承認し、研究に必要なすべての研究条件を満たすドナーからの新鮮な切除、固定されていない腸組織を取得する人間の臓器寄贈機関と連携。
注: このプロトコルはマウスとその他の齧歯動物モデルで使用のために適応することができます。- すぐに腸管各部位の切除時に徹底的に冷やした PBS または組織記憶媒体, 材料の残留や糞便を削除すると内腔をフラッシュします。
- フラッシュと適切なバイオハザード容器廃棄物を破棄後、組織記憶媒体 (3-5 回腸組織量) などの十分な量のティッシュが水没し、個別にラベリング、水タイトなプラスチックに格納氷に浸漬または使用するまで冷蔵コンテナー)。
- プロセスの相当な RNA の劣化を防ぐために収集時から 18 26 時間以内組織。
注: によって腸管とストレージの清潔、それあります当社推奨の制限時間を拡張することが可能。
- このプロトコルで示されているように、人間の組織のコレクションを事前にために必要なすべての材料を準備 (より詳細な製品情報については材料の表を参照してください)。必要なすべてのすべての回で保護具を着用することを確認します。
- 図 1に示すように、ドライアイス スラリーと共にドライアイス バケツを準備します。
- 4 標準的な円形の氷のバケツと 1 つの長方形の氷のバケツを埋めるに十分なドライアイスを粉砕します。標準バケットのいずれかが小 (11 x 21 cm) 所あるはず組織がドライアイスの表面に配置されます。可能であれば、研究所組織の新しい、未開封のボックスを使用します。
- きれいな長方形の氷バケットにドライアイスの 2 L を粉末化によってドライアイス スラリーを作る。
- ドライアイスの表面にあらかじめ冷やした 2 MB を追加します。少しミックス、長方形のバケツの側面に沿ってドライアイスのより大きい部分に囲まれたチャネルにスラリーの面形状にピペット チップ ボックス カバーを使用してスラリーを平らにします。
- ドライアイスより急速凍結を奨励するための氷のバケツの縁に沿っていくつかの薄いブロックを配置します。≥4 時点でドライ氷スラリーのバケットに緩くフィットする基本型のための部屋があるはずです。
- 必要に応じて、スタック内で別の長方形の氷のバケツの氷のバケツはドライアイスと満たされました。この位置よりドライ氷スラリーを分離するのに役立ち、プロシージャの間にドライアイスと 2 MB の頻繁な調整の必要性を防ぎます。
- 次の順序で組立ラインにおけるドライ氷バケットの位置: ドライアイス 1) スラリー バケツ、2) 研究所組織ドライ アイス用バケツ、3 & 4) 通常乾燥の氷のバケツ、バケツ 5) 長方形のドライアイス (図 1A)。
2. フラッシュ冷凍人間の腸組織の準備
メモ: このプロセス全体は、腸組織の質によって、腸内のセグメントあたり 45 80 分間かかります。また、RNA の品質および LCM に進む前に組織を評価する品質管理サンプルの収集をお勧めします。
- 濡れた氷と大きなトレイを埋めるし、ドライアイスの上に手術用まな板を配置します。
- このセットアップでコールド ストレージ ソリューションに組織とトリミングされたセグメントを格納するための 500 mL と 100 mL ビーカーを冷やします。組織を受信する準備ができているので、あらかじめチル ベースをカッティング ボードに成形します。
- 新鮮な腸組織を受信すると、組織は運ばれるメディアを注ぎ、あらかじめ冷やしたビーカーでそれを保持します。腸組織、以降の手順で準備がトリミングされたセグメントの一時的なストレージのためのこれらのビーカーでいくつかの部屋を残してください。
- 腸内のセグメントをダウン ストリーム アプリケーションの RNA を生成する十分な組織 (40 ~ 60 cm2) と品質コントロールのサンプルを提供しています約 20 cm の長さにカットします。組織の整合性によって (すなわち腸の 5 cm) はるかに小さい長さとダウン ストリーム処理のための RNA の隔離を達成するために実行可能な場合があります。
- 離れて脂肪と手術用のはさみを使用して腸から膠原病をトリミングします。腸の漿膜に沿って脂肪残留は、以降の手順で組織を完全に平坦化機能を妥協します。構造的に筋間神経叢の損傷または区分のため均等にフラット化組織の外観を作ることができます脂肪と結合組織の除去中に漿膜を傷つけないでくださいするために、組織を慎重に切り落とします。
- 腸間膜の添付ファイルのサイトでできれば腸のサンプルの全体の長さに沿って縦切開を確認します。
- 先を解剖し、緊張から解放されてより容易にフラット化、大腸から大腸菌を破棄します。
- 冷製のまな板の上にダウン腸粘膜側をスプレーし、ティッシュの完全な長さから 1.25 cm 幅のストリップをカットします。
注: このサイズをそれに応じて調整する必要がありますので、腸組織はトリミング後、よく展開します。 - 冷蔵組織ソリューションにストリップを一時的に格納します。
注: 我々 は比較的優れたコスト パフォーマンスは、長い貯蔵寿命を持って、必要になるまで室温で保存することができますのでベルザー UW コールド ストレージ ソリューションを使用します。 - コールド ストレージ ソリューションから組織のストリップを外し、セグメント ~1.5-2 cm の長さに切る。
- すぐに余分な液体を削除し、フラッシュ凍結中に腸の漿膜に沿って氷結晶の形成を防ぐために、研究室のワイプのスタックの腸管をしみ。組織が十分に乾燥しない場合それは筋間神経叢から高品質のセクションを取得することは困難になります。
- 中古冷蔵, 大規模な, 使い捨てプラスチック ベース金型 (37 × 24 × 5 mm) ブロッティングの腸の部分の粘膜側が横たわっていた。
- 慎重に軽く優しく押し、漿膜の下に閉じ込められる可能性があります任意の気泡を追放するカーブタイプ鉗子を使用して基本金型の表面に組織をストレッチして各セグメントを平らにします。組織をフラット化しながら拡大するに注意してください。必要に応じてセグメントをトリムし、小さいサイズで残りのサンプルをカットします。
注:組織がオーバー ストレッチの場合これは筋間神経叢を歪めます。すべての空気の泡を削除した後に前に凍結試料の厚さを評価します。必要な場合は、腸内のサンプル、元の厚さに近づくまで試験片内側のエッジを押し込みます。 - ドライアイス、2 MB のスラリーのサーフェイスに読み込まれた基本型を置きます。組織が 30-60 秒、サイズと腸内のセグメントの厚さに応じて内で完全に固定します。
- ドライアイスの 2 番目のバケットであらかじめ冷やして研究所組織の基本金型をすぐに擦って残留 2 MB を削除する基本型の底を乾燥させます。
- ドライアイスの 3 番目の浴槽に乾燥したサンプルを転送し、ラップする準備ができるまでドライ氷の表面の下でそれを埋めます。
- すぐに折り返し、試料の品質を調べる前に基本型の底を観察します。これらセクショニング メーター パネルおよび LCM を避けるべきである、フラットに表示のない、または大きい空気泡、サンプルのメモしておきます。
- 完全に凍結を秘められながらティッシュの折り返しが行われるように、バケツにドライアイスの上に配置される事前ラベル付きアルミ箔でサンプルをラップします。
- -80 ° C で保存中の組織の脱水症状を最小限に抑えるためのプラスチック製のラップの層でサンプルをラップします。
- 冷凍庫に移動する準備ができるまでは、長方形のバケツでサンプルを格納します。
- 事前にラベルを付ける、事前コレクション後のサンプルの-80 ° c の即時ストレージ用冷凍ボックスを冷やしなさい。
- LCM を行う前に RNA の整合性の評価のための腸管各部位からのティッシュの小さい部分を取る。
- 前のラベル、各セグメントの 2 mL RNase フリー チューブ換散バッファーの ≥500 μ L でいっぱい。我々 は RNA 抽出キット材料の表に記載されている"D"を使用してお勧めします。
- 標準組織マイクロ ホモジナイザー (20-40 秒、組織塊がなくなるまで) 腸の小さな (2 mm × 2 mm) 作品をホモジナイズしてください。その後、RNA の抽出に進むまでドライアイスと-80 ° C でストアのライセート RNA を凍結します。
- 必要に応じて、バックアップとして組織凍結培地 (TFM) で一部のセクションを埋め込みます。このセクションに記載されている正確な同じ方法でティッシュ セクションの準備が、TFM でフラッシュ凍結前に基本金型内のサンプルが水没します。
3. セクショニング
- セクショニング、前に染色と脱水のためのすべての必要な材料を準備し、ドライアイスの入ったバケツに-80 ° C のフリーザーから目的の組織サンプルを転送します。
- 最適な切削温度 (-18-22 ° c) を設定して 100% エタノールで表面を拭き、ブレードの治療で使用用クライオスタットを準備し、RNase 除染液でトレイをブラシします。
- 最高チャックにサンプルを付着するには、次の方法を使用します。
- 少なくとも 30 のドライアイスに鉗子を置く s 腸サンプルを開けるとドライアイスの漿膜側を表面に置くことの前に。
- 大型クライオスタット試料ホルダーに組織凍結媒体 (TFM) の 3 ~ 5 mm のマウンドを注ぐし、すぐに転送、腸サンプル漿膜側-アップ、TFM に。
- 室温で 2-5 秒のサンプルに付着する TFM を可能にした後ドライアイスと粉々 になったドライアイス カバー試料ホルダーをすばやく転送します。筋間神経叢の平面より下、TFM が残っていることを確認します。
注: 理想的には、腸粘膜の外側の表面は完全準拠、TFM、TFM が試料の融解せず凍り始める前に。
- クライオスタットの試料ヘッドに試料ホルダーをマウントし、筋間神経叢の平面は切刃を平行になるように、クライオスタットの刃で供試体を合わせます。
- 8 μ m のクライオスタットの断面の厚さを設定します。試料を完全に位置合わせの目的筋間神経叢に各スライドに最大可能な表面積を得ることです。この厚さは人間および齧歯動物の組織の一般的にお勧めしますが、必要に応じて調整することができます。
- 漿膜や筋間神経叢に到達するまで縦の筋肉を介してセクション。
- 筋間神経叢をスライドのサンプル セクションをマウントし、 1% クレシル バイオレットやトルイジン ブルーなどなどの水性染料のセクションを染色します。
- 縦走筋層間の接合部を識別するために 40-2000年倍の倍率の顕微鏡の下でセクションを表示します。顕微鏡のパラメーターは、テーブルの材料で提供されます。セクショニングの開始、漿膜結合組織の存在によってマークされます。いくつかの残りの腸間膜の脂肪は、漿膜に沿って存在もあります。外側の縦走筋層のシートを開始します。縦走筋層間の境界に達すると、腸の神経節の部分が観察されます。
注: 次のいくつかのセクションで筋間神経叢になります (図 2C) 1 つのセクション内に存在する神経節の大 swaths で非常に明白。組織は、セクショニングの開始時は完全にフラットではない、神経節の部分にだけは指定された時間に各セクションに存在ものになります。時に、腸内のサンプルは、にもかかわらず、完全にフラットに表示される組織の本質的に不均一な腸管神経叢にあります。これは十二指腸のサンプルの特に当てはまります。我々 の経験でこれらのサンプルは、LCM で処理するため時間がかかりますが、十分な RNA は 1 日のセッション内で収集することができます。筋間神経叢の正確な位置は、サンプル組織および凍結する前に準備をによってかなり異なります。
- ニューロンとグリア スライドごとの最大数を提供する最適なコレクションで、最小公倍数の連続切片を収集を開始します。サンプルの表面積によって単一のペン膜スライド上に複数のセクションを結合できます。
- ペン膜スライド、5-10 s 用クライオスタットで簡単に冷蔵にセクションをマウントします。マウントするとき、組織が RNA の整合性を最大限に維持、わずかに溶かします。
4. 染色
注: 染色プロセスの概要については、表 1を参照してください。使用されるすべてのソリューションは、標準的な 50 mL コニカル バイアル用意しています。RNase 除染液をチューブの外側の治療は、(データは示されていない) の結果を改善するためには表示されません。
- 少なくとも 1 日前 95% エタノールの 4% クレシル バイオレットの飽和溶液を準備し、完全に再注射器をロードする前にクレシル バイオレットを中断します。
注: ディスカッション セクションで説明するよう、エタノールの濃度は効果的な汚損のため低下する必要があります。我々 は RNA の整合性を削減大幅に染色時に 50% または 75% エタノールを使用しているかどうかをテストしていません。クレシル バイオレットは、光に敏感なしたがって、光から保護する必要があります。 - 筋間神経叢にスライドにセクションをマウントした後すぐに 30 (-20 ° C であらかじめ冷やして) 95% エタノールの円錐形の瓶でスライドを水没 s。
- セクションは、前の手順では、スライドに完全に付着しなかった場合、は、手袋をはめた手で (研究所拭く必要があります配置間スライドをして手袋)、95% エタノールに水没する前に完全な固執のスライドの下部やや暑い。このソリューションは、RNA の整合性を低下させることがなく、少なくとも 3-6 スライドの再利用することができます。
- スライドの顔アップを前処理、RNase フリー コンテナー8頂上置かれたラボ ワイプに横たわっていた。
- 事前に記入 3 mL シリンジ 4% クレシル バイオレット、0.2 μ m のシリンジ フィルターを取り付けます。
注:セルロース アセテート フィルターをお勧めします。 - 6-10 滴ティッシュのセクション8に直接汚れを適用し、10-30 秒、または十分な色素まで孵化させなさいとき保持解除ステンド グラスします。染色しながら優しくティッシュ セクションは均等に汚れが塗られることをように手でスライド コンテナーを回転させます。
- 汚れを注ぐし、すぐに解除 75% のエタノールのバイアルのスライドを染色します。サンプルから余分な染料が染みこみ主まで繰り返しスライドが水没します。これは 10-20 秒間かかる場合があります。
- ファイナライズ解除繰り返しを浸すことによって 95% のエタノールのバイアルのサンプル 10 s. 埋没サンプルを繰り返しすべての余分な汚れを削除するまで染色します。
- 大脳基底核の染色を最適化するために、必要に応じては、染め色の期間を変更します。場合はあまりにも多くの汚れを除去すると、サンプルがあまりにも透明になるし、可視化が困難になる場合があります。
注: この汚損のプロトコルはに基づくいくつかの出版物5,8,10,11満足のいく結果が得られた前に、変更を必要とする最適化されています。したがって、染料と染め色のプロセス中に使用されるエタノールの濃度を変更する必要があります、最適な結果を得るため、必要があるとき。
- 大脳基底核の染色を最適化するために、必要に応じては、染め色の期間を変更します。場合はあまりにも多くの汚れを除去すると、サンプルがあまりにも透明になるし、可視化が困難になる場合があります。
5. 脱水
- 2-3 回、10-20 s の合計は、100% エタノールでスライドのディップをすぐに。
- 少なくとも 30 の無水の 100% エタノールでスライドを水没 s。無水エタノールは非常に吸湿性が、水気を吸収し、こうしてより完全に脱水サンプル5プロシージャの開始前に 100% エタノールのバイアルにモレキュラーシーブ (8-12 メッシュ) を追加します。
- 15-20 秒のキシレンのスライドを繰り返し浸しなさい。このステップは完全にスライドのエタノールのレイヤーを削除します。キシレン、余分なエタノールと水分子5を完全に吸着管に早めにモレキュラーシーブを追加します。
注意: キシレン眼及び上部気道への刺激物として分類され、化学の発煙のフードで使用する必要があります。 - 少なくとも 10 分 (分子篩、8-12 メッシュ) とキシレンのスライドが水没します。
注:必要な場合、この手順の後簡単な休憩を取ることが。汚損、LCM や RNA の収量/整合性に悪影響なしで 4-5 時間サンプルはキシレン左することができます。 - 必要に応じて、個別には、この時点でいくつかの追加スライドを準備します。スライドの 2 番目のラウンドを準備して、すべての準備されたスライドに LCM を完了した後、クリオスタットで組織が組織表面の脱水のため refaced する必要があります。4 個に 1 つのセクションは、使用可能なセクションが収集する前に破棄する必要があります。
6. レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM)
- キシレンからスライドを削除し、LCM 顕微鏡ステージに LCM キャップの少なくとも 1 分、カートリッジの挿入のための化学発煙のフードでそれを空気乾燥します。ステージ上にスライドを読み込み、スライドの概要イメージを取得します。
- LCM の目的の場所を特定し、スライド上にキャップを読み込みます。
- 赤外線 (IR) レーザーを合わせ、キャプチャ 20-30 μ m 径をスポットするそのパワーと期間を調整します。
- 紫外線 (UV) レーザーを検索し、適切な切削速度と強度を設定します。
- (緑の円としてソフトウェア プログラムのスライドの概要に示されている) キャップの回収領域の境界内にとどまることを確かめる LCM ソフトウェアを使用して収集する目的の神経節を概説します。
- トレースのそれぞれで、IR スポットごとの 100-500 μ m の少なくとも 1 つがあるような赤外線スポットを調整します。
- すべてのマークされた節のコレクションを続行する IR/UV カット ボタンを押します。
- コレクションを完了すると、cap を新しい場所に移動しコレクション プロセスを繰り返すか、節で (または 60-80 分の推薦された制限時間に到達するまで)、キャップはいっぱい十分にいったん QC 駅で LCM キャップで検査します。
- キャップの破片がある場合は、離れては RNase 除染液と前処理、ヌクレアーゼ フリー水ですすぎ、完全に乾燥する細い絵筆を使用して拭いてください。
- 慎重にキャップを目で確認またはすべての残骸を確保するため明視野顕微鏡の倍率では削除されています。破片を前処理の絵筆の使用によって除去できない (RNase フリー) 罰金のピペット チップを使用して破片を削り。
- RNA 換散バッファー (バッファー RLT から RNA 抽出キット"B"β-メルカプトエタノールを 10 μ L/mL の濃度で追加) の 230 μ L でいっぱい 0.5 mL および microfuge の管にキャップを固定します。
- キャップ、簡潔に渦を反転し、30 分間室温でインキュベートします。
- ドライアイスに 5 分とし、転送、および microfuge の管のためには、5,000 × g ≥ の遠心分離機します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。RNA lysates は-80 ° c 少なくとも 1 週間の RNA の劣化に大きな影響を与えることがなく保存できます。RNA の隔離が同じ日に実行される場合は、抽出の準備ができるまで氷のサンプルを冷やします。 - キシレンからスライドを削除した後に、80-90 分の推薦された最大制限時間内のすべての追加コレクションを実行します。ステータス退避済みのセクションは、周囲の湿度に公開されて、RNases 徐々 に再活性化します。収集期間を制限することで、このような効果を最小化し、RNA の整合性を最大限に維持します。
7. RNA の隔離
- RNA の抽出の RNase フリーのワークステーションを準備します。
- RNA 抽出キットのすべての管およびマニュアルによると試薬を準備します。
注: 次の LCM の RNA の隔離のための多くのキットがある、RNA 抽出キット材料一覧に"B"を使用して最高の成功を収めています。RNA 抽出試薬のサイド ・ バイ ・ サイド比較のため図 5を参照してください。 - -80 ° C のフリーザーからサンプルを削除し、37 ° C の水浴で急速に解凍します。
- すぐに渦解凍ためチオシアン酸塩を均等に分散する 2-3 秒のサンプルです。
- 70% のエタノールの等量と各サンプルを組み合わせます。必要に応じて、十分な RNA 濃度に到達する 2 つ以上の lysates を一緒にプールします。
- Microdissected サンプルのために最適化されたプロトコルを使用して RNA 抽出プロセスのマニュアルを製造元の指示に従って進んでください。
- ヌクレアーゼ フリー水 (14 μ L) の最小の推奨されるボリュームに最後のステップで RNA を溶出します。
- RNA の隔離、次因数新しい各サンプルからの RNA の 1-2 μ L 事前品質評価・品質管理の RNase フリー チューブが付いて、バイオアナライザーなどの RNA の少量を視覚化できるマイクロ流体デバイス。因数高感度 RNA 定量キットと定量化のための別々 のチューブに追加の 1 μ L。
- 下流解析のための RNA の十分な量を取得、必要に応じてこれらの手順を調整 (すなわち。、プールの RNA の抽出前に LCM キャップの大きい数)。
- ストア RNA 下流解析のための十分なサンプルを収集まで-80 ° c。
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Representative Results
RNA シーケンスの基準を満たして、LCM を使用して人間の腸サンプルから腸管神経節の比較的急速なコレクションを有効にする既存のプロトコルをいくつかの改良を行った最初に、我々 は 2 MB (図 1B) にドライアイスのスラリーの表面で置かれた大きい基本金型内の腸組織のセグメントの急速凍結を最適化されています。セクショニングおよび後続の LCM の中に最高の成功は、腸管 (1 b ・ 1 C の数字) を粘膜側に直面している、基本金型内でフラットを置くことによって得られました。基本型がベースでできるだけ平ら任意の曲率は筋間神経叢に断面積の大きなを取得する非常に難しくなることを確認します。このアプローチは、8 μ m の厚み (図 1E) で簡単に断面化し、染色のプロセスから TFM の完全な除去は、組織の結果します。TFM 染色のプロセスと干渉して従って腸管神経節の同定を覆い隠すことがわかった。また RNases12の高いコンテンツを持っている粘膜を通して断面を回避できますこの向きで組織を配置、エタノールの汚れの使用がこれらの RNases を阻害する主の経験から、それが表示されます。場合、TFM や最適な切削温度 (OCT) が必要なまず基本型の下部にサンプルを平らにし、次のこの手順 (図 1D) 金型に、TFM を追加する最も信頼性の高いがあるとわかった。これは、「ウィンドウ」で腸簡単に可視化することができます、試料に合わせやすく、腸管神経叢 (図 1E) に完全に平行になっているセクションを生成を残します。
筋間神経叢 (図 2A) と平行な方向に腸の長さが縦ダウン凍結切片の作製はスライドごと腸内神経節の最も大きい区域は (染色時に表示されているセクションを生成します図 2C). 近づくと縦走筋層 (図 2B) 同格で腸管神経叢 (図 2C)、6-12 連続切片がすることができます (図 2Aを収集腸神経節 (図 2C) の大 swaths を含む縦方向)。LCM キャップは、容量の 1 つのセクション (図 4D) を使用して読み込むことができます。対照的に、新鮮凍結腸 (図 2 a 2 b) の横断面を準備するとき筋間神経叢に各スライド (図 2B) 上に存在の小さな領域だけがあります。非常に少数の腸の神経節は、大きな時間の投資と全体的なサンプルあたりのコストが高いの結果横断切片から収集できます。平行断面アプローチ横断比較 LCM キャップやスライドの数の 5 分の 1 未満を使用してコレクションのプロセスを大幅に短縮します。
LCM、前にサンプルはステンド グラス、LCM コレクション中に RNase 活性を避けるために完全に乾燥する必要があります。RNA の整合性に及ぼすエタノールの汚れと水性の汚れを直接比較する実験を考案しました。この実験では、2 つの腸のセクションは単一のスライドに一緒に搭載されていたし、4 つの方法のいずれかで処理された n = グループあたり 2-3 生物的複製。最初のグループのスライドに新鮮な腸のセクションがマウントされていないとそれぞれは直接事前ドライアイス (図 3A) 冷蔵 RNase フリーの鉗子を用いた RNA 換散バッファーに転送されました。すべての残りのグループのセクションがスライドに付着した、処理、RNase 浄化溶液処理カミソリ刃を使用してスライドを掻き、RNase フリーの鉗子で RNA の換散バッファーに転送。標準のマイクロ ホモジナイザーは、完全にすべてのグループのサンプルを溶解に使用されました。2 番目のグループのスライドはすべてのステップによって処理されたが、染色の手順 (図 3B) の中に染料が使用されていません。グループ 3 は、4% クレシル バイオレット色素 (図 3C) を使用して、上記で説明したプロトコルで処理されました。4 番目のグループでは、水性染色、トルイジン ブルー、トルイジン ブルーとヘマトキシリン (図 3D) の混合物を用いた水性染色キットのプロトコルに従いながら使用されました。RNA を抽出の後前述のように、RNA の品質をバイオアナライザーを評価しました。2 つの水の孵化が追加されたこと、水とエタノールのプロトコルを汚すの唯一の違い (30 s 各)、直前と染色後、吸水と染料の保存のため必要であります。スライドに組織切片を遵守し、(図 3 a 3 b)、RNA の品質のわずかな、やむを得ない削減につながった脱水の手順で処理するプロセスことがわかったが、エタノールの染料で染色、クレシル バイオレットできませんが更にRNA の品質 (図 3C) を減らします。対照的に、水性染料、トルイジン ブルーは内在性の RNase 活性 (図 3D) を可能にする拡張の水溶液曝露による可能性が高いが、大幅に RNA 低下につながった。
腸神経節のユニークな形状は、従来のガラス スライド6 (図 4A) の標準的な IR を最小公倍数の困難をもたらします。ペン膜スライド (図 4B) を使用している場合、サンプルはスライド ガラスの大半から切り離されている薄いシートに付着しました。UV レーザは、サンプルとペン膜、スライド (図 4C) と LCM キャップ (図 4D) の完全遵守から大脳基底核の完全剥離の結果の両方を貫きます。サイズと形状、構造が望まれる (> 10-15 μ m) することができます完全にかつ正確に収集 (通奏 4E-4 H)。セクションごとの少数の節でいくつかのサンプル、キャップがあります移動 ≥ 4 回収集する前に。この場合、2、3 セクションごとにスライドのマウントのペン膜スライドの使用を最小限に抑えます。
RNA シーケンスの LCM のサンプルからの RNA を隔離する、目標はすべて DNA (gDNA) を排除しながら最高の RNA 品質・量を取得します。理想的な RNA の隔離プロシージャを識別するために行ったとの比較 RNA 抽出キット「A」(図 5A)、RNA 抽出キット"B"(図 5B)、または RNA 抽出法"C"の RNA サンプルのクリーンアップRNA 抽出キット"B"(図 5C)。汚損のプロトコル最適化されたクレシル バイオレットとサンプルを処理した後、LCM は縦筋層から採取した腸管組織の標準化された円形サンプル (500 μ m の直径) を収集するために使用されました。各 cap は、ランダムに各キットからそれぞれ換散バッファーの 0.5 mL および microfuge の管の上に配置されている 3 つの RNA の分離グループのそれぞれに割り当てられました。各キットは、RNA 抽出キットで 30 分間、42 ° C で培養を必要とする"A"の換散バッファーを上記のとおりに従っていた。他のキットのため 30 分間室温インキュベーションを使いました。すべてのサンプルは簡単に換散バッファーにさらに vortexed.抽出を行った同じ日まで、氷に冷やしていたサンプル (n = 4)。RNA 抽出キット"B"列の DNA 消化手順が gDNA (5 a ・ 5 C の数字) を効果的に除去しながら最高の RNA の品質と量の結果がわかった。重要なは、腸管神経節 (図 5D) を収集する場合、完全に RNA 抽出キット"B"によって提供される RNA の換散バッファーはキャプチャした神経節を溶かします。
平均して、我々 のサンプル 7.49 ± 0.53 (表 2) の鈴があります。鈴スコア 6-7 を超えると見られる (特定の RNA プロファイル) によって RNA seq13、私たちを与える十分な品質の自信を我々 のサンプルが RNA シーケンスことを考慮して、十分な品質であるこれらのサンプルは、受領後、鈴射程距離は 7.4 9.5 からこれらの結果を示す私たちの最適化されたプロトコルが RNA の整合性の優秀な保存を提供します。RNA シーケンスの送信のサンプルから代表的な RNA 品質結果図形 6A-6 Cで描かれています。RNA シーケンスからの結果は我々 のサンプルが配列された正常にことを示すし、ささやかな 3' 末端バイアス (図 6D) があります。3'-誤差が大きくが低りん14; サンプルで好まれている一般的には、この効果は適度、サンプルに反映されます。それにもかかわらず、観察された遺伝子バイオタイプいた主データの信頼性を示すすべてのサンプル (図 6E) の間で一貫性のあります。
図 1.最適な腸組織の凍結します。描かれている; 順番 (A) 乾燥の氷のバケツを用意私) ドライ氷スラリー、ii) 研究所組織のドライアイス、iii) 一時的なストレージ バケツ、iv) 折り返しバケツ、v) 中古冷凍庫ストレージ バケツ、vi) 中古冷凍庫オーバーフロー バケットの上に配置します。(B) スラリー状のドライアイスと 2 methylbutane の表面で置かれた大きい基本金型内の組織のセグメントの急速凍結を最適化されています。(C) A セグメントは基本金型粘膜側を上向きに平らに置かれたパネル B. 腸に示すセットアップにおいて、完全に凍結標本の近いアップ画像。(D) この凍結法は、同じように組織を準備するが、TFM を凍結する前に基本の型に追加することによって TFM で使用するために容易に適応することができます。結果サンプルでお越しの際にも簡単に視覚化できる漿膜での完全にフラット筋間神経叢。(E) 両方のティッシュの準備方法は、推奨 8 μ m 厚で優れたティッシュ セクションを生成します。TFM の使用手順が示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.腸組織の適切な向きが腸管神経節豊かなセクションを提供します。新鮮凍結腸 (A, B) の標準的な横断面を準備しているとき、筋間神経叢 (B) 各スライド上に存在の小さな領域だけがあります。コストがかかりスライドあたり非常に少数の腸の神経節を収集できます。対照的に、腸管神経叢 (C) 面内方向のセクションを準備する大脳基底核 (C) の多くに大きな表面領域を提供しています。漿膜から起動し、(B) の縦の筋を内側断面筋間神経叢にセクションを取得します。筋間神経叢、縦走筋層 (B) の交差点に近づいて 6 12 連続切片が収集できます。筋間神経叢に各縦セクションには広い範囲腸管神経節 (神経節を優先的に染色するキシレン、なし、変更された汚損プロシージャを使用して、C で表される) にはが含まれます。LCM キャップは、単一組織切片を使用して容量を充填できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.RNA の品質を向上させるエタノール互換染料で染色します。バイオアナライザーによる RNA の品質を測定し、それぞれのグループから 2 つのサンプルの代表の結果が表示されます。初期の RNA の品質は、新鮮なマウントされていないセクション (A, 無治療) から測定、8.65 ± 0.07 の RNA 整合性数 (鈴) を持っていた。マウントされ汚れ (B) ではなくすべてのステップの処理のセクション、凛は 7.95 ± 0.35 です。脱水の手順に追加された 4% クレシル バイオレット染色 7.87 ± 0.35 (C) 平均鈴と鈴に重大な影響があった。比較では、水性の汚れ、トルイジン ブルー (青 T)、(D) の手順に必要な水リンス添加の使用をもたらした 6.45 ± 0.21 の鈴と、大幅に減らされた RNA の品質。各グループから成っていた n 3 生物をレプリケート除いて「いいえ治療」と"T-Blue"(n=2)。厘が報告されますここでは平均 ± 標準偏差として。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.ペン膜 LCM スライドは、腸管神経節の正確なコレクションを有効にします。LCM を介して腸管神経節を収集するために規則的なガラス顕微鏡スライドを使用して不要な組織ピックアップ (A) が発生する傾向があります。赤の円 (直径 30 μ m) は、収集プロセス中に使用される IR LCM スポットのサイズを示します。白い矢印は、隣接する筋組織の部分を引いた節コレクションを示します。ペン膜スライド (B)、サンプルはスライド ガラスの大半から切り離されている薄いシートに付着しました。UV LCM レーザー切断時サンプルとペン膜の両方スライスする神経節神経節形状 (C) に関係なく、スライドからの完全離脱の結果とサンプル (D から削除されたときに、LCM キャップへの付着を完了).任意の構造必要なサイズと形状の ≥10-15 μ m が完全に、正確に収集 [(E)、最初の組織マーク アップ。(F) IR と UV レーザ切断完了。(G) LCM からキャップを外してセクション]、LCM キャップ (H) の可視化。パネル H でまだらのバック グラウンドは、cap に固有であり、望ましくない破片ではないです。パネルE Hの緑の円の青い十字は LCM プログラムの一部である、紫外線と赤外線レーザーのプレース ホルダーは、それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.最適の RNA 分離キットを選択します。3 つの異なる RNA 分離のプロシージャの同時比較後 RNA 整合性結果が表示されます。各グループから代表的な 2 つのプロットが並行して処理のサンプル間で生じる変動を説明するために表示されます。RNA 抽出キット「、」(A) 6.83 ± 0.65 の鈴とサンプルを生産し適度な RNA の収量を用意しており、柱に DNase 消化を行っているにもかかわらず、DNA 汚染傾向があった。RNA 抽出キット「B」(B) の 8.3 ± 0.1 で、最も高い測定鈴結果。フェノール ベースの RNA 抽出法"C"(RNA 抽出キット"B"の RNA サンプルのクリーンアップが続く) をしながら大規模な汚染からの融雪が原因のバンドがあった、(C) gDNA を排除するために登場し、7.5 ± 0.26 の鈴を持っていた、RNA 溶解段階 LCM キャップから接着性ポリマー。さらに、RNA 抽出キット"A"と抽出法"C"からの RNA の収量が RNA 抽出キット"B"によって得られるものよりも一貫して低かった。重要なは、RNA 換散バッファー RNA 抽出キット"B"によって提供されます。(追加された β-メルカプトエタノール) とキャプチャした神経節 (D) を完全に溶かします。各グループは n = 3 の生物的複製と、平均 ± 標準偏差を次に示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.代表の結果。RNA シーケンスの RNA の十分な量を取得私たちサンプルごと腸内神経節の 2 つのキャップをプールする場合 (> 1 ng) 優秀な RNA の品質と共に。8.3 (A)、(B) 7.5 6.9 (C) ・鈴とサンプルの代表的な RNA のプロットが表示されます。RNA シーケンス データは、R (D) 最後バイアス プロットを示しますサンプル シーケンスが正常にして、ささやかな 3' 末端バイアスに実行品質評価プログラムを通じて実行されました。(E) 遺伝子のバイオタイプのプロットはまた結果を配列する主サンプル間で一貫しているを表します。合計では、我々 があった、> RNA シーケンスの使用可能なサンプルの生成の 95% の成功率この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ステップ | 期間 | 目的 |
| 95% エタノール (-20 oC) | 30 s | 固定 |
| 95% エタノールで 4% クレシル バイオレット | 10-30 秒 | 汚れ |
| 75% (繰り返された浸すこと) とエタノール | 15-25 s | 重複染色します。 |
| 95% のエタノール (繰り返された浸すこと) | 5-15 s | 重複染色します。 |
| 100% エタノール | 15 s | 脱水症状 |
| 100% エタノール (無水) | 30 s | 脱水症状 |
| キシレン (繰り返された浸すこと) と | 15-20 秒 | 脱水症状 |
| キシレン | > 10 分 | 脱水症状 |
| 空気乾燥します。 | 1 〜 3 分 | キシレンの蒸発 |
テーブル 1。染色と脱水プロトコルの概要。私たちの最適化された汚損のプロトコルを表します。エタノール-互換性のある染色メモより良い結果を提供している場合クレシル バイオレットを交換する使用できます。いくつかのケースで染色と染め色の期間が延長または短縮する必要があります。一般的に、長く固定時間高速の組織は、完全に染色されます。我々 は同じ組織のセグメントからのスライドを準備する際、3 回までバイアルを再使用した後 RNA 整合性の任意の削減を気づいていません。
| ドナー | 組織 | 鈴 |
| F | コロン | 7.4 7.1, 7.2 |
| M | 回腸 | 7.2, 6.9, 7.8 |
| M | 十二指腸 | 8.2 7.4, 7.7 |
| 回腸 | 7.4、7.6 7.3 | |
| コロン | 7.3、7.8 7.7 | |
| F | 十二指腸 | 7.1, 7.3, 6.9 |
| 回腸 | 7.6、7.9 7.8 | |
| コロン | 7.5、8.0 7.3 | |
| M | 回腸 | 6.9, 6.7, 6.9 |
| コロン | 6.8、6.4 6.6 | |
| M | 回腸 | 7.2, 7.3, 7.6 |
| コロン | 7.7、7.6 6.7 | |
| M | 回腸 | 7.4、7.8 8.3 |
| コロン | 7.0 7.4、7.0 | |
| F | 十二指腸 | 8.3、8.8、8.0 |
| 回腸 | 7.8 8.0、8.1 | |
| コロン | 8.4, 8.6, 7.1 |
表 2。代表的な RNA の整合性結果。このテーブルに表示されるサンプルは全て人間の腸管神経節から得られました。すべての選択したサンプルがある十分な RNA の品質と RNA シーケンス解析の数量。この表に示すすべてのサンプルの平均の凛は 7.49 ± 0.53 です。RiboGreen クワント iT アッセイを用いた RNA 濃度を測定もしこの表で表示されますすべてのサンプルは、当社の RNA シーケンスに必要な最小限の量を満たしている (> 1 ng) 実験。中古増幅手順に応じて、少量を使用できます。しかし、そのようなプロシージャより信頼性の高いサンプルの遺伝子発現に大きな違いをするまたはグループ比較される; 1 つはそこに期待それ以外の場合これらの成果は、いくつかの RNA シーケンス アプリケーションの真の違いをマスクできます。そのため可能であればより多くの材料を開始する通常推奨です。
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Discussion
この手順により、RNA シーケンスの RNA を導出するソースとして多数の腸管神経節の収集の効率化ここでは、私たちが最大限に RNA の整合性を維持しながら、既存のプロトコルで概説されているプロセスを加速しました。この手順のすべてのステップは互いに、そのすべての問題は、研究の開始から排除され、すべてのサンプルが準備されていると同様に互いにできるだけ信頼性の高い RNA シーケンスを取得することが重要です。
プロシージャの発症から RNA の整合性が低下する場合研究室で処理の臓器提供の時に組織のコレクションと組織の領収書との間の時間間隔 (冷阻血時間) が長すぎる場合。この問題を考えると、我々 は高品質の RNA は、冷阻血時間の 24 時間後も腸サンプルからまだ抽出することができます驚いていた。腸のサンプルは冷蔵、コールド ストレージ ソリューションに適切に格納されている、組織の整合性と RNA の品質の最高の保護があります。腸の組織がオルガン コレクション チーム、腸の消化酵素、RNases、この期間中に RNA の品質に影響を与える可能性があります他の分子への暴露を制限するコレクションの時にフラッシュが必要です。我々 は腸の標本は完全にフラッシュされていないときサンプルの鈴大幅減らすことができますこれを発見しました。
腸組織サンプルを準備するための最適化された手順を使用して、我々 は TFM でサンプルの埋め込みを回避することができます。TFM 対話するためエタノールとキシレン腸の神経節細胞の可視化と干渉する暗い茶色の沈殿物を形成するため、我々 は我々 のサンプルから除外することを好みます。ただし、マウスまたは他の種からの腸組織を扱うとき TFM を除外できないことがあります。この場合、弊社で TFM を削除するスライドの付着セクションから実験しました。組織に十分な表面積がある場合 (-20 ° C で冷蔵) エタノールに TFM、鉗子で除去することができますをすばやく修正する転送ピペットでスライドが滴下することができます。スライド上にエタノールを滴下 TFM のエタノールは、複数のスライドを処理されているときに褐変効果を悪化させることができますのバイアル内の蓄積を回避できます。
フラッシュ凍結中に我々 を支持してドライ氷スラリーを用いた 100% エタノールではなく 2 MB、2 MB は、組織の表面で上陸するときに容易に蒸発するので。エタノールは、TFM、簡単に削除することはできません組織ブロックの化学汚泥を形成と組み合わせる場合は特によりゆっくりと蒸発させる傾向にあります。エタノールと 2 MB は、フィズし、小型の凍結容器の凍結時ドライ氷スラリーの少量低比熱容量を持っているので積極的にスプラッタに傾向があります。代わりに、粉々 になったドライアイスで満ちている大きい長方形バケツを使用して、冷却の大質量を組織が凍結されている間に、温度の変動を防ぐことができます。
前述のように、時々 他と関連したいくつかの組織サンプルから腸管神経節の連続シートを取得する簡単です。当然のことながら、LCM の全体的な速度は、ソース組織またはサンプリングされる腸地域の特性に応じて可変性の対象です。このため、勧め多くの場合発症多く新鮮凍結試料を準備します。我々 は一般的に腸 (~ 2 cm × 1.5 cm、それぞれ) のセグメントあたりのサンプル数 20 の合計は下流のアプリケーションに十分な RNA を提供するよりもはるかに十分なを発見しました。ただし、腸組織の小さな長さだけの場合我々 は 5 cm の最小の長さをお勧めします。我々 のアプローチで得られる最低の降伏、さらに後述の RNA の 18-30 ng から範囲になります。最小 5 cm 長さ潜在的削減できます、アプリケーションによっては、cDNA プリアンプの多量を使用する場合に特に。これらのパラメーターは、現在の研究ではテストされていません。たとえば、腸管神経節 qPCR4で使用する全層腸生検 (2 cm × 2 cm) から収集されました。
本研究では我々 が示すようクレシル バイオレット、エタノール互換染料の使用は、水性染色、トルイジン ブルーよりも RNA の整合性のより良い保護を提供しています。エタノールに浸漬、RNases 非アクティブ5,15になります。ただし、RNases まだ7,15を水に一度公開されている機能を取り戻すことができます。水性染料で染色しているとき、組織はほぼ 1 分9、実質的な RNA の劣化につながるためのヌクレアーゼ フリー水にさらされる必要があります。トルイジン ブルー組織染色を使用している場合ためできませんでした前に、と染色後の水への露出を減らすことができるそのような変更も減少吸収と保有トルイジン ブルー、それぞれ。また、ヘマトキシリン昇華9同様の問題が発生しました。ここで説明した修正されたプロトコル、クレシル バイオレット染色を避けられます水、腸内の試料を直接露出により最大限に RNA の整合性を確保します。これらの結果は、染色液で追加の RNase 阻害剤の必要性を排除します。このような阻害剤が吸収と染料の保存で干渉と水性染料、トルイジン ブルーの使用を有効にするに有効ではないことがわかった。
当初私たちの汚損のプロトコルを最適化しているとき私たちは他のプロトコルで得られた結果を再現することができませんでしたし、5,7,8,11を報告します。これの理由が明確な矛盾した染料の通風管および保持につながったいくつかの要因がわかった。たとえば、特定のプロトコルが 100% エタノール8または 75% エタノール5クレシル バイオレットを使用して組織を染色して正常が染料だけで神経節をかすかにラベルまたは高の背景にあったと比較してクレシル バイオレット 95% エタノールの。最後に、クレシル バイオレット染色液で使用の割合も非常に重要です。ほとんどのプロトコルでは、1% クレシル バイオレット ソリューション7、8をお勧めしますが、この濃度は 2 分のためのセクションを染色後も私たちの手で信頼性の高い染色を提供しなかった。クレシル バイオレット11滅菌注射器フィルター8を通して試料に適用される 4% 明らかに飽和染色液で染色最高の成功を持っていた。この飽和溶液サンプルのはるかに急速な染色、わずか 10-15 s にチルドの 95% エタノール (-20 ° C) でのサンプルの前の固定により汚れをより急速に普及します。
別のレポートは、75% エタノール ソリューション5エオシン クレシル バイオレットを結合するとき新鮮凍結ひと腸内セクションで最もはっきりと、腸管神経節染まっていた発見しました。しかし、我々 は発見エオシン難しく神経を識別するために、そのクレシル バイオレットは、単独で、優れている検出を提供しています。別の研究では、バッファリングされたクレシル バイオレット ソリューションが子宮体癌組織10染色の一貫した結果を提供したことがわかった。しかし、我々 は、これは人間の腸組織の任意の改善を提供しなかった、また実装できなかった染色液に 95% のエタノールを使用する場合を発見します。
私達はプロトコルことができます一時停止し、後で再開の条件の数をテストしました。多くのプロトコルでは、事前にスライドをセクショニングおよび再スライド5,9取付直後後-80 ° C で凍結を示唆しています。このアプローチは、染色、LCM はできる優れた柔軟性を備えた次の週内は再開し。ただし、だけでなくでしたこの大幅に干渉の汚損;それはまた我々 の手 (データは示されていない) RNA 整合性を減少させた。この問題を回避する、グローバーらは、染色し、11冷凍庫で保存する前にセクションのステータス退避をお勧めします。このアプローチでスライドはステンド グラス、(表 1) のように 100% の無水エタノールのステップ (プロトコル セクション 5.2) まで水分を取り除かれます。サンプル 10 分 100% 無水エタノールの第 2 バイアルで孵化しをドライアイスで冷やして、-80 ° C のフリーザーに転送乾燥ゲルと円錐管に即時に転送されます。冷凍庫からサンプルを削除、スライドはすぐに 30 s の前に乾 100% 無水エタノールに浸漬 LCM11を実行します。残念ながら、私たちの手でこのアプローチは 0.6 から 0.8 (データは示されていない) で鈴を削減しました。我々 したがって、私達の条件で最大の RNA の整合性を得るために同じ日にすべての断面、染色、LCM を実行する手段。これは時間のかかるプロセスであると証明するが、丸一日の作業の間に 10-14 LCM キャップを塗りつぶすことができます。
一時停止できる私達のプロトコルで最も信頼性の高いポイントはキシレン潜伏ステップです。スライドは、RNA 整合性に対する明らかな効果なし 4-5 h までの (分子ふるい) をキシレンに残されています。我々 は、3 つのスライドに一度に準備は、すべてで処理できる LCM この期間内時間の休憩が必要な場合も発見しました。代わるオプションは真空 exicator16、内染色と脱水の手順後スライドを脱水するが、我々 はまだこの方法を実行していません。
RNA の隔離はまだ最も重要なプロシージャに別の重要なステップが要因: RNA、RNA (小さい RNA 種を失わず)17,18, の完全なスペクトルを保持の最大可能な収穫を得ることと17サンプルからゲノム DNA を完全に排除。私たちの手で RNA 抽出キット"B"は、大きな利回りを提供し、ゲノム DNA 除去でより効率的にされたのサンプル、最善の結果を提供しました。RNA 抽出試薬の利回りの違いについての我々 の観察は、事前レポート17,18と一致しています。しかし、他の RNA 抽出試薬19,20の成功を報告している多くの LCM 研究もあります。事前報告も小さな RNA 分子は、RNA の沈殿物の時に清に失われることと、列に基づく RNA 抽出プロセスがフェノール ベースの RNA の抽出方法18より小さな RNA 分子のより良い保持を提供することを示す手順を実行します。
追加された β-メルカプトエタノールを使用しため RNA 換散バッファーは LCM キャップ (図 5D) からすべてのキャプチャされた節を取除くことで非常に効果的なことを見ました。一方、ほとんどの LCM のプロトコルは、ボルテックス ライセートをお勧めしません、我々 は、これが優秀な結果を生成して、RNA の劣化は発生しませんを発見しました。また RNA の抽出用のキャップから解放されるすべてのキャプチャされた節さらに大きな可能性を提供します。これらのメソッドを使用すると、我々 は一般的にどのように多くの神経節は指定したスライド上に存在によっての腸組織の 1.8 に 18 ng/cm2の範囲の腸管神経節の LCM から RNA 収穫を得る。私たちの RNA シーケンスの手順 10 ng RNA の最低限入力が必要ですが、他のプロシージャは、入力シーケンス処理に中古増幅回数が含まれている場合多くの低い RNA を持つことができます。準備とフラッシュ凍結過程から格納されている組織の総面積は 40-60 cm2、cDNA ライブラリの準備と低入力 RNA シーケンス アプリケーション十分な RNA を提供します。
私たちの手順は全腸管の神経節のコレクションのためにデザインされています、アプローチ容易に変更できます、ニューロンやグリア細胞のコレクションの5を希望する場合。ただし、密集グリア処理するため ENS、グリア細胞 RNA の ensheath ニューロン含まれますキャプチャされた神経細胞の RNA と共に低い数ではあります。低コピー数で表現される神経の成績証明書を識別しようとしたとき、問題が発生します。単一細胞 RNA シーケンスこの点では、最高の精度と検出を提供していますが、腸の組織から分離した、パン神経マーカーで染色、フローサイトメトリー21分離または全体腸から識別されてするニューロンが必要です。バイオインフォマティクスとアプローチを並べ替えた後の状態。ほとんどの解離研究の欠点は、ほとんどのプロトコル必要サンプル部屋の温度やトランスクリプトーム3を変更する知られている長時間、37 ° C で培養することです。最近では、マウスの組織の単一細胞懸濁液の生成のバチルス リチェニホルミス由来低温活性プロテアーゼを使用されているし、4 ° C22人体組織の解離のこの酵素を適用することがあります。このような最適化処理が完了するまで、新鮮な冷凍人間組織の LCM は腸管神経節など末梢神経系要素の発現プロファイリングの RNA をキャプチャする強力な手段です。
要約すると、我々 は人間の腸管神経節から RNA のコレクションの信頼性と一貫性プロトコルを開発しました。我々 は、人間の腸組織、染色、LCM プロセス、および多数の出版物およびプロトコルに基づく RNA 抽出の準備を最適化してきました。RNA シーケンスの十分な RNA の品質の RNA のサンプルの収集にこのアプローチの信頼性もわかってきましたこのプロトコルは、消化器疾患の数と患者から採取した組織に広く適用できるし、新規治療法の開発のための信頼性の高い戦略を提供することにより、齧歯動物モデルで使用するために容易に合わせることができます。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
この作業を可能にした家族とドナーに感謝しております。我々 はまた国際医学研究所と本研究で使用される組織の座標のコレクションを助けるためテネシー州ドナー サービスのスタッフの援助を感謝しています。この作品は、健康の国民の協会、NIH OT2-OD023850 EMS2と奨学金支援に AMZ に NIH から T32 DK007673 からの補助金によって支えられました。LCM 楽器およびティッシュの準備についてのアドバイスへのアクセスのヴァンダービルト並進病理学共有リソースのスタッフに感謝しております。ヴァンダービルト組織病理学共有リソースは、NIH 助成金 P30 CA068485 14、U24-DK059637-13 によって一部サポートされます。ゲノム解析のヘルプありがとうワシントン大学医学部遺伝学教室で、ゲノム技術センター。GTAC サポートは部分的に NCI 癌センター サポート助成金 #P30 CA91842 Siteman がんセンターに、センターから ICT/CTSA グラント #UL1TR002345 研究リソース (傘下)、国立機関の健康 (NIH)、および NIH のコンポーネント医学研究のためのロードマップです。この出版物は著者の責任と NIH 傘下の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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