Optimización del Microdissection de la captura de láser para el aislamiento de los ganglios entéricos de tejido humano fresco congelado

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el sistema nervioso entérico, como el perfil de expresión de los ganglios entéricos en los intestinos de los seres humanos adultos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para obtener altos rendimientos de ARN de los ganglios entéricos humanos mientras se conserva al máximo la calidad del ARN. Comience con el tejido intestinal cortado en longitudes de 20 centímetros.

En primer lugar, recorta el tejido adiposo y conectivo. Evite morder la serosa, lo que puede provocar daños estructurales en el plexo mientérico. A continuación, realice una incisión longitudinal a lo largo de toda la muestra recortada, preferiblemente en el sitio de fijación mesentérica.

Luego, disecciona y desecha las taeniae coli del colon para que el tejido pueda aplanarse. Ahora, extienda el intestino, con la mucosa hacia abajo, sobre una tabla de cortar fría. Luego, corta tiras de 1,25 centímetros de ancho a lo largo de todo el tejido.

A medida que se cortan, transfiera cada pieza a una solución de almacenamiento de tejido refrigerada para un almacenamiento temporal. A continuación, corta cada tira en segmentos de dos a 1,5 centímetros de largo. Después de cortar una tira en gajos, séquelos para secarlos.

Es importante que el tejido esté muy seco para que no se formen cristales de hielo en el tejido cuando se congele. Ahora, coloque los trozos secos de tejido, con la mucosa hacia arriba, en un molde de plástico frío y desechable. Luego, aplana cada pieza con pinzas curvas para eliminar las burbujas de aire atrapadas.

Los tejidos se expandirán a medida que se aplanen. Después de aplanar los segmentos de tejido, evalúe su grosor antes de congelar. Si es necesario, empuje los bordes de la muestra hacia adentro hasta que la muestra intestinal se acerque a su grosor original.

Ahora, transfiera el molde base cargado a una suspensión de hielo seco y 2-metilbutano. El tejido debe congelarse por completo en 30 a 60 segundos. Luego, seque inmediatamente el fondo del molde con toallitas frías que se hayan mantenido en hielo seco.

Ahora, revisa la muestra. Tome nota de las muestras que no parezcan planas. A continuación, envuelva el molde en papel de aluminio que haya sido preetiquetado y enfriado antes de usar.

Luego, cubra el papel de aluminio con una capa de envoltura de plástico para minimizar la deshidratación. Mantenga las muestras en hielo hasta que puedan almacenarse a menos 80 grados centígrados. Después de preparar los materiales requeridos, vierta un montículo de tres a cinco milímetros de TFM en un soporte de muestras de criostato grande e inmediatamente transfiera la muestra intestinal, con el lado serosa hacia arriba, al TFM.

Después de unos segundos a temperatura ambiente, transfiera el portamuestras a hielo seco y cúbralo con hielo seco en polvo. Antes de cortar, asegúrese de que el TFM esté por debajo del plano del plexo mientérico. A continuación, monte el soporte de muestras en la cabeza de la muestra de criostato y alinee la muestra con la cuchilla de criostato.

Haga que el plano del plexo mientérico sea paralelo a la cuchilla de corte. Ahora, haz secciones de ocho micras a través de la serosa y el músculo longitudinal hasta llegar al plexo mientérico. Para localizar el plexo mientérico, monte una muestra y tíñala con un tinte acuoso, como el violeta cristalino al 1%.

Para continuar, identifique la unión entre las capas musculares longitudinales y circulares. Al comienzo de la sección, la serosa se marcará por la presencia de tejido conectivo. Parte de la grasa mesentérica restante también puede estar presente a lo largo de la serosa.

Luego, la capa de la capa muscular longitudinal externa se hace visible Una vez que se ha alcanzado el límite entre las capas musculares longitudinales y circulares, se observará una porción de los ganglios entéricos. En las siguientes secciones, el plexo mientérico se hará muy evidente con grandes franjas de ganglios presentes dentro de una sola sección. Ahora, recoja secciones en serie para la microdisección con captura láser.

Enfríe las correderas PEN en el criostato durante cinco a 10 segundos y utilícelas para montar las secciones. Las mejores secciones tendrán muchas neuronas y glía. Ahora, proceda a teñir y luego deshidratar las secciones como se describe en el protocolo de texto.

En preparación, inserte un cartucho de tapas LCM en la platina del microscopio LCM. A continuación, cargue la diapositiva de muestra en el escenario y obtenga una imagen general de la diapositiva. Identifique la ubicación deseada para LCM y cargue una tapa en la corredera.

A continuación, alinee el láser infrarrojo y ajuste la potencia y la duración del láser para obtener un punto de captura de 20 a 30 micras de diámetro. A continuación, delinee los ganglios que desea recolectar. Asegúrate de permanecer dentro del límite del área coleccionable en la gorra, que se muestra como un círculo verde.

Para cada uno de los ganglios delineados por una traza de corte UV, ajuste los puntos IR de modo que haya al menos un punto IR cada 100 a 500 micras para asegurarse de que todos los ganglios se recojan cuando se levante la tapa de la muestra. A continuación, pulse el botón IR UV Cut para proceder a la recogida de todos los ganglios marcados. Una vez que se completen las recolecciones, mueva la tapa a una nueva ubicación y repita el proceso de recolección.

Esto se puede repetir durante 60 a 80 minutos. Cuando la tapa LCM esté cargada con suficientes ganglios, transfiérala a una estación de control de calidad. Si hay residuos en la tapa, límpiala con un pincel de punta fina que haya sido preparado para el uso de ARN.

Utilice una punta de pipeta para cualquier residuo difícil de eliminar. A continuación, fije la tapa en un tubo de microfuga de 0,5 mililitros lleno de 230 microlitros de tampón de lisis de ARN. Invierta la tapa, vórdela brevemente y luego incube la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Posteriormente, centrifugar la muestra durante cinco minutos a 5.000 g o más rápido, y luego transferir el tubo de microfuga a hielo seco. La muestra ya está lista para la extracción del ARN. Al extraer dos tapones de ganglios entéricos por muestra, se obtuvo más de un nanogramo de ARN, suficiente para RNA-Seq, y el ARN fue de excelente calidad.

La integridad del ARN de la muestra mostrada es 8,3. También se recolectaron muestras con números de integridad de 7.5 y 6.9. En total, más del 95% de todas las muestras preparadas han sido lo suficientemente buenas para RNA-Seq.

La calidad de los conjuntos de datos de RNA-Seq se evaluó utilizando una tubería bioinformática. El sesgo final indica que las muestras se secuenciaron con éxito y solo tenían un modesto sesgo de tres extremos primos. Un gráfico de biotipo de genes muestra que los resultados de la secuenciación fueron en gran medida consistentes.

Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para recolectar réplicas biológicas de ARN de ganglios entéricos de suficiente calidad y cantidad para RNA-Seq en tan solo ocho a 12 horas. Al intentar este procedimiento, es importante que las muestras intestinales humanas se congelen lo más planas posible. Esto asegurará que pueda recolectar secciones transversales muy grandes de ganglios entéricos humanos que se procesan rápida y fácilmente con microdisección de captura láser.