Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

Resumen

Vesícula sináptica (SV) ciclismo es el mecanismo principal de comunicación intercelular en las sinapsis neuronales. Liberación y absorción del tinte de FM son los medios primarios de análisis cuantitativo de la SV endo - y exocitosis. Aquí, comparamos todos los métodos de estimulación para conducir bicicleta en la sinapsis de Drosophila Unión neuromuscular (NMJ) modelo FM1-43.

Resumen

FM colorantes se utilizan para estudiar el ciclo de la vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfipáticos tienen una cabeza hidrofílica y cola hidrofóbica, haciéndolos hidrosolubles con la capacidad reversible entrar y salir de bicapas de lípidos de membrana. Estos tintes styryl son relativamente no-fluorescentes en medio acuoso, pero causa la inserción en el prospecto externo de la membrana plasmática una > 40 X aumento en fluorescencia. En las sinapsis neuronales, tintes de FM son internalizados durante la endocitosis SV, víctimas de la trata dentro y entre piscinas SV y lanzado con exocitosis SV, proporcionando una potente herramienta para visualizar etapas presinápticas de la neurotransmisión. Un modelo genético primario de desarrollo de sinapsis glutamatérgica y de la función es la Drosophila Unión neuromuscular (NMJ), donde FM teñir la proyección de imagen se ha utilizado extensivamente para cuantificar la dinámica de la SV en una amplia gama de condiciones mutantes. La terminal sináptica NMJ es fácilmente accesible, con una hermosa gama de grandes botones sinápticos ideales para aplicaciones de imagen. Aquí, comparar y contrastar las tres formas de estimular la Drosophila NMJ conducir dependiente de actividad FM1-43 tinte absorción/release: aplicación 1) baño de alto [K⁺] despolarizar los tejidos neuromusculares, 2) nervio motor electrodo de succión estímulo para despolarizar el nervio presynaptic terminal y 3) objetivo expresión transgénica de channelrhodopsin variantes para el control espacial, estimulado por la luz de despolarización. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas para el estudio de los efectos de la mutación genética en el ciclo SV en la Drosophila NMJ. Vamos a discutir las ventajas y desventajas para ayudar a la selección del enfoque de estimulación, junto con las metodologías específicas para cada estrategia. Además de la proyección de imagen fluorescente, tintes de FM pueden ser photoconverted a las señales de electrón-densos visualizados mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para estudiar mecanismos de ciclo SV a nivel ultraestructural. Proporcionamos las comparaciones de confocal y microscopia electrónica de la proyección de imagen de los diferentes métodos de estimulación de la NMJ de Drosophila , para ayudar a guiar la selección de futuros paradigmas experimentales.

Introducción

El modelo glutamatérgica y sinapsis maravillosamente caracterizada Drosophila Unión neuromuscular larvaria (NMJ) se ha utilizado para estudiar la formación de sinapsis y función con un vasto espectro de perturbaciones genéticas¹. El terminal de la neurona de motor consiste en múltiples ramas del axón, cada uno con muchos botones sinápticos ampliadas. Estas várices de gran capacidad (hasta 5 μm de diámetro) contienen toda la maquinaria de la neurotransmisión, incluyendo vesículas sináptica glutamatérgica uniforme (SVs; ~ 40 nm de diámetro) en la reserva citosólica y fácilmente liberable piscinas². Estas vesículas....

Protocolo

1. larvas pegamento disección

1. Mezclar bien 10 partes de elastómero de silicona base con 1 parte de elastómero de silicona curado a agente del kit del elastómero (Tabla de materiales).
2. Capa de cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y el cura sobre una placa caliente a 75 ° c durante varias horas (hasta que ya no es pegajoso al tacto).
3. Coloque un cubreobjetos de vidrio solo revestimiento de elastómero en la sala de disección de cristal plexi a medida (figura 1, abajo) en preparación para la disección de la larva.
4. Preparar las pipetas de pegamento de tubo capilar de vid....

Resultados

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para el tinte de FM dependientes de la actividad de protocolo. El experimento comienza siempre con la misma disección cola larvaria, independientemente del método de estimulación utilizado posteriormente. Figura 1a es un diagrama esquemático de una larva disecada, el cordón nervioso ventral (VNC), irradiando los nervios y hemisegmental repetido patrón de músculo. La VNC se retira y la prepa.......

Discusión

Alta estimulación despolarización salina [K⁺] es por lejos el más fácil de las tres opciones para teñir de FM dependientes de actividad ciclismo, pero probablemente la menos fisiológica²⁹. Este sencillo método despolarizan cada célula accesible en el animal entero y por lo tanto no permite estudios dirigidos. Es posible aplicar localmente alta [K⁺] solución salina con una micropipeta, pero esto todavía despolarizar pre/postsynaptic células y probable glia sinapsis asociadas

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de elastómero de silicona SylGard 184	Fisher Scientific	NC9644388	Para poner en cubreobjetos para disecciones
Cubreobjetos de microscopio 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Para poner SylGard en disecciones
Placa calefactora superior de aluminio tipo 2200	Thermolyne	HPA2235M	Para curar el SylGard
Cámara de disección de plexiglás	N/A	N/A	Hecho a mano
Capilares de vidrio de borosilicato	WPI	1B100F-4	Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Extractor de micropipetas basado en láser	Sutter Instrument	P-2000	Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	Para boca y pipeta de succión
P2 punta de pipeta	USA Scientific	1111-3700	Para pipeta bucal
de 0,6 mL Tapón de tubo Eppendorf	Fisher Scientific	05-408-120	Se utiliza para poner pegamento para la disección
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Pegamento utilizado para disecciones
Cloruro de potasio	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Cloruro de sodio	Millipore Sigma	S5886	para solución salina
Cloruro de magnesio	Fisher Scientific	M35-500	Para solución salina
Cloruro de calcio dihidratado	Millipore Sigma	C7902	Para
sacarosa salina Fisher	Scientific	S5-3	Para
solución salina HEPES	Millipore Sigma	H3375	Para solución salina
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Para etiquetar las membranas neuronales
Pincel	Winsor & Newton	94376864793	Para manipular las larvas
Dumont Dumostar Pinzas #5	WPI	500233	Utilizadas durante la disección
7 cm Microtijeras McPherson-Vannas (cuchillas de 3 mm)	WPI	14177	Utilizadas durante la disección
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Temporizador digital fluorescente de tinte estiril
	VWR	62344-641	Para temporizar la carga/descarga del tinte FM
LSM 510 META microscopio confocal de barrido láser	Zeiss		Para la obtención de imágenes de los marcadores fluorescentes
Zen 2009 SP2 versión 6.0	Zeiss	Software para la obtención de
HeNe 633nm	Lasos		Para excitar HRP:647 durante la adquisición de imágenes
Argón 488nm	láser Lasos		Para excitar el tinte FM durante la adquisición
de imágenes Micro-Forge	WPI	MF200	Para pulir al fuego micropipetas de vidrio
20mL Jeringa Slip Tip	BD	301625	Para aspirar el axón para la estimulación eléctrica.
Micro Manipulador (base magnética)	Narishige	MMN-9	Para controlar el electrodo de succión para la estimulación eléctrica
Estimulador	Grass	S48	Para controlar el LED y la estimulación eléctrica
Zeiss Axioskop Microscopio	Zeiss		Utilizado durante la estimulación eléctrica.
40X Achroplan Objetivo de inmersión en agua	Zeiss		estimulación eléctrica y la obtención de imágenes confocales
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Cofactor esencial para ChR2
Microscopio Zeiss Stemi con puerto de cámara	Zeiss	2000-C	Se utiliza durante la estimulación con canalrodopsina
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Se utiliza para la activación de ChR
Controlador LED T-Cube	ThorLabs	LEDD1B	Para controlar la
fuente de alimentación LED LED Cincon	Electronics Co.	TR15RA150	Para alimentar el medidor óptico de
potencia y energía	ThorLabs	PM100D	Para medir la intensidad del LED