Aquí, presentamos un protocolo para matrices de anticuerpo para identificar alteraciones en las vías de señalización en distintos modelos celulares. Estos cambios, causados por drogas/hipoxia/ultra-violet luz radiación, o sobreexpresión/downregulation/nocauts, son importantes para varios modelos de la enfermedad y pueden indicar si una terapia eficaz o puede identificar mecanismos de drogas resistencia.
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Artículo de método
Evaluación de la resistencia a inhibidores de la cinasa de tirosina por un interrogatorio de vías de transducción de señal por Arrays de anticuerpos
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Resumen
Resumen
Pacientes con cáncer con una regulación aberrante de las redes de la fosforilación de la proteína a menudo se tratan con inhibidores de la cinasa de la tirosina. Tasa de respuesta cercana al 85% es comunes. Desafortunadamente, los pacientes se convierten a menudo refractarios al tratamiento alterando sus vías de transducción de señal. Una implementación de los perfiles de expresión con microarrays puede identificar los cambios en general a nivel de mRNA, y proteómica puede identificar los cambios generales en los niveles de proteínas o puede identificar las proteínas involucradas, pero la actividad de la transducción de la señal vías pueden establecerse sólo por interrogar las modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Como resultado, la capacidad para identificar si un tratamiento es exitoso o si se presentó resistencia, o la habilidad para caracterizar alteraciones en las vías de señalización, es un desafío clínico importante. Aquí, ofrecemos una explicación detallada de arrays de anticuerpos como una herramienta que puede identificar alteraciones de todo el sistema en varias modificaciones post-traduccionales (p. ej., fosforilación). Una de las ventajas del uso de arrays de anticuerpos incluye su accesibilidad (matriz no requiere un experto en proteómica o equipo costoso) y la velocidad. La disponibilidad de arreglos a una combinación de modificaciones poste-de translación es la limitación primaria. Además, enfoques imparciales (fosfoproteómico) pueden ser más convenientes para el descubrimiento de la novela, mientras que arrays de anticuerpos son ideales para los objetivos más ampliamente caracterizados.
Introducción
La aplicación clínica de los inhibidores de quinasa tirosina específica (TKI) ha transformado el tratamiento del cáncer proporciona médicos herramientas eficaces para atacar las proteínas específicas transformación neoplásica en coche. Estos compuestos inhiben o bloquean la fosforilación de proteínas dirigida por tirosina quinasas1,2. ITC se convirtió en parte debido a alteraciones genéticas en clave varios genes de señalización son suficientes para la iniciación de cáncer unidad y progresión [p. ej., receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proto-oncogene tirosina-quinasa Src (SRC), BCR-ABL y receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2)]3,4. El impacto de ITC en el ciclo celular5 y el de vías de señalización molecular6 representa una transformación de los no focalizados para el tratamiento del cáncer molecular guiada. La ventaja clave de ITC versus quimioterapia es la tasa de respuesta mayor y el menor riesgo de toxicidad para las células sanas7. Como resultado, se ha aumentado la atención en la investigación y desarrollo de la novela ITC.
Acceso a los resultados de secuenciación comenzó con el proyecto del genoma humano8,9,10 y continúa hoy con varios generación (NextGen) cáncer secuencia esfuerzos [por ejemplo, el genoma del cáncer Atlas (TCGA)11,12]. Esto ha inspirado muchas metodologías experimentales que proporcionan información simultánea sobre miles de genes o proporcionan copias instantáneas imparciales de genes o proteínas moduladas por perturbaciones biológicas13. Dado que la regulación de la función celular se produce en varios niveles, de la transcripción de genes para la modificación poste-de translación de proteínas y su actividad, será una comprensión completa de los eventos de control de la función celular en última instancia requieren de una integración de los datos de varias lecturas biológicas. La capacidad para monitorear los niveles de ARN mensajero (ARNm) de miles de genes con una resolución de unicelular gen ha aumentado la capacidad de hacer inferencias acerca de las funciones de los genes y las interacciones a escala de todo el genoma. Sin embargo, la interpretación de arreglos de discos de gene expresión siempre será inherentemente incompleta sin la integración de otros niveles de regulación: a saber, los niveles de expresión de la proteína, los Estados de modificación de la proteína y la proteína poste-de translación modificaciones (fosforilación ubiquitylation, metilación, etc.). Aquí, describimos la utilidad de los arrays de anticuerpos como medio para interrogar las modificaciones post-traduccionales de importantes componentes de señalización en función de varias condiciones en un solo experimento14,15, 16.
Arreglos de discos de fosfo-anticuerpos pueden ser empleados para distinguir y analizar los cambios en la señal transduction caminos16. Estas pueden surgir de una modificación genética o tratamientos de líneas celulares con inhibidores de la cinasa, quimioterapia, estrés causado por el hambre de privación, hipoxia o suero de glucosa. De nota, resistencia a la droga o de un gen específico para arriba - o regulación a la baja también puede causar cambios en la señal transduction caminos17.
Resistencia a los medicamentos, por ejemplo, puede surgir de mutaciones de la blanco de la droga para evitar sensibilidad. En cáncer de pulmón, conoce las mutaciones de EGFR representar el cáncer insusceptible a ciertos ITC, pero más susceptibles a otros. Vías de señalización alternativa puede activarse sobre mutación17. Como una aplicación más amplia para la identificación de las vías de transducción de señal implicadas en la resistencia y la hipoxia, etc., matrices de fosfo-anticuerpos permiten conocer más y comprender por lo tanto, los mecanismos implicados.
Tecnologías que permitan una evaluación de las modificaciones de proteínas representan un componente importante de la biología de sistemas porque sirven a menudo una función reguladora, como la modulación de la actividad de una enzima o de las interacciones físicas entre proteínas. La importancia de las modificaciones post-traduccionales es ilustrada por el papel de la fosforilación de la proteína en casi todos extracelular desencadena la señal de transducción vías18. Tradicionalmente, la identificación de las quinasas o del estado de fosforilación de proteínas podría también determinar por análisis de Western blot, especialmente si el investigador está interesado en sólo 1 a 5 objetivos. Sin embargo, manchas blancas /negras occidentales son muy selectivas y pueden estar sesgadas hacia el conocimiento previo y podrían pasar por alto objetivos importantes como resultado. Arreglos de anticuerpos proporcionan una lectura de medio rendimiento de múltiples objetivos incrustando diferentes anticuerpos de captura [tyrosine(s) fosforilada pan específicos, anti-ubiquitina, etc.] en una matriz sólida (p. ej., de vidrio o nitrocelulosa). Anticuerpos secundarios proporcionan información sobre las proteínas específicas en un formato ELISA sándwich (figura 1). Este ensayo se convierte en el más poderoso y pertinente como más objetivos son de interés o el conocimiento previo está restringido a15. Los fosfo-arrays son empleables en términos más generales como pueden comparar la fosforilación como general cantidades de proteína de una variedad más amplia de objetivos en un experimento y proporcionar una cuantificación significativamente mejorada sobre espectrometría de masas. Esta técnica no es aplicable para la identificación de sitios de fosforilación nuevos o desconocidos.
Proteómica basada en espectrometría de masa a gran escala podría ser empleado para identificar sitios específicos de fosforilación de proteínas19. Aunque esta técnica puede enumerar miles de acontecimientos poste-de translación, requiere costosa instrumentación, tuberías experimentales dedicadas y una experiencia computacional que están fuera del alcance de la mayoría de los investigadores.
Arrays de anticuerpos proporcionan una lectura simultánea en diferentes proteínas lecturas16. Estos pueden ser cambios en la proteína ubiquitylation (ubiquitina array) o fosforilación. La ventaja clave de esta tecnología es que proporciona información importante sobre el estado biológico de diversas vías biológicas asociadas con parámetros de celda importante (proteína de 53 kDa, p53, cinasas de tirosina de receptores y vías intracelulares) al mismo tiempo. Además, es posible combinar varios tipos de arreglos de discos para aumentar la penetración de un ensayo (p. ej., apoptosis y ubiquitina y fosforilación). Esta capacidad de combinar múltiples arreglos de discos para evaluar varias modificaciones poste-de translación en varias muestras simultáneamente en una forma de tiempo y costo efectiva que no requiere instrumentación específica o conocimientos es una ventaja significativa en el caso de arrays de anticuerpos.
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Protocolo
1. extracción de proteínas
- Placa de 5 x 106 células en una placa de cultivo de tejidos de 10 mm (o frasco) en una campana de cultivo de tejidos. Contar las células en el momento de las chapas con un contador celular automático o hemocitómetro. Por otra parte, estiman que el conteo de células.
- Enjuague las células cultivadas en la placa de 10 mm (o frasco) Fondo de 3 x con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH = 7,4). Asegúrese de quitar todos los PBS antes de añadir el tampón de lisis.
Nota: El buffer de lisis generalmente se suministra con el kit. Si no, entonces usar un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) o cualquier otro tampón de lisis de células que contienen un cóctel de inhibidores de la proteasa y fosfatasa. - Lyse 1 x 107 células/mL de células en el tampón de lisis agregando la cantidad correcta de memoria intermedia a las células y raspando las células con un raspador celular en el búfer de lisis. (por ejemplo, para las células HeLa y MiaPaCa-2, utilice 600 μl por placa de 10 cm).
- Pipeta el lisado arriba y abajo (aproximadamente 10 x) y transferir a un tubo nuevo de 1,5 mL.
- Incubar los lisados por 30 min a 4 ° C, preferiblemente en una mezcladora de eje de balancín. Presionar el lisado a través de una jeringa con una aguja de 27 G x 10 para una interrupción correcta de la cell membrane(s). Por otra parte, someter a ultrasonidos lisado. Almacenar los lisados a-20 ° C o usarlos inmediatamente.
- Centrifugue el lisado a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL.
- Cuantificar la cantidad de proteína total por bicinchoninic ensayo ácido (BCA)20 o un equivalente como Lowry o Bradford y continuar con al menos 50 – 400 μg. Utilice las proteínas inmediatamente o alícuota y congelación/tienda les a-70 ° C (evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo).
2. humano matriz de fosfocinasa
- Traiga todos los reactivos a temperatura ambiente antes de empezar (para aproximadamente 1 hora).
Nota: Todos los reactivos y desgaste de plástico están incluidos en el kit. - Preparar el fresco reactivos (topes de gama) antes de iniciar el procedimiento siguiendo las instrucciones del fabricante (dependiendo de la elección de objetivos y arreglos de discos, las instrucciones pueden variar ligeramente).
- Reconstituir los cócteles de anticuerpo de detección en 100 μL de agua desionizada o siga las instrucciones del fabricante deben difieren para el tubo de ensayo 1.5 mL proporcionado.
- Preparar 1 x de tampón de lavado diluyendo 40 mL de 25 x solución de lavado en 960 mL de agua desionizada y mezclar por inversión del tubo.
Nota: Cristales disuelven a temperatura ambiente. El buffer puede amarillear con el tiempo pero todavía funciona. - Pipetear 1 mL de tampón de la matriz 1 a cada pocillo de una multi-bandeja 8 bien (o 2 mL en una bandeja de 4 pozos múltiples).
- Con las pinzas de punta plana, quitar las membranas de matriz entre las sábanas protectoras y colocarlos en los pozos. Asegúrese de que los números en la membrana son hacia arriba.
Nota: Al estar sumergido, el tinte en la membrana va a desaparecer. - Cubra la bandeja con una tapa e incube en un agitador de plataforma oscilante durante 60 min a temperatura ambiente.
Nota: Este es el paso de bloqueo de la membrana. - Durante el período de incubación, preparar las muestras de proteína. Añadir 50-100 μg de proteínas totales. Diluir el lisado, tener un volumen máximo de 334 μL, con tampón de lisis a un volumen final de 1 mL.
Nota: 50 – 100 μg de proteínas totales es suficiente normalmente. - Aspirar cuidadosamente el buffer matriz 1 e incubar las membranas con 1 mL de las muestras durante la noche a 2 – 8 ° C en un agitador de plataforma oscilante.
Nota: No toque arañazos y las membranas. - Al día siguiente, lavar la matriz cuidadosamente quitando cada arreglo de discos y colocar en envases plásticos individuales (aproximadamente 8 x 11 cm2) con 20 mL 1 x de tampón de lavado. Lavar las membranas 3 x 10 min en una plataforma oscilante de 1 x de tampón de lavado a temperatura ambiente.
- Pipetee 20 μL del anticuerpo reconstituido Cóctel de paso 2.3 a 1 mL de 1 x de tampón de matriz 2. Añadir 1 mL de esta solución a cada pozo 8 a ser utilizado.
- Retire cuidadosamente las membranas de las bandejas de lavado. Secar el borde inferior en las toallas de papel para quitar cualquier tampón de lavado exceso y transferirlas hacia la bandeja que contiene el cóctel de anticuerpos. Cubrir la bandeja con la tapa e incubar por 2 h a temperatura ambiente en una plataforma oscilante. Bien enjuagar las bandejas usadas con dH2O y seco para uso posterior.
- Retire cada arreglo de discos con cuidado y colocarlas en los envases de plástico limpios individuales (aproximadamente 8 x 11 cm2) con 20 mL de tampón de lavado 1 x. Lavar 3 x 10 min con el tampón de lavado en una plataforma oscilante a temperatura ambiente.
- Diluir estreptavidina-HRP (suministrado con el kit) o tinte de estreptavidina fluorescentes (para una detección más cuantitativa) 1:1,000 en 1 x buffer matriz 2 en un tubo de ensayo de 15 mL.
- Volver las membranas en los platos de 8 pozos que contiene la solución de HP e incúbelos durante 30 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante (si usando fluorescencia, envuelva la bandeja en papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz).
- Quite el exceso de tampón colocando la membrana entre 2 piezas de 5 mm de papel de 3 M. Para la proyección de imagen con un reproductor de imágenes de rayos x película/quimioluminiscencia, incubar las membranas secas con una solución de detección de HRP (quimioluminiscente de mezcla las dos soluciones 1:1) durante 3 minutos y colocar la membrana en un protector de plástico transparente de la hoja.
Nota: Membrane(s) secos también puede ser colocados en un sensor fluorescente para detectar la señal fluorescente; minimizar la exposición a la luz a la membrana antes de la proyección de imagen. Para la cuantificación de los archivos de película o el sensor de rayos x, evitar la sobreexposición. Más toner de la quimioluminiscencia fluorescente tienen una función para evitar la saturación de la señal.
3. Análisis de los datos
- Descargar ImageJ, una tratamiento del programa21, de la imagen e instalar el software.
- Abrir ImageJ haciendo doble clic en el 'Icono de ImageJ'. Seleccione la imagen a analizar haciendo clic en 'Archivo' en la barra de menú, luego seleccione 'Abrir' en el menú desplegable y ver los archivos de computadora de la imagen de interés. Haga clic en el archivo para abrirlo.
- Invertir la imagen para el análisis (manchas negras sobre el fondo blanco a manchas blancas sobre fondo negro) haciendo clic en 'Editar' en la barra de menú y seleccionando 'Invertir' en el menú desplegable.
- Seleccione el icono' oval' en la barra de herramientas (la segunda opción en la barra de herramientas de ImageJ). Dibujar un círculo/óvalo haciendo clic en la imagen (cruz negra) y moviendo el ratón. Ajustar el tamaño y la forma del óvalo y círculo para rodear a los puntos de la mancha blanca /negra del punto.
- Haga clic en 'Analizar' en la barra de menú y seleccione 'Medida' en el menú desplegable para abrir automáticamente una nueva ventana con los valores del área seleccionada (área media, mínimo y máximo).
- Mover el área circular arrastrando el círculo desde el centro (puso el punto de la derecha de la flecha en el centro) y colocar alrededor de la siguiente área de medición (punto). Medir todos los puntos de interés, el control positivo, control negativo y el fondo para el análisis.
Nota: El control negativo es el PBS, el fondo es una parte de la membrana sin cualquier mancha (cualquier parte hará), y el control positivo es un control proporcionado por el fabricante. - Seleccione los puntos de control negativo de PBS y restar el valor de cada punto. Promedio de la intensidad para cada par de puntos duplicados que representa cada receptor tirosina quinasa (RTK). Cada intensidad media puede estar relacionada con el control para calcular el cambio de doble.
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Resultados
Para investigar el efecto de la resistencia de TKI en vías de transducción de señal en las líneas celulares, se analizaron cuatro muestras. Muestra un control (H3255r1) y 3 líneas celulares resistentes a TKI (H3255r2-4) (figura 2) fueron relacionados con la plantilla de punto anticuerpo (figura 3). Todas las 4 muestras fueron preparadas usando este protocolo. Seis fosfoproteínas con actividad diferencial fueron elegidas para la d...
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Discusión
Enfoques que combinan muchos lecturas biológicas son representaciones inherentemente más precisas de la maquinaria celular en un experimento realizado. La llegada de los arreglos de discos de fosfo-anticuerpos permite una caracterización rápida del patrón de modificaciones que pueden ser más informativo que el estado de modificación de cualquier proteína sola. El flujo de trabajo general para la aplicación de matrices de fosfo-anticuerpos se basa en una modificación en la serina, treonina o tirosina. En este ejemplo se c...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos por el generoso apoyo financiero de la Lawrence J. Ellison Instituto de transformador medicina de USC (un regalo a David Agus). Agradecemos el apoyo de otoño Beemer y Lisa Flashner que conducen a la generación y publicación de este manuscrito. Agradecemos a Laura Ng por su apoyo administrativo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences Generador de | imágenes fluorescente Tubo | |
| 1,5 ml | Raspador | ||
| Falkon (Corning) | 353085 | ||
| Dulbeco's Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Corning | 21-031-CV | tampón de lavado para la extracción de proteínas |
| Placa de cultivo de tejidos 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Jeringa de insulina U100 | Becton Dickinson | 329412 27 G5/8, 1 mL para el tratamiento con aguja de muestras de proteínas | |
| Protein Profiler ARRAY | R& D | ARY003B | Matriz de fosfo humano MAPK |
| Matriz de perfiladores de proteínas | R& D | ARY002B | Centrífuga de matriz de fosfoquinasa humana |
| Eppendorf 5430R | Centrífuga de sobremesa | Eppendorf | |
| Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Lector de absorbancia para la cuantificación de proteínas | |
| IRDye 800CW Estreptavidina | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Conjugado de estreptavidina para detección fluorescente |
| LabGard ES Clase II, Tipo A2 cabina de bioseguridad | NuAire | NU-425-400 Campana de cultivo de | tejidos |
| TC20 contador de células automatizado Bio-Rad | 1450102 | Contador de células | |
| Halt Protease & Cóctel inhibidor de fosfatasa (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| Tampón RIPA | Sigma | R0278 | |
| Desmembrador sónico | Fisher Scientific | F60 | Sonicador |
| Agitador de plataforma oscilante | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH código | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64 bits) | Microsoft |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
