Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכים נוגדנים לזהות שינויים איתות המסלולים במודלים שונים של הסלולר. שינויים אלה, הנגרם על ידי תרופות/היפוקסיה/אולטרא-violet אור/קרינה, או על ידי ביטוי/downregulation/הסתרה, חשובים עבור מודלים שונים של המחלה, ניתן לציין אם טיפול יהיה יעיל או ניתן לזהות מנגנונים של סמים . התנגדות.
Abstract
חולי סרטן תקנה aberrant של הרשתות זירחון חלבונים מטופלים לעיתים קרובות עם מעכבי קינאז טירוזין. שיעורי ההיענות מתקרב 85% נפוצים. למרבה הצער, המטופלים לעיתים קרובות להיות עקשן לטיפול על ידי שינוי מסלולים התמרה חושית שלהם אותות. יישום של פרופיל ביטוי עם מיקרו-מערכים ניתן לזהות את השינויים באופן כללי ברמת mRNA, פרוטאומיקס ניתן לזהות שינויים הכוללת את רמות החלבון או ניתן לזהות את החלבונים המעורבים, אך הפעילות של אותות מסלולים יכול להתבסס רק על ידי חוקר את השינויים post-translational של החלבונים. כתוצאה מכך, היכולת לזהות אם טיפול תרופתי הוא מוצלח או התנגדות התעוררו, או את היכולת לאפיין שינויים בהמסלולים איתות, הוא מהווה אתגר קליני חשוב. כאן, אנו מספקים הסבר מפורט של נוגדן מערכים ככלי אשר ניתן לזהות שינויים מערכתיים למגוון שינויים post-translational (למשל, זרחון). אחד היתרונות של השימוש במערכים נוגדן כולל נגישות (מערך אינה דורשת מומחה פרוטאומיקס או ציוד יקר) והמהירות שלהם. הזמינות של מערכים מיקוד שילוב של שינויים post-translational היא המגבלה העיקרית. בנוסף, גישות לא משוחדת (phosphoproteomics) עשוי להיות מתאים יותר עבור גילוי הרומן, ואילו מערכי נוגדנים הינם אידיאליים עבור המטרות מאופיין נרחב ביותר.
Introduction
יישום קליני מעכבי קינאז טירוזין יישוב (TKI) שינתה טיפול בסרטן על ידי מתן רופאים עם כלים אפקטיביים כדי למקד את החלבונים ספציפית את השינוי אמצעים כונן. תרכובות אלו לעכב או לחסום את זרחון של חלבונים ממוקד על ידי טירוזין kinases1,2. TKIs פותחו באופן חלקי בגלל שינויים גנטיים שונים מפתח איתות גנים מספיקים כדי נסיעה סרטן החניכה, התקדמות [למשל, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), proto-oncogene חלבון טירוזין קינאז Src (SRC), BCR-ABL, קולטן גורם הגדילה באפידרמיס אנוש 2 (HER2)]3,4. השפעת TKIs על מחזור התא5 ו מולקולרית של איתות המסלולים6 מייצגת שינוי מן untargeted לטיפול בסרטן מולקולרי מודרכים. היתרון המפתח של TKIs לעומת כימותרפיה הוא את שיעורי ההיענות מוגברת לבין סיכון נמוך יותר של רעילות תאים בריאים7. כתוצאה מכך, שם גדל תשומת הלב על מחקר ופיתוח של רומן TKIs.
גישה על פי התוצאות רצף גנטי התחיל עם9,8,10 פרוייקט הגנום האנושי וממשיך כיום עם שונים הדור הבא (NextGen) סרטן רצף מאמצים [למשל, גנום הסרטן אטלס (TCGA)11,12]. זה נתן השראה מתודולוגיות ניסיוני רבים אשר מספקים מידע בו זמנית על אלפי גנים ו/או לספק תמונות לא משוחדת של גנים או חלבונים מווסת על ידי לפליטת ביולוגי13. מאז ברגולציה של הפונקציה הסלולר מתרחש ברמות מרובות, שעתוק של גנים על שינוי post-translational של חלבונים ופעילותם, הבנה מלאה של האירועים שליטה הפונקציה הסלולר יהיה בסופו של דבר דורשים שילוב של נתונים המפרט ביולוגיים שונים. היכולת לנטר את רמות RNA שליח (mRNA) של אלפי גנים עם רזולוציה תא בודד הגן גברה היכולת לגרום מסקנות על תפקוד הגן ואת האינטראקציות בקנה מידה הגנום כולו. עם זאת, הפרשנות של מערכים ביטוי גנים תמיד יהיה מטבעו לא שלם בלי השילוב של רמות אחרות של רגולציה: כלומר, רמות ביטוי חלבון הברית שינוי חלבון, החלבון post-translational שינויים (זרחון, ubiquitylation, מתילציה, וכו '). כאן, אנו מתארים את התועלת של נוגדן מערכים כאמצעי לחקור שינויים post-translational של מרכיבים חשובים איתות כפונקציה של מצבים שונים ניסוי אחת14,15, 16.
יכול להיות מועסק פוספו-נוגדן מערכים הבחנה וניתוח השינויים האות התמרה חושית מסלולים16. אלה יכולים לנבוע שינוי גנטי או טיפולים של שורות תאים עם מעכבי קינאז, chemotherapeutics, מתח נגרמת על ידי הרעבה קיפוח, היפוקסיה או סרום גלוקוז. הערה, תרופתיים או גנים ספציפיים למעלה - או downregulation יכולה גם לגרום לשינויים האות התמרה חושית מסלולים17.
עמידות לתרופות, למשל, יכול לנבוע מוטציות של המטרה סמים כדי למנוע רגישות. סרטן ריאות, ידועה EGFR מוטציות רינדור הסרטן insusceptible כדי TKIs מסוימות, אך יותר רגיש לאחרים. ניתן להפעיל חלופה מסלולי איתות על מוטציה17. כיישום רחבה יותר לצורך זיהוי מסלולים התמרה חושית אות מעורב ההתנגדות, היפוקסיה, וכו ', מערכים פוספו-נוגדן מספקים תובנה רבה יותר, וכתוצאה מכך הבנתו, המנגנונים המעורבים.
טכנולוגיות לאפשר הערכה של חלבון שינויים מייצגים מרכיב חשוב של ביולוגיה מערכתית כי הם משמשים לעתים קרובות פונקציה רגולטוריות כגון הכוח ויסות הפעילות של אנזים או את האינטראקציות פיזי בין חלבונים. חשיבות השינויים post-translational מודגם על-ידי התפקיד של זירחון חלבונים כמעט כל אות חוץ-תאית המופעלות התמרה חושית מסלולים18. באופן מסורתי, הזיהוי של kinases או של המצב זרחון של חלבונים יכול גם להיקבע על ידי ניתוח תספיג, במיוחד אם החוקר מעוניין רק 1 – 5 מטרות. עם זאת, שהכלים המערבי מאוד סלקטיבי, עלולים להיות מוטים לכיוון ידע מוקדם, עלולים לפספס מטרות חשובות כתוצאה מכך. נוגדנים array(s) לספק תפוקה בינונית מפרט. של החלקים מטרות מרובות על-ידי הטבעת שונים לכידת נוגדנים [tyrosine(s) phosphorylated פן ספציפי, אנטי-אוביקוויטין, וכו '] על מטריצה מוצק (למשל, זכוכית או ניטרוצלולוזה). נוגדנים משניים מספקים מידע אודות חלבונים ספציפיים בתבנית אליסה מבוסס-כריך (איור 1). זה וזמינותו הופכת חזקה יותר רלוונטי גם מטרות יותר עניין או ידע מוקדם הוא מוגבל15. פוספו-המערכים הם להפכה תעסוקה כפי שהם יכולים להשוות זרחון, כמו גם כללי בכמות החלבון של מגוון רחב יותר של מטרות בניסוי אחד לספק של כימות משופרת באופן משמעותי מעל ספקטרומטר מסה. טכניקה זו אינה ישימה עבור זיהוי אתרי זירחון חדשה או לא מוכרת.
יכול להיות מועסק פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה בקנה מידה גדול כדי לזהות אתרים ספציפיים זרחון של חלבונים19. למרות טכניקה זו ניתן למנות אלפים של אירועים post-translational, היא דורשת מכשור יקר, צינורות ניסיוני ייעודי, התמחות חישובית שנמצאים מעבר להישג רוב החוקרים.
נוגדן מערכי מספקים readout סימולטני של חלבונים שונים המפרט16. אלה עשויים להיות שינויים חלבון ubiquitylation (מערך אוביקוויטין) או זירחון. היתרון המפתח של טכנולוגיה זו מערך הוא שהיא מספקת משוב חשוב על מצב ביולוגי מסלולים ביולוגיים שונים הקשורים עם פרמטרים חשובים תא (חלבון של 53 kDa, p53, קולטן טירוזין kinases מסלולים תאיים) בעת ובעונה אחת. בנוסף, אפשרי לשלב סוגי מערכים שונים להגברת החדירה של assay (למשל, אפופטוזיס, אוביקוויטין, זרחון). זו היכולת לשלב מערכים מרובים כדי להעריך שונות post-translational שינויים מספר דגימות בו זמנית באופן זמן cost effective אינה דורשת מכשור מסוים או מומחיות הוא בעל יתרון משמעותי במקרה של נוגדן מערכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חלבון החילוץ
- צלחת 5 x 10 תאים6 על הלוחית תרביות רקמה 10 מ מ (או הבקבוק) בשכונה תרביות רקמה. לספור את התאים בזמנו של ציפוי עם מונה תא אוטומטית או hemocytometer. לחלופין, מעריכים את ספירת התאים.
- לשטוף את התאים גדל על צלחת 10 מ מ (או הבקבוק) ביסודיות 3 x 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) (ה-pH = 7.4). הקפד להסיר כל PBS לפני הוספת המאגר פירוק.
הערה: המאגר פירוק בדרך כלל מסופק עם הקיט. אם לא, ואז להשתמש radioimmunoprecipitation assay מאגר (ריפה) או כל אחרים תא פירוק מאגר שמכיל קוקטייל של מעכבי פרוטאז, פוספטאז. - Lyse עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל של תאים במאגר של פירוק על ידי הוספת את הסכום הנכון של מאגר לתאים ולשרוט את התאים עם המגרד התא למאגר פירוק. (למשל, הלה תאים ו- MiaPaCa-2, לשימוש µL 600 לכל צלחת 10 ס מ).
- Pipette lysate למעלה ולמטה (כ 10 x), להעביר אותו צינור 1.5 מ.
- דגירה של lysates במשך 30 דקות ב 4 ° C, רצוי על נדנדה/מטרף. הקש את lysate באמצעות מזרק עם מחט 27 G x 10 להבטיח לשיבוש נכונה cell membrane(s). לחלופין, sonicate את lysate. לאחסן את lysates ב-20 ° C או להשתמש בהם באופן מיידי.
- Centrifuge lysate-x 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי mL 1.5.
- Quantitate את כמות החלבונים סך bicinchoninic assay חומצה (BCA)20 או שווה ערך כמו לאורי או ברדפורד והמשך לפחות 50 – 400 μg. השתמש חלבונים מיד או aliquot, הקפאת/חנות אותם ב-70 מעלות צלזיוס (למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה).
2. האדם מערך Phosphokinase
- להביא כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר לפני שמתחילים (עבור 1h).
הערה: כל ריאגנטים, לובשים פלסטיק כלולים בערכה. - להכין כל ריאגנטים הטרייה (מערך מאגרים) לפני תחילת ההליך ההוראות של היצרן (בהתאם הבחירה של מטרות/מערכים, ההוראות עשוי להשתנות מעט).
- לשקם את זיהוי נוגדנים קוקטיילים 100 μL של מים יונים או בצע הוראות היצרן צריך הם שונים עבור 1.5 mL מבחנה מסופקים.
- להכין 1 x שטיפת מאגר על ידי דילול 40 מ"ל של 25 x שטיפת מאגר של 960 מיליליטר מים יונים ומערבבים אותם על-ידי היפוך.
הערה: גבישים מתמוססים בטמפרטורת החדר. המאגר עשוי להפוך צהובות לאורך זמן אך עדיין יעבוד. - פיפטה 1 מ"ל של מערך מאגר 1 לבאר כל מגש רב-תכליתי 8-טוב (או 2 מ"ל מגש מרובה 4-טוב).
- עם פינצטה שטוח-עצה, להסיר את הקרומים מערך בין הסדינים מגן, למקם אותם לתוך הבארות. ודא כי המספרים על הקרום פונות כלפי מעלה.
הערה: בעת צלילה, לצבוע על הקרום ייעלם. - מכסים את המגש עם מכסה, דגירה זה על נדנדה מטרף פלטפורמה עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: זהו צעד חסימת ממברנה. - במהלך תקופת דגירה, להכין את דגימות חלבון. להוסיף 50 – 100 μg החלבון הכולל. לדלל את lysate, בעל נפח מרבי של μL 334, עם פירוק מאגר לאמצעי הסופי של 1 מ"ל.
הערה: 50 – 100 μg החלבון הכולל בדרך כלל מספיק. - האחות מאגר מערך 1 בקפידה, דגירה בקרום עם 1 מ"ל של הדגימות ללון ב- 2-8 ° C-מטרף פלטפורמה נדנדה.
הערה: ללא מגע/שריטה הממברנות. - למחרת, לשטוף את המערך על-ידי הסרת כל מערך ובזהירות הצבתו לתוך מיכלי פלסטיק בודדות (כ 8 x 11 ס מ2) עם 20 מ של מאגר שטיפת x 1. לשטוף את הקרומים 3 x 10 דקות על פלטפורמה נדנדה 1 x שטיפה מאגר בטמפרטורת החדר.
- פיפטה 20 μL של הנוגדן משוקם קוקטייל מן צעד 2.3 ל- 1 מ ל 1 x מערך מאגר 2. להוסיף 1 מ"ל של פתרון זה כל 8-ובכן כדי לשמש.
- בזהירות להסיר את הקרומים המגשים לשטוף. כתם הקצה התחתון על גבי מגבות הנייר כדי להסיר את כל מאגר שטיפת עודפי ולהעביר אותם בחזרה במגש המכיל נוגדנים הקוקטיילים. מכסים את המגש עם המכסה, דגירה זה עבור 2 h בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נדנדה. ביסודיות לשטוף את המגשים בשימוש ב- dH2O ויבש אותם לשימוש מאוחר יותר.
- בזהירות להסיר את כל מערך ולמקם אותם בחזרה לתוך מיכלי פלסטיק נקי בודדים (כ 8 x 11 ס מ2) עם 20 מ ל 1 x שטיפת המאגר. לשטוף אותם 3 x 10 דקות עם המאגר שטיפת על פלטפורמה נדנדה בטמפרטורת החדר.
- לדלל Streptavidin-HRP (מסופק עם הקיט) או streptavidin-פלורסנט צבען (לגילוי יותר כמותיים) 1:1,000 1 x מערך מאגר 2 במבחנה 15 מ"ל.
- להחזיר את הקרומים לתוך כלים 8-ובכן המכיל את הפתרון של HP, דגירה אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נדנדה (אם באמצעות פלורסצנטיות, לעטוף את המגש בנייר אלומיניום כדי להימנע מכל חשיפה קלה).
- הסר את מאגר עודף על-ידי הצבת הקרום בין 2 חתיכות של 5 מ מ 3 מ' נייר. עבור הדמיה עם imager סרט/chemiluminescent רנטגן, דגירה על הממברנות מיובשים עם פתרון זיהוי HRP (לערבב השני chemiluminescent פתרונות 1:1) למשך 3 דקות, למקם את הקרום מגן גיליון פלסטיק שקוף.
הערה: membrane(s) יבשים עלולה גם להיות מוצב בתוך imager פלורסנט כדי לזהות את האות פלורסנט; למזער את החשיפה אור הקרום לפני הדמיה. על כימות רנטגן הסרט או imager הקבצים, למנוע חשיפת יתר. רוב imagers chemiluminescent/פלורסנט יש פונקציה כדי להימנע רוויה של האות.
3. ניתוח נתונים
- ImageJ, תמונה עיבוד תוכנית21, להוריד ולהתקין את התוכנה.
- פתח ImageJ על-ידי לחיצה כפולה על 'סמל ImageJ'. בחר את התמונה כדי להיות מנותח על ידי לחיצה על 'קובץ' בשורת התפריטים, ולאחר מכן בחר 'פתח' מתוך התפריט הנפתח ודפדף את קבצי המחשב עבור התמונה של עניין. לחץ על קובץ כדי לפתוח אותו.
- היפוך התמונה לניתוח (כתמים שחורים על רקע לבן כדי כתמים לבנים על רקע שחור) על ידי לחיצה על 'עריכה' בשורת התפריטים ובחירה באפשרות 'היפוך' מהתפריט הנפתח.
- בחר בסמל' אליפסה' מסרגל הכלים (האפשרות השנייה בסרגל הכלים ImageJ). צייר מעגל/אליפסה על-ידי לחיצה על התמונה (הצלב השחור), הזזת העכבר. להתאים את הגודל/צורת העיגול/האליפסה להקיף את הנקודות על האבן החשופה נקודה.
- לחץ על 'ניתוח' בשורת התפריטים ולאחר מכן בחר 'מידה' מתוך התפריט הנפתח באופן אוטומטי לפתוח חלון חדש עם הערכים של האזור הנבחר (אזור, ממוצע, מינימום או מקסימום).
- להזיז את האזור מעגלית על-ידי גרירת את המעגל מהמרכז (put הטעם ימינה חץ באמצע) ולמקם אותו סביב האזור הבא מדידה (נקודה). למדוד כל נקודות עניין, הפקד חיובית, הפקד שלילי ואת הרקע לניתוח.
הערה: הפקד שלילי הוא מגניב, הרקע הוא חלק הקרום ללא בכל נקודה (כל חלק לעשות), הפקד חיובי הוא פקד המסופקים על ידי היצרן. - בחר נקודות בקרה שלילית PBS ולהחסיר את הערך של כל נקודה. ממוצע עוצמת עבור כל זוג של נקודות כפולות המייצגים כל קולטן טירוזין קינאז (RTK). כל העוצמה ממוצע יכול להיות קשור הפקד כדי לחשב את השינוי קיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לחקור את השפעת TKI ההתנגדות על האות התמרה חושית שבילים בשורות תאים, נותחו הארבעה. פקד אחד מדגם (H3255r1) ו- 3 שורות תאים עמידים TKI (H3255r2-4) (איור 2) היו קשורים אל התבנית נוגדן ספוט (איור 3). כל הדגימות 4 הוכנו תוך שימוש בפרוטוקול זה. Phosphoproteins שש עם פעילות דיפרנציאלית נבחרו על ההפגנה של הניתוח של המערכים נוגדנים (איור 4). המפה חום (איור 5) מספק readout הכמותיים למחצה על שינויים זירחון חלבונים של האות חשוב התמרה חושית חלבונים. האימות של מערך התוצאות ניתן להשלים על ידי יישום גישות אורתוגונלית, כגון סופג המערבי.
איור 1: סכמטי של מערכים נוגדן הכמותיים למחצה. מערכי של נוגדן מבוססים על העיקרון מתכלה כריך, שבו אוסף של לכידת נוגדנים מוטבע בתוך הזכוכית או את התמיכה ניטרוצלולוזה. Lysates תא מודגרת עם הקרום, מערכי של נידונים נוגדנים משניים. Readout למחצה כמותיים ניתן לקבל מצעים chemiluminescent או, לקבלת מידע כמותי נוסף, דימות מבוסס פלורסנט. סימנים נגזר סרט או תמונות TIF שההזמנה תבוצע על-ידי densitometry חישוב של הקיפול-משתנה עבור כל חלבון. התהליך כולו לוקח על היום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמה פוספו-נוגדן מערך פיתח עם הצלם. המקומות פלורסנט מזוהים ב כפולה (שתי נקודות לכל יעד). דוגמאות ונקודות בקרה חיובית להראות בעוצמות משתנות. כל המוצג כאן הוא השוואת את H3255r1 TKI רגיש ומערכים 3 עמידים (H3255r2-4) לדוגמה, לפצל את קרום A ו- B אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מפת המקומות מערך. המפה מקשרת את הנקודות על מטרות נוגדן. המקומות מסומנים באותיות A - G אנכית ו 1-10 אופקית. הפקד חיובי (כתום) קיים כל ממברנות ומצא בדרך כלל בפינות. הפקד PBS שלילי מודגשת בשחור בזמן המקומות מדגם מסומנים בצהוב. על כל מערך, רשימה של נוגדנים מסופק גם לצורך זיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: דוגמה לניתוח נתונים. (א) עוצמת נקודות עניין, החיובי, ובקרה על הרקע היו המזוהה על המפה ומדד עבור כל הדגימות. (B) היחסית בעוצמה (עוצמת ספוט עם עוצמת רקע הוסר, מנורמל ל עוצמת שליטה חיובית) מוצגת בתרשים עבור מספר המועמדים שבחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מפת החום איתות דיפרנציאלי H3255 רגיש (r1), שורות תאים עמידים (r2-4). ספוט שהבוטות היחסית שימש ליצירת מפת החום של השוואה של שינויים CREB, P53, AKT ו STAT5 כל הדגימות 4. כל רמות גבוהות מוצגים בגוונים שונים של אדום, בעוד כל רמות נמוכות יותר מוצגים כחול22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גישות המשלבות המפרט ביולוגיים רבים הן ייצוגים מטבעו מדויקת יותר של מכונות הסלולר בניסוי שבוצעה. כניסתו של מערכים פוספו-נוגדן מאפשרת אפיון מהירה של התבנית של שינויים אשר עשוי להיות אינפורמטיבי יותר מאשר המצב השינוי של כל חלבון יחיד. תהליך העבודה הכללי עבור היישום של מערכים פוספו-נוגדן מבוסס על שינוי בסרין, תראונין או טירוזין. דוגמה זו התמקד באפיון השינויים הקשורים ההתנגדות לטיפול בסרטן ריאות. הרציונל העיקרי עבור יישום זה היא זירחון חלבונים ממלאת תפקיד מרכזי בהעברת אותות סרטן אנושיים רבים18, שיטה זו תהיה ניתנת להעברה למערכות אחרות. Dysregulation של זרחון סרטן כרוך בדרך כלל את hyperactivation של טירוזין קינאז, אפוא, מצעים phosphorylated (כולל לעתים קרובות קינאז phosphorylated אוטומטית את עצמה) נמצאים ברמות גבוהות יותר מאשר רגיל הגדרות פיזיולוגיים, בהתאם לכך, יכול לפצות חלק קטן משמעותית phosphoproteins בתא סרטן. אלה רמות גבוהות יותר של זרחון יקל זיהוי. יתר על כן, זירחון חלבונים יש משמעות רפואית שכן זרחון טירוזין aberrant מהווה סימן היכר של סוגים רבים של סרטן23. בנוסף, מאז טכניקה זו היא להעברה החקירה של מערכות ביולוגיות אחרות לנצל זרחון, רבות מהתכונות המתוארות כאן יכולה בקלות להיות מכוונת להתמקד סוגים אחרים של מערכי חלבון (אוביקוויטין, אפופטוזיס, וכו).
מערכים פוספו-נוגדן נמצאים בשימוש נרחב עבור הזיהוי בכל שבילים אות מעורב, או שיטה לניתוח או אימות של מסלול מסוים אחד. חברות שונות להפוך את ערכות עבור שניהם את מצב זרחון, רמות הכוללת של חלבונים. בעוד ניתוח בזמן אמת פולימראז תגובת שרשרת (PCR) או מיקרו-מערכים הם הרבה יותר כמותיים, הם רק mRNA רמות להתחשב, תרגום, כמו גם שינויים post-translational לא יכול להתייחס. מלבד זרחון, שינויים post-translational אחרים כגון גליקוזילציה או ubiquitylation גם ניתן לטפל על ידי מערכים24,25.
אחד הגורמים החשובים שיש לקחת בחשבון לפני שמתחילים נוגדן מערכים הוא להתחיל עם תאים בריאים, החלוקה באופן פעיל. היפוקסיה סטרס חמצוני, דלקת עלולה לגרום לשינויים האות התמרה חושית מסלולים26 זה יכול להטות את התוצאות, רינדור פירוש מוטעה אם מטופל כראוי. הלחץ הזה ניתן לייחסו ניסוח של מדיה או ציפוי תאים פחות מדי או יותר מדי, או כדי לחשוף את התאים לסביבות מוסדר בצורה גרועה, או בטיפול של שליטה לעומת sample(s) באופן שונה במקצת. אנחנו גם ציינו הבדלים גדולים במספר מעבר או הפעם תרבות פוסט-הפשרתו. המפתח כדי הימנעות משתנים אלה הציג באופן מלאכותי הוא לשמור את הכול בין הדגימות עקבי ככל האפשר. אל תשנה את האחוז FBS או אמצעי מדיה, וכדומה, במהלך הניסוי.
יש גם לשקול ניתוח הנתונים לפני תחילת ניסוי מערך. ניתוח מערך chemiluminescent היא רק חצי כמותית, טווח דינמי שלה הוא כ אחד סדר גודל, בעוד בגישה פלורסנט מגדיל את טווח דינמי כדי כ שני סדרי גודל. הסולם שעליו מבוצעות מערכים תלוי ות ביולוגי מסוים. קיימת אפשרות לנתח את שורה אחת תא עמיד ספציפית עניין לביצוע כל השינויים בהשינויים post-translational לעומת שורת תאים המקורית או כדי להתמקד על מסלול מסוים אחד עבור מגוון רחב של שורות תאים עמידים. יש לקחת בחשבון את המדרגיות של גישה זו בשלבי התכנון המוקדמים. יתר על כן, התוצאות של מערך נוגדן צריך תמיד להיות מאושרות על ידי שיטה משני על דגימות טריים ו/או את lysates אותו. ניתוח תספיג חלבון יכול להיות מועסק כדי לוודא שהשינויים מטרות מוגדרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
. אנחנו אסירי תודה על תמיכה כספית נדיבה של לורנס ג'יי אליסון המכון טרנספורמטיבי לרפואה של אוניברסיטת דרום קליפורניה (מתנה דוד בני אהרוני). אנו מעריכים את התמיכה של סתיו בימר, ליסה Flashner אשר להוביל הדור והפרסום של כתב היד הזה. אנו מודים Ng לורה על שלה תמיכה מנהלתית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
- Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
- Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
- Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
- Maguire, H. C., Greene, M. I.
- Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
- Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
- Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
- Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
- Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103 (1988).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
- Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
- Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
- Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
- Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
- Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
- Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
- Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
- Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
- Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
- McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).
