Summary
ここでは、様々 な細胞モデルにおけるシグナル伝達経路の変化を識別するために抗体のアレイのためのプロトコルを提案する.薬/低酸素/超紫外光・放射、または過剰発現/ダウンレギュレーション/ノックアウトによって発生、これらの変更は様々 な疾患モデルの重要であり、治療が有効になりますまたは薬のメカニズムを特定することができるかどうかを示すことができます。抵抗。
Abstract
タンパク質リン酸化ネットワークの異常調節がん患者はしばしば、チロシンキナーゼ阻害剤と扱われます。反応率が 85% に近づいているが一般的です。残念ながら、患者頻繁なる治療に不応性のシグナル伝達経路を変えることによって。マイクロ アレイによる発現プロファイルの実装は、全体的な mRNA レベルの変更を識別できるとプロテオミクス蛋白質のレベルの全体的な変化を識別することができます。 または、タンパク質ですが、シグナル伝達の活動を識別することができます。経路は、タンパク質の翻訳後修飾を尋問することによってのみ設定できます。その結果、シグナル伝達経路の任意の変化を特徴付ける能力、または薬物治療が成功したかどうか、または抵抗が生じたかどうかを識別する能力は、重要な臨床的課題です。ここでは、様々 な翻訳後修飾 (例えば、リン酸化) でシステム全体にわたる変更を特定するツールとしての抗体のアレイの詳細な説明を提供します。抗体のアレイを使用する利点の 1 つは、そのアクセシビリティ (配列は、プロテオミクスの専門家か、高価な装置は必要ありません) と速度が含まれています。翻訳後修飾の組み合わせをターゲット配列の可用性は、主な制限です。さらに、抗体のアレイは、最も広く特徴付けられたターゲットに最適に対し公平なアプローチ (プロテオミクス) が新規発見に適してあります。
Introduction
対象となるチロシンのキナーゼ阻害薬 (TKI) の臨床の実装は、そのドライブ メタアナライシス医師を特定のタンパク質を対象とする効果的なツールを提供することでがん治療を変えてきました。これらの化合物を阻害またはチロシンのキナーゼ1,2の対象となるタンパク質のリン酸化をブロックします。こは一部開発された様々 な重要な遺伝子をシグナル伝達における遺伝的変化が十分にドライブ癌の開始そして進行 [例えば、上皮成長因子受容体 (EGFR) においてチロシン蛋白質キナーゼ Src (SRC) のでBCR-ABL とひと上皮成長因子受容体 2 (HER2)]3,4。分子シグナリング経路6細胞周期5この影響から、不特定多数に向けた誘導分子がん治療への変換を表します。ず対化学療法の主な利点は高められた奏効率と健康な細胞7への毒性のリスクが低い。その結果が増えているこの小説総合研究に着目。
ゲノム シーケンスの結果へのアクセスは人間ゲノム プロジェクト8,9,10で開始し、様々 な次世代 (ネクストジェン) がん努力を配列 [例えば、がん遺伝子と今日続けてアトラス (TCGA)11,12]。これは、たくさんの遺伝子の同時情報および/またはの遺伝子または蛋白質の生物学的摂動13によって変調された公平なスナップショットを提供する多くの実験的方法論を触発しています。細胞機能の調節は、タンパク質とその活性の翻訳後修飾遺伝子の転写から、複数のレベルで行われるために、細胞機能を制御するイベントの完全な理解が最終的には様々 な生物学的読み出しからのデータの統合が必要です。たくさんの遺伝子単一セルの解像度を持つ遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA) レベルを監視する機能は、全ゲノム規模で遺伝子の機能や相互作用について推論する能力を増加しています。ただし、遺伝子発現アレイの解釈常に不完全になります本質的に規制の他のレベルの統合なし: すなわち、タンパク質発現、タンパク質変更状態、およびタンパク質の翻訳後修飾(リン酸化、ユビキチン化、メチル化、等) の変更。ここでは、単一の実験14,15,の諸条件の関数としてシグナル伝達の重要なコンポーネントの翻訳後修飾を調査する手段として抗体のアレイの有用性について述べる16。
リン抗体のアレイは区別信号伝達経路16の変化を分析して用いることができます。これらは、遺伝子組み換えや細胞キナーゼ阻害剤, 化学療法, グルコース欠乏、低酸素症、または血清飢餓によるストレスの治療から生じることができます。メモや特定の遺伝子、薬剤耐性やダウンレギュレーションもあります変更信号伝達経路17で。
薬剤耐性はたとえば、感度を避けるために薬剤標的の変異から生じる。肺癌の EGFR 遺伝子変異を特定のこを寄せつけないが、他の人に影響を受けやすいがんのレンダリング知られています。代替シグナル伝達経路突然変異17時にアクティブにできます。抵抗と低酸素症などに関与するシグナル伝達経路の同定のための広範なアプリケーション、としてリン抗体のアレイに、もっと洞察力を提供し、その結果の理解、メカニズムが関与しています。
蛋白質の修正の評価を可能にする技術は、頻繁に酵素や蛋白質間の物理的な相互作用の活性を調節することなどの規制の機能を提供するためにシステム生物学の重要なコンポーネントを表しています。翻訳後修飾の重要性は、ほぼすべて細胞外トリガー信号伝達経路18タンパク質リン酸化の役割によって示されています。従来、研究者は 1-5 ターゲットのみに興味がある場合は特に、キナーゼまたはタンパク質のリン酸化状態の識別を西部のしみの分析による特定でした。西部のしみは非常に選択的と事前の知識に向かってバイアスすることができ、結果として重要なターゲットを見逃す可能性があります。抗体アレイは、(例えば、ガラスまたは硝酸セルロース) 固体マトリックスにおける種々 のキャプチャ抗体[パンに固有のリン酸化 tyrosine(s)、抗ユビキチン等]を埋め込むことによって複数のターゲットの中の読み出しを提供します。二次抗体は、サンドイッチ ベース ELISA 形式 (図 1) で特定の蛋白質に関する情報を提供します。この試金なるより強力で適切な関心のある複数のターゲットまたは事前の知識は制限されている15。リン配列は、リン酸化として幅広いターゲット 1 つの実験でのタンパク質の一般的な金額を比較でき、質量分析法で大幅に改善された数量より広く即戦力です。この手法は、新規または未知のリン酸化部位の同定に適用されません。
大規模な質量分析を用いたプロテオミクスは、タンパク質19の特定のリン酸化サイトを識別するために用いることが可能します。この手法は、数千の翻訳後のイベントを列挙できる、高価な計測器、専用実験的パイプライン、およびほとんどの研究者の手が届かない計算の専門知識が必要です。
抗体のアレイは、様々 なタンパク質の読み出し16の同時読み出しを提供します。ユビキチン化タンパク質 (ユビキチン配列) のリン酸化に変更があります。このアレイ技術の主な利点は重要なセルのパラメーター (53 kDa、p53、チロシンキナーゼ受容体、細胞内のタンパク質) に関連付けられているさまざまな生物学的経路の生物学的状態に関する重要なフィードバックを提供すること同時に。さらに、例えばアポトーシスとユビキチン ・ リン酸化アッセイの浸透を高めるためさまざまな配列型を組み合わせることが可能です。場合の重要な利点の時間および費用有効方法で特定の機器や専門知識を必要としないいくつかのサンプルの様々 な翻訳後修飾変化を同時に評価するために複数のアレイを結合するこの能力は抗体アレイです。
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Protocol
1. 蛋白質の抽出
- ティッシュ文化フードの 10 mm 組織培養プレート (またはフラスコ) 5 x 10 の6セルをプレートします。セルの自動カウンターまたは検定でのめっき時のセルをカウントします。また、セル数を推定します。
- リンスの 10 mm プレート (またはフラスコ) 上に成長した細胞リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL で徹底的に 3 x (pH 7.4 を =)。換散バッファーを追加する前にすべての PBS を削除することを確認します。
注: 換散バッファーは通常キットで提供されます。Radioimmunoprecipitation アッセイバッファー (RIPA) または任意他のホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含むセル換散バッファーを使用していない場合。 - セルにバッファーの適切な量を追加し、換散バッファーに細胞スクレーパーで細胞をこする細胞換散バッファーの 1 x 107細胞/ml を溶解させます。(例えば、HeLa 細胞と MiaPaCa-2 用 10 cm プレートごと 600 μ L)。
- (約 10 倍) 上下添加し、新しい 1.5 mL チューブにそれを転送します。
- ロッカー/シェーカーで好ましく、4 ° C で 30 分の lysates を孵化させなさい。Cell membrane(s) の適切な停止を確保するための 10 の x 用 27 G 針付きの注射器の [ライセートを押します。また、ライセート超音波します。-20 ° C での溶解液を格納またはすぐにそれらを使用します。
- ライセート 4 ° C 15 分で 14,000 × gで遠心し、きれいな 1.5 mL チューブに上清を転送します。
- ビシンコニン酸アッセイ (BCA)20またはローリーやブラッドフォードなどと同等で総蛋白量を量的、少なくとも 50-400 μ g に進みます。タンパク質はすぐにまたは因数を使用し、凍結/ストアに-70 ° c (複数の凍結融解サイクルを避けるため)。
2. 人間クレアチンホスホキナーゼ配列
- 部屋の温度 (約 1 時間) に開始する前にすべての試薬をもたらします。
注: すべての試薬とプラスチックの摩耗は、キットに含まれます。 - 製造元の指示に従って、次の手順を開始する前にすべての試薬新鮮 (バッファー配列) を準備 (ターゲット ・ アレイの選択によって手順が若干異なるかもしれません)。
- 100 μ L の脱イオン水で検出抗体カクテルを再構成または製造元の指示をに従って、提供される 1.5 mL 試験管の異なる必要があります。
- 25 x 960 mL の脱イオン水で洗浄バッファーの 40 mL を希釈して洗浄バッファー × 1 を準備し、反転でそれらをミックスします。
注: 結晶は室温で溶解します。バッファーは、時間の経過とともに黄色がありますがまだ動作します。 - 8 よくマルチ トレイ (または 4 よくマルチ トレイに 2 mL) の各ウェルに配列バッファー 1 の 1 mL のピペットします。
- フラット チップ ピンセットで保護シートの間に配列膜を削除し、井戸に配置します。膜上の数字は上向きに直面していることを確認します。
注: 水没時に膜の色素が消えます。 - フタ付きトレイをカバーし、室温で 60 分間のロッキング プラットフォーム シェーカーで孵化します。
注: これは膜の妨害のステップです。 - 潜伏期間中に蛋白質のサンプルを準備します。総蛋白の 50-100 μ g を追加します。ライセート、1 mL の最終巻に換散バッファーの 334 μ L の最大容積を希釈します。
注: 総蛋白の 50-100 μ g で通常は十分です。 - 配列バッファー 1 を慎重に吸引し、ロッキング プラットフォーム シェーカーの 2-8 ° C で一晩サンプル 1 mL で膜を孵化させなさい。
注: はないタッチ/スクラッチ膜。 - 次の日は、20 mL の 1 x 洗浄バッファーで慎重に各アレイを削除して、個々 のプラスチック容器 (約 8 × 11 cm2) に配置することによって配列を洗ってください。常温洗浄液 x 1 のロッキングのプラットフォーム上膜の 3 × 10 分を洗ってください。
- 再構成された抗体カクテルの 20 μ L をピペットからステップ配列バッファー 2 x 1 の 2.3 に 1 mL。この溶液の 1 mL を使用する場合は、各 8 ウェルに追加します。
- 洗浄トレーから膜を慎重に取り外します。過剰な洗浄バッファーを削除し、抗体カクテルを含むトレイにそれらを転送紙タオルに下端をしみ。蓋とトレイをカバーし、ロッキングのプラットフォームで室温で 2 時間インキュベートします。徹底的に dH2O で使用されるトレーを洗い、後の使用のためにそれらを乾燥します。
- 慎重に各アレイを削除し、20 mL の 1x 洗浄バッファーできれいな個々 のプラスチック容器 (約 8 × 11 cm2) に配置します。室温でロッキング プラットフォームに洗浄バッファーで 3 x 10 分洗ってください。
- ストレプトアビジン-HRP (キットに付属) または x 配列バッファー 2 15 mL の試験管に 1 のストレプトアビジン蛍光色素 (もっと定量的な検出) の縮尺を希釈します。
- HP ソリューションを含む 8 よく料理に膜を返し、(存在する場合は、任意の光の露出を避けるためにアルミ箔でトレイをラップ、蛍光) ロッキング プラットフォームで室温で 30 分間それらを孵化させなさい。
- 3 M の紙の 5 mm の 2 個の間に膜を置くことによって余分なバッファーを削除します。X 線フィルム ・発光固体撮像素子と画像 3 分の HRP 検出ソリューション (ミックス 2 化学発光ソリューション 1:1) と乾燥膜をインキュベートし、透明なプラスチック シート プロテクターに膜を配置します。
注: 乾燥 membrane(s) も蛍光シグナルを検出する蛍光イメージャに配置されることがあります。イメージングの前に膜に光の露出を最小限に抑えます。X 線フィルムまたは撮像素子ファイルの定量化、露出オーバーを避けるため。ほとんどの化学発光/蛍光イメージャは、信号の飽和を避けるために機能を持っています。
3. データ分析
- 画像処理プログラム21ImageJ をダウンロードしてソフトウェアをインストールします。
- ImageJ を「ImageJ アイコン」をダブルクリックして開きます。メニュー バーで'ファイル'をクリックして分析するイメージを選択し、ドロップダウン ・ メニューから「開く」選択し、目的画像コンピューター ファイルを参照。ファイルを開くをクリックします。
- メニュー バーの [編集]をクリックし、ドロップ ダウン メニューから「反転」を選択、分析 (黒い背景に白い斑点、白い背景に黒い斑点) の画像を反転します。
- ツールバー (ImageJ] ツールバーの 2 番目のオプション) から「楕円形アイコン」を選択します。円/楕円を描画するには、画像 (黒い十字) をクリックして、マウスを移動します。ドットしみ上のドットを取り囲むように円・楕円の形と大きさを調整します。
- メニュー バーで[分析]をクリックし、選択した領域 (領域、平均、最小値、および最大) の値を持つ新しいウィンドウを自動的に開くドロップダウン ・ メニューから'メジャー'を選択します。
- センター (put 真ん中に右矢印のポイント) から円をドラッグして円形の領域を移動、次の測定 (ドット) 周辺に置きます。関心、肯定的な制御、負の制御、および分析の背景のすべてのスポットを測定します。
注: 否定的な制御は、PBS、背景なし (任意の部分を行います) の任意の場所、膜の一部である、肯定的な制御は、製造元によって提供される制御。 - PBS のネガティブ コントロール スポットを選択し、各スポットから値を減算します。各受容器のチロシンのキナーゼ (RTK) を表す重複スポットの各ペアの強度の平均値します。各平均強度は、フォールドの変更を計算するコントロールに関連付けることができます。
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Representative Results
細胞のシグナル伝達経路に TKI 抵抗の影響を調べるためには、4 つのサンプルを分析しました。1 つのサンプル (H3255r1) および 3 TKI 耐性細胞株 (H3255r2 4) (図 2) スポット抗体のテンプレート (図 3) に関連していた。すべての 4 のサンプルは、このプロトコルを使用して準備されました。差動活動 6 リンタンパクは抗体のアレイ (図 4) の分析のデモに選ばれました。ヒート マップ (図 5) は、重要なシグナル伝達タンパク質の蛋白質のリン酸化の変化の半定量的な読み出しを提供します。西部にしみが付くことなど、直交のアプローチを実装することにより、配列の結果の検証を完了できます。
図 1: 半定量的な抗体のアレイのスケマティック。抗体のアレイは、キャプチャー抗体のコレクションがガラスまたはニトロセルロース サポートで埋め込まれる場所、サンドイッチ免疫測定法原則に基づいています。セル lysates は膜と孵化させるし、配列は二次抗体の影響を受けます。化学発光基質からかより定量的な情報を半定量的な読み出しを取得可能性があります蛍光ベースのイメージング。フィルムまたは TIF 画像から派生した任意の信号は、濃度及び各蛋白質のフォールドの変更の計算で処理可能性があります。全体のプロセスは約 1 日かかります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 例リン抗体アレイ撮像素子開発。輝点は、複製 (ターゲットあたり 2 点) で検出されます。サンプルとスポットを肯定的な制御は、様々 な強度を示しています。膜 A と B にそれぞれ分割 TKI 感受性 H3255r1 と 3 の耐性 (H3255r2 4) サンプルの配列との比較は、ここで示すように、この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 配列スポットの地図。マップは、抗体の標的にスポットをリンクします。スポットが A をラベル - G 上下 1 10 水平方向に。肯定的な制御 (オレンジ) はすべての膜上に存在、通常コーナーで発見します。サンプル スポットが黄色で強調表示されている、黒の負の PBS コントロールが強調表示されます。すべてのアレイの抗体のリストも、識別のため提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: データ解析例。(A) 関心、肯定的なスポットの強度制御、および背景地図上で識別され、すべてのサンプルを測定します。(B) 相対強度 (肯定的な制御の強度に正規化し、削除の背景強度とスポットの強度) は、少数の選ばれた候補者の横棒グラフに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: H3255 敏感な (r1) と抵抗 (r2-4) 細胞の差動信号のヒートマップ。スポットで相対強度は、すべて 4 サンプルの CREB、P53、AKT、STAT5 の変更の比較のためヒート マップを生成に使用されました。青22その下位レベルが表示されている間、赤の様々 な色合いの任意の高レベルが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
多くの生物学的読み出しを組み合わせたアプローチは、実行の実験で細胞機械装置の本質的により正確な表現です。リン抗体のアレイの出現は、任意の単一蛋白質の変更状況よりもっと有益かもしれない変更のパターンの迅速な評価できます。リン抗体のアレイのアプリケーションの一般的なワークフローは、セリン、スレオニン、チロシンの変更に基づいています。この例は肺癌の治療抵抗性に関連する変化に焦点を当てた。このアプリケーションの主な理論的根拠は、蛋白質のリン酸化多くのひとがん18、シグナル伝達における中心的な役割を果たしている、このメソッドは、他のシステムに譲渡することが可能です。がんにおけるリン酸化の調節不全を行なったり、チロシンキナーゼの活性としたがって、リン酸化基質 (しばしば自動リン酸化キナーゼ自体を含む) は、現在よりも高いレベルで通常生理学的な設定と、したがって、癌細胞のリン蛋白質のかなりの部分を作ること可能します。リン酸化のこれらのより高いレベル簡単に検出を行います。さらに、蛋白質のリン酸化は以来異常チロシンリン酸化癌23の多くの種類の特徴は、医療の意義です。さらに、この手法はリン酸化を利用する他の生物系の調査に譲渡することは、ここで説明する機能の多く簡単に調節できる蛋白質のアレイ (ユビキチン、アポトーシス、の他のタイプに焦点を当てるなど)。
リン抗体のアレイは探索メソッド、または 1 つの特定の経路の検証として関与する、任意の信号経路を識別するために活躍しています。様々 な企業では、蛋白質の全面的なレベル、両方のリン酸化状態のキットを作る。リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の解析やマイクロ アレイより定量的な彼らは mRNA レベルのみを考慮に入れると翻訳と翻訳後修飾が対処することはできません。糖鎖修飾、ユビキチン化などの翻訳後修飾は、リン酸化、離れて配列24,25によって対処できます。
抗体のアレイを開始する前に考慮する重要な要因の 1 つは積極的に割ると健康な細胞から始めることです。低酸素、酸化ストレスや炎症は、結果のスキューが正しく扱われる場合に誤解をレンダリングでき信号伝達経路26に変化をもたらす可能性があります。このストレスは、メディアまたは少なすぎる、またはあまりにも多くの細胞をめっきする定式化したり不十分な規制環境、または、コントロールと見本をやや別様に扱うに細胞を公開するのに帰することができます。通路番号の差が大きいまたは文化の後解凍の時間私たちは指摘しています。これらの人工的に導入された変数を避けるための鍵は、できるだけ一貫性を持つサンプル間のすべてを維持することです。実験中 FBS 割合またはメディア ボリューム等を変更することはありません。
データ分析もアレイ実験を開始する前に考慮する必要があります。化学発光アレイ解析は半定量的であり蛍光アプローチ約 2 桁にダイナミック レンジは大きくなりますが、ダイナミック レンジが約 1 桁。配列が実行されるスケールは、特定の生物学的質問によって異なります。すべての変更のためのポスト翻訳の修正は元の細胞株と比較して興味の 1 つ固有抵抗性細胞系を分析したり、さまざまな耐性細胞株の 1 つの特定の経路に焦点を当てることが可能です。このアプローチのスケーラビリティは、計画の初期段階で考慮されなければなりません。さらに、抗体配列の結果は、新鮮な試料の二次的な方法および/または同じ溶解液によって常に確認すべき。西部のしみの分析は、特定のターゲットに変更を確認する使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ローレンス j. エリソン医学研究所の変革 USC (デビッド ・ アグスにギフト) の寛大な財政支援に感謝しております。秋ビーマーと生成につながるリサ Flashner の支援と本稿の出版感謝いたします。ローラ Ng は、彼女の管理のサポートを感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100 mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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