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Artículo de método

Inyección de ácido oleico en cerdos como modelo de síndrome de dificultad respiratoria aguda

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DOI:

10.3791/57783

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26 de octubre de 2018

En este artículo

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo para inducir una lesión pulmonar aguda en el cerdo por inyección venosa central de ácido oleico. Se trata de un modelo animal establecido para estudiar el síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA).

Resumen

El síndrome de dificultad respiratoria agudo es una enfermedad de la pertinente unidad de cuidados intensivos con una incidencia que oscila entre 2.2% y 19% de los pacientes de la unidad de cuidados intensivos. A pesar de tratamiento avances durante las últimas décadas, SDRA pacientes sufren todavía las tasas de mortalidad entre 35 y 40%. Todavía hay una necesidad de más investigación mejorar los resultados de los pacientes afectos de SDRA. Un problema es que no hay modelo animal solo puede mímico el pathomechanism complejo del síndrome de distrés respiratorio agudo, pero existen varios modelos para estudiar diferentes partes de la misma. Inyección de ácido oleico (OAI)-lesión pulmonar inducida es un modelo bien establecido para el estudio de estrategias de ventilación, distribución mecánica y ventilación y perfusión pulmonar en animales. OAI conduce al intercambio de gas seriamente deteriorada, deterioro de la mecánica pulmonar y la interrupción de la barrera alveolo-capilar. La desventaja de este modelo es la controvertida importancia mecanicista de este modelo y la necesidad de acceso venoso central, que es un reto especialmente en los modelos animales más pequeños. En Resumen, OAI-inducida del pulmón lesión conduce a resultados reproducibles en animales pequeños y grandes y por lo tanto, representa un modelo adecuado para el estudio de SDRA. Sin embargo, más investigación es necesaria encontrar un modelo que imita todas las partes del SDRA y carece de los problemas asociados con los diversos modelos existentes hoy en día.

Introducción

El síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome de cuidados intensivos que se ha estudiado extensivamente desde su primera descripción hace unos 50 años1. Este cuerpo de investigación condujo a una mejor comprensión de la patofisiología y causa el desarrollo de ARDS resultando en atención al paciente y resultado2,3. Sin embargo, la mortalidad en pacientes con SDRA sigue siendo muy alta con unos 35-40%4,5,6. El hecho de que alrededor del 10% de los ingresos de ICU y 23% de los pacientes de la UCI que requieren ventilación mecánica por SDRA subraya la importancia para futuras investigaciones en este campo.

Los modelos animales son ampliamente utilizados en la investigación para examinar cambios patofisiológicos y posibles modalidades de tratamiento para diferentes tipos de enfermedades. Debido a la complejidad del SDRA, no hay solo animal modelo para imitar esta enfermedad, pero diferentes modelos que representan diferentes aspectos7. Un modelo bien establecido es la inyección de ácido oleico (OAI)-inducida por la lesión pulmonar. Este modelo se ha utilizado en una gran variedad de animales, incluyendo ratones8, ratas9, cerdos10, perros11y12de ovejas. El ácido oleico es un ácido graso insaturado y el ácido graso más común en el cuerpo de los seres humanos sanos13. Está presente en el plasma, las membranas celulares y tejido adiposo humano13. Fisiológicamente, está ligada a la albúmina mientras que se realiza a través de la circulación sanguínea13. Aumento de los niveles de ácidos grasos en el torrente sanguíneo está asociado con diferentes patologías y la severidad de algunas enfermedades se correlaciona con suero ácido graso niveles13. El ácido oleico ARDS-modelo fue desarrollado en un intento de reproducir SDRA causada por embolismo lipídico en pacientes de trauma14. El ácido oleico tiene efectos directos sobre los receptores inmunes innatos en pulmones de acumulación de neutrófilos13 y disparadores15, mediador inflamatorio producción16y célula muerte13. Fisiológico, el ácido oleico induce rápidamente progresiva hipoxemia, aumento de la presión arterial pulmonar y la acumulación de agua pulmonar extravascular. Además, induce hipotensión arterial y depresión miocardio7. Las desventajas de este modelo son la necesidad de acceso venoso central, la cuestionable importancia mecanicista y el potencial avance letal causada por hipoxemia rápida y depresión cardiaca. La ventaja de este modelo en comparación con otros modelos es la facilidad de uso en pequeños y grandes animales, la reproducibilidad válida de los mecanismos patofisiológicos en el SDRA, el inicio agudo del SDRA después de la inyección de ácido oleico, y la posibilidad de estudiar aislado SDRA sin inflamación sistémica como en muchas otra sepsis modelos7. En el siguiente artículo, le damos una descripción detallada de la lesión pulmonar inducida por el ácido oleico en cerdos y proporcionan datos representativos para caracterizar la estabilidad de los compromisos en la función pulmonar. Existen diferentes protocolos para la lesión pulmonar inducida por la OAI. El protocolo proporciona aquí es capaz de inducir confiablemente la lesión pulmonar aguda.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales aquí descritos han sido aprobados por el Comité de cuidado institucional y estado de los animales (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Alemania; número de homologación G14-1-077) y se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la Sociedad Europea y alemana de Ciencias de animales de laboratorio. Los experimentos se realizaron en cerdos anestesiados masculinos (sus scrofa domestica) de edad de 2-3 meses, 27-29 kg de peso.

1. anestesia, intubación y ventilación mecánica

  1. Retener el alimento por 6 h antes de la anestesia para reducir el riesgo de aspiración, pero permitir el acceso libre al agua para reducir el estrés.
  2. Para la sedación, inyectar una combinación de ketamina (4 mg kg-1) y Azaperone (8 mg kg-1) en el cuello y el músculo glúteo del cerdo con una aguja para inyección intramuscular (20 G) mientras el animal está en el cuadro de animales.
    PRECAUCIÓN: Use guantes cuando trabaje con el animal.
  3. Insertar catéter de vena periférica (20 G) en una vena de la oreja después de la desinfección local con alcohol.
  4. Inyecte fentanilo (4 μg kg-1), propofol (3 mg kg-1) y atracurio (0, 5 mg kg-1) por vía intravenosa para la inducción de la anestesia.
  5. Cuando el cerdo deja de respirar, colóquelo en posición decúbito supino sobre la camilla e inmovilizar con vendajes.
  6. Comience a controlar la saturación periférica de oxígeno (SpO2) por recorte del sensor a una de las orejas o la cola del animal.
  7. Ventile el cerdo con una máscara para los perros de ventilación, tamaño 2, con una presión inspiratoria pico por debajo de 20 cm H2O, un positivo de presión espiratoria (PEEP) de 5 cm H2O, una frecuencia respiratoria de 14-16/min y una fracción inspiratoria de oxígeno (FiO2) de 1.0.
  8. Iniciar una infusión continua con solución electrolítica balanceada (5 mLkg-1 h-1), propofol (8-12 mg kg-1 h-1) y fentanilo (0.1-0.2 mg kg-1 h-1) para mantener la anestesia.
  9. Para la intubación, preparación de un tubo endotraqueal común conveniente para el animal (ej., peso de 25-30 kg, diámetro interno del tubo endotraqueal (ID) 6-7 mm) con introductor de tubo endotraqueal y laringoscopio común con un Macintosh hoja 4.
    Nota: Dos personas son necesarias para la intubación.
  10. Persona 1: Tire de la lengüeta con una mano y presiona el hocico dorsalmente con la otra.
  11. Persona 2: Insertar el laringoscopio y avanzar como de costumbre hasta la epiglotis a la vista.
  12. Tire el laringoscopio ventralmente para visualizar las cuerdas vocales.
    Nota: A veces la epiglotis "pega" al palatino blando. En este caso, movilizarla con la punta del tubo.
  13. Inserte el tubo por las cuerdas vocales y retire el introductor.
  14. Bloquear el manguito del tubo con una jeringa con 10 mL de aire.
  15. Conecte el tubo al ventilador.
  16. Compruebe la colocación correcta del tubo de espiración regular de dióxido de carbono (CO2) con igual ventilación de ambos pulmones con auscultación y capnografía.
  17. Iniciar la ventilación mecánica (volumen tidal positiva PEEP 5 cm H20, 6-8 mL/kg, FiO2 para mantener la saturación periférica de oxígeno (SpO2) entre 94-98%17, de la frecuencia respiratoria para mantener presión marea del final de dióxido de carbono (etCO 2) entre 35-45 mmHG).

2. instrumentación

  1. Repliegue las patas con vendas para estirar la piel sobre el área femoral para catheterizing los vasos necesarios.
  2. Preparar una jeringa de 5 mL, jeringa de 10 mL, aguja de Seldinger, 3 vainas de introductor (5 Fr, 6 Fr, 8 Fr) con guías, un catéter venoso central con 3 puertos (7 Fr, 30 cm) con guía metálica y un catéter de arteria pulmonar (7,5 Fr 110 cm).
  3. Generosamente, desinfectar la zona femoral con desinfectante de la piel aplicando un trapo abajo técnica.
  4. Llene completamente los catéteres con solución salina.
  5. Coloque la sonda del ultrasonido en el ligamento inguinal derecho y exploración de los vasos femorales.
  6. Gire la sonda 90° para visualizar completamente la arteria femoral en el eje largo.
  7. Canule arteria femoral derecha bajo visualización ecográfica en línea con la aguja de Seldinger.
    Nota: Hay diferentes maneras de obtener acceso vascular con o sin ultrasonido. Ultrasonido-dirigida de la canulación vascular no es necesaria para este modelo.
  8. Cuando sale sangre brillante que pulsa, introducir el alambre de la dirección y retraer la aguja.
  9. Visualizar la vena femoral y canule la vena bajo visualización ecográfica en línea y aspiración continua con la aguja.
  10. Cuando la sangre venosa es aspirable, desconecte la jeringa e inserte el alambre de la dirección.
  11. Retire la aguja.
  12. Compruebe la posición de los cables con ultrasonido.
  13. Introduzca el introductor arterial (5 Fr) y catéter venoso central mediante técnica de Seldinger (ver para más detalles sobre la técnica de Seldinger, método publicado18).
  14. Repetir la punción arterial y venosa en otro lado y coloque las envolturas del introductor con técnica de Seldinger´s descrita (arteria 6 Fr, vena 8 Fr).
  15. Conecte el introductor arterial y catéter venoso central a un sistema transductor adecuado para el equipo de monitoreo.
  16. Calibrar la supervisión invasor contra el ambiente (cero) con la apertura de los tres-camino-llaves de paso a la atmósfera y presione cero todo en el monitor.
  17. Devolver las llaves de tres manera para medir la hemodinámica.
  18. Iniciar monitorización hemodinámica.
  19. Coloque todos los transductores de presión a la altura de la aurícula derecha.
  20. Interruptor de la infusión de propofol (8-12 mg kg-1 h-1) y fentanilo (0.1-0.2 mg kg-1 h-1) a uno de los puertos de la línea venosa central para mantener la anestesia.

3. ultra rápida medición de la presión parcial de oxígeno (pO2)

Nota: La medición de la pO2 con la sonda para ultrarrápida pO2-medición no es obligatoria pero ayuda a visualizar los cambios en tiempo real en la pO2.

  1. Software de visor de NeoFox abierto y haga clic en Opciones.
  2. Seleccione la ficha de calibración y haga clic en el botón de Calibración abierto .
  3. Elegir archivo de calibración y haga clic en abrir y Descargar.
  4. Confirma la ventana emergente haga clic en sí.
  5. Abra el diálogo de Opciones .
  6. Elija la pestaña calibración y haga clic en calibración monopunto.
  7. Entrar en 21% en el campo de oxígeno y la temperatura en el campo de temperatura.
  8. Haga clic en uso actual Tau y Descargar. Luego, confirmar la ventana emergente haga clic en sí.
  9. Inserte la sonda de medición ultrarrápida de pO2 a través del introductor arterial izquierda.

4. COLOCACIÓN DE CATÉTER DE ARTERIA PULMONAR

  1. Comprobar el balón del catéter de arteria pulmonar por daño.
  2. Conectarse al sistema de transductor adecuado para el equipo de monitoreo.
  3. Calibrar la presión arterial pulmonar de monitoreo contra el ambiente (cero) al abrir la llave de tres vías a la atmósfera y la prensa cero en el monitor.
  4. Devolver la llave de tres vías para medir la presión arterial pulmonar.
  5. Comience a controlar la presión arterial pulmonar.
  6. Inserte el catéter de arteria pulmonar a través del introductor venoso izquierdo (globo desinflado).
  7. Cuando el catéter de arteria pulmonar ha pasado a través de la vaina introductora, inflar el balón con 1 mL de aire.
  8. Haga avanzar el catéter de arteria pulmonar y controlar las formas de onda típicas (vasos venoso, aurícula derecha, ventrículo derecho, arteria pulmonar y presión de cuña capilar pulmonar). Desinfle el balón y comprobar, si es posible aspirar sangre a través de todos los puertos del catéter de arteria pulmonar.
    Nota: para instrucciones detalladas sobre cómo insertar catéter de arteria pulmonar, consulte la publicación anterior19.

5. inducción de lesión pulmonar

  1. Preparar la solución de ácido oleico: 0,1 mL kg-1 de ácido oleico en 20 mL jeringa y conectarlo a una llave de 3 vías.
  2. Tomar 2 mL de sangre en otra jeringa de 20 mL y agregar solución salina hasta un volumen total de 20 mL en ambas jeringas.
  3. Conecte la jeringa de segunda también la llave de 3 vías.
    PRECAUCIÓN: Use guantes y protección ocular cuando se trabaja con ácido oleico.
  4. Preparar la noradrenalina (0.1 mg/mL) para infusión continua y para la inyección del bolo (10 μg/mL).
  5. Conecte la bomba de jeringa de norepinefrina a uno de los puertos del catéter venoso central sin iniciarlo.
  6. Iniciar la ultrarrápida pO2-medición.
  7. Antes de la inducción de lesión pulmonar, anote los valores (línea base) de todos los parámetros relevantes.
  8. La FO2 a 1.0 y realizar una maniobra de reclutamiento pulmonar (meseta presión 40 cm H2O 10 s).
  9. Conecte la llave de 3 vías al puerto proximal del catéter de arteria pulmonar.
  10. Homogeneizar el ácido oleico y la mezcla de sangre/solución salina mediante la inyección repetitiva de una jeringa en el otro a través de la llave de 3 vías y seguir mezclando todo el tiempo.
  11. Cuando es una emulsión homogénea, inyecte 2 mL de la emulsión y continúe batiendo.
    Nota: Si se detiene la mezcla, la emulsión puede separar en una lipofílica y una parte hidrofílica.
  12. Estrechamente monitorizar la hemodinámica después de la inyección de ácido oleico y mantenga la norepinefrina a la mano. Si es necesario, dar la noradrenalina como la inyección del bolo (10-100 μg) o infusión continua para mantener la presión arterial media por encima de 60 mmHg.
  13. Repetir la inyección de 2 mL de la solución cada 3 minutos hasta que la presión parcial arterial de oxígeno (PaO2) / FiO2-relación está por debajo de 200 mmHg.
  14. Si la jeringa esté vacía antes de la PaO2/FiO2-cociente está entre 100 y 200 mmHg, preparar 2 jeringas más como se describe en el paso 5.1.
  15. Espere 30 minutos y volver a evaluar la PaO2/FiO2-relación. Si es todavía más de 200 mmHg, repita los pasos 5.5-5.8 hasta PaO2/FiO2-relación baja entre 100 y 200 mmHg.
  16. Si PaO2/FiO2-cociente está entre 100 y 200 mmHg, espere 30 minutos y volver a comprobar.
  17. Si es persistente por debajo de 200 mmHg iniciar tratamiento o experimento, de lo contrario preparar 2 jeringas más como se describe en el paso 5.1 y repetir pasos 5.5-5.9.
  18. La ventilación según las sugerencias del ARDS network20set.

6. final del experimento y la eutanasia

  1. Inyecte 0.5 mg de fentanilo a la anestesia continua y espere 5 minutos inyectar 200 mg de propofol y 40 mmol de cloruro de potasio a la eutanasia del animal en la anestesia profunda.

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Resultados

PaO2/FiO2-proporción disminuye después de la aplicación fraccionada de ácido oleico (figura 1). En el estudio presentado, 0.185 ± 0,01 ml kg-1 ácido oleico era necesario para la inducción de lesión pulmonar. Todos los animales mostraron una deterioro oxigenación después de la inducción de lesión pulmonar, con variedades en el tiempo más curso. En animal 1 y 3, permaneció en un nivel con pocas fluctuaciones; animal 2, observamo...

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Discusión

Este artículo describe un método de lesión pulmonar inducida por el ácido oleico como modelo para estudiar varios aspectos del SDRA grave. Hay también otros protocolos con emulsiones de diferentes sitios de inyección diferentes y diferentes temperaturas de la emulsión23,24,25,26,27,28 ,29. ...

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Divulgaciones

Todos los autores no divulgar ningún conflicto de interés financiero o de cualquier otro.

Agradecimientos

Los autores queremos agradecer Dagmar Dirvonskis excelente soporte técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Llave de paso de 3 vías azulBecton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Suecia394602
llave de paso de 3 vías rojaBecton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Suecia394605
AtracuriumHikma Pharma GmbH , Martinsried 4262659
Canula 20 GBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, España301300
Datex Ohmeda S5GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finlandia
Esquemas de desinfección; LKE & Mayr GmbH, Alemania104802
Tubo endotraquealTeleflex Medical Sdn. Bhd, Malasia112482
Introductor de tubo endotraquealRü sch5033062
Engströ m CarestationGE Heathcare, Madison EE. UU.
FentaniloJanssen-Cilag GmbH, Neuss
GlovesPaul Hartmann, Alemania9422131
Incetomat-line 150 cmFresenius, Kabi Germany GmbH9004112
KetamineHameln Pharmaceuticals GmbH
LaringoscopioTeleflex Medical Sdn. Bhd, Malasia671067-000020
Sistema lógico de control de presiónSmith- Medical Germany GmbHMX9606
Logicath 7 Fr 3 lúmenes 30cmSmith- Medical Germany GmbHMXA233x30x70-E
Masimo Radical 7 Masimo CorporationIrvine, Ca 92618 USA
Mascarilla para perros ventiladosHenry Schein, Alemania730-246
Neofox KitOcean optics Largo, FL USANEOFOX-KIT-PROBE
NorepinefrinaSanofi- Aventis, Seutschland GmbH73016
Ácido oleicoApplichem GmbH Darmstadt, Alemania1.426.591.611
Jeringa perfusora original 50ml Luer LockB.Braun Melsungen AG, Alemania8728810F
PA-Katheter Swan Ganz 7,5 Fr 110cmEdwards Lifesciences LLC, Irvine CA, EE. UU744F75
Juego de introductores de vaina percutánea 8,5 y 9 Fr, 10 cm con válvula/puerto lateral de hemostasia integradoArrow international inc. Reading, PA, EE. UU.AK-07903
Perfusor FM BraunB.Braun Melsungen AG, Alemania8713820
Cloruro de potasioFresenius, Kabi Germany GmbH6178549
Propofol 2%Fresenius, Kabi Alemania GmbH
SalinaB.Braun Melsungen AG, Alemania
Sonosite Micromaxx UltrasoundsystemSonosite Bothell, WA, EE. UU.
Acero inoxidable Macintosh Tamaño 4Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malasia670000
SterofundinB.Braun Melsungen AG, Alemania
Stresnil 40mg/mlLilly Germany GmbH, Abteilung Elanco Jeringa de Salud
10 mLBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, España309110
Jeringa 2 mLBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, España300928
Jeringa 20 mLBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, España300296
Jeringa 5 mLBecton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, España309050
catéter venoso 22GB.Braun Melsungen AG, Alemania4269110S-01
. Animal

Referencias

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Catéter de arteria pulmonarcatéter venoso centralcanulación guiada por ecografíamaniobra de reclutamiento pulmonarpresión parcial de oxígenomonitorización hemodinámicaedema alveolaranálisis histológico