Análisis de secuencia del Gene de inmunoglobulina en leucemia linfocítica crónica: Paciente material de interpretación de la secuencia

Resumen

Adjunto, presentamos un protocolo que los datos de los aspectos técnicos y requisitos esenciales para garantizar el sólido análisis de la secuencia del gene de la IG en pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL), basado en la experiencia acumulada de la iniciativa europea de investigación en CLL (ERIC).

Resumen

Durante la maduración de la célula de B, el complejo proceso de recombinación de V (D) J de gene de la inmunoglobulina (IG) junto con la hipermutación somática (SHM) da lugar a una única secuencia de ADN dentro de cada célula individual de B. Debido a que tumores malignos de células B de la expansión clonal de una sola célula, los genes de IG representan una firma molecular única común a todas las células malignas en un paciente individual; así, los cambios de gene de IG pueden utilizarse como marcadores clonales. Además de servir como un importante clonal, la secuencia del gene de IG puede actuar como una 'línea de tiempo molecular' ya que se asocia con etapas específicas del desarrollo y por lo tanto, refleja la historia de la célula de B en la transformación neoplásica. Por otra parte, de ciertas malignidades, particularmente leucemia linfocítica crónica (LLC), la secuencia del gene de IG tiene capacidades de pronósticas y potencialmente predictivas. Dicho esto, extrapolando conclusiones significativas del análisis de secuencia del gene de IG sería imposible si no estaban disponibles para ayudar en su análisis de herramientas y métodos robustos. Este artículo, aprovechando la vasta experiencia de la iniciativa europea de investigación en CLL (ERIC), datos de los aspectos técnicos y requisitos esenciales necesarios para confiable y reproducible IG gen análisis de la secuencia en la LLC, una prueba que ahora se recomienda para todos los pacientes CLL antes del tratamiento. Concretamente, se describen las distintas etapas de análisis que van desde la identificación del cambio de gene clonotypic IG y la determinación de la secuencia de nucleótidos a la interpretación clínica de los datos de secuencia de genes de IG.

Introducción

Leucemia linfocítica crónica (LLC), la forma más común de leucemia en adultos en países occidentales, se caracteriza por la expansión clonal de células B neoplásicas maduro¹. Desde una perspectiva clínica, el curso de la enfermedad es extremadamente variable con algunos pacientes experimentan una enfermedad agresiva, requiriendo el tratamiento muy temprano después del diagnóstico y a menudo recurrente o ser refractario a la terapia. Esto está en contraste con una proporción importante de pacientes (~ 30%) que presentan una enfermedad indolente, nunca necesitan tratamiento y tienen una expectativa de vida similar a la de individuos sanos de edad comparable². Esta heterogeneidad clínica se refleja en la diversidad de las anormalidades moleculares en pacientes CLL que conducen en última instancia, la patogénesis y progresión de esta enfermedad³.

Establecer que un diagnóstico preciso de la CLL es generalmente sencillo, sin embargo, la mencionada heterogeneidad clínica puede dificultar la gestión eficaz de los pacientes CLL y subraya la necesidad de marcadores pronósticos y predictivos que podría ayudar a toma de decisiones de tratamiento². Numerosos estudios han intentado refinar el pronóstico de la LLC, culminando en una abundancia de nuevos marcadores clínicos y biológicos propuesto⁴. El estado mutacional del gene clonotypic inmunoglobulina pesada variable (IGHV) es uno de los marcadores pronósticos más robustos en la LLC, en gran parte debido a que (i) permanece estable en el tiempo y conforme avanza la enfermedad, y (ii) es independiente de otros parámetros clínicos y biológicos⁵. Que no obstante, muy pocos, si cualquier marcadores, incluyendo el estado mutacional de IGHV, son actualmente aplicados en la rutina clínica en el momento del diagnóstico.

Informes iniciales sobre la utilidad clínica de la secuencia del gene de IG en fecha CLL ya en 1999, cuando 2 estudios independientes informaron que los pacientes con no o con una carga mínima hipermutación somática (SHM) (CLL unmutated, U-CLL) tienen un pronóstico peor que los pacientes portadores de un mayor carga SHM (CLL mutado, M-CLL)^6,7. Más específicamente, el grupo U-CLL consistió en albergar genes IGHV clonotypic con pocos o ningún SHM los casos y por lo tanto una alta identidad por ciento a la más cercana germline IGHV el gene (≥98%), mientras que M-CLL consistió en casos con una mayor carga mutacional (identidad por ciento a la más cercano germline genes IGHV < 98%). Desde estos primeros estudios, se ha siempre demostrado que casos U-CLL mostrar un menor tiempo para el primer tratamiento (TTFT) y supervivencia global (SG) en comparación con M-CLL.

En retrospectiva, estos estudios seminales puso de relieve el papel fundamental del receptor de células B (BcR) IG en la Patobiología de la CLL, allanando así el camino para la investigación extensa en CLL microambiental interacciones que, a su vez, condujeron a una apreciación más completa de la heterogeneidad biológica de la enfermedad^8,9. Estudios más recientes han proporcionado apoyo adicional de la importancia de los análisis inmunogenéticos en CLL revelando que casos individuales se pueden agrupan en subconjuntos debido a compartir (casi) idénticas secuencias del gene de BcR IG, un fenómeno denominado estereotipia BcR IG^{10 ,11,12,13}. Acumulación de evidencia apoya la idea de que los pacientes asignados para el mismo subconjunto estereotipados puerto clinicobiological propiedades similares que se separan claramente de otros pacientes CLL en la misma categoría SHM pero con diferentes secuencias de genes de IG; de hecho se ha divulgado que la categorización de los pacientes CLL basado en estereotipia BcR IG más refina la segregación masiva de pacientes CLL en CLL U o M-CLL grupos^{14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20}.

Desde un punto de vista clínico, cabe señalar que el estado SHM del gen IGHV clonotypic parece correlacionar con una respuesta específica a quimioinmunoterapia. En particulares, pacientes de M-CLL tratados con una combinación de fludarabina/ciclofosfamida/rituximab (FCR), el tratamiento estándar de oro para los pacientes CLL médicamente aptos carecer de defectos del gene TP53 , exhibieron significativamente más tiempo libre de progresión supervivencia (SLP) y sistema operativo en comparación con U-CLL pacientes que recibieron el mismo tratamiento^21,22,23. Por lo tanto, identificación del estado del SHM se ha convertido en importante en particular para ayudar en el manejo terapéutico de la CLL pacientes es decir, un marcador predictivo, más que para evaluar el curso clínico de la enfermedad , es decir, un marcador pronóstico. De hecho, según la reciente actualización de las directrices patrocinados por el NCI del taller internacional sobre CLL, el estado SHM de los genes cambiados de IGHV debe ser determinada en todos los casos CLL antes del inicio del tratamiento en ambos medicina general y clínica pruebas²⁴. Por otra parte, debido a la reciente aprobación por parte de agentes de tratamiento nuevo y el creciente número de fármacos en ensayos, el estado SHM de la molécula de IG puede desempeñar un papel aún mayor en el manejo terapéutico de pacientes con LLC en el futuro cercano⁵.

Este informe detalla todos los aspectos de análisis de la secuencia del gen de la IG, comenzando con la elección del material apropiado y culminando con la interpretación clínica de los resultados de la secuencia. Evaluación en profundidad de estos pasos es importante en la rutina del diagnóstico para la producción de resultados confiables y para asegurar la correcta estratificación de los pacientes dentro de ensayos clínicos. Disponen de protocolos para ayudar en la armonización de los análisis de la secuencia del gen de la IG, asegurando así que los resultados son comparables entre diferentes laboratorios.

Protocolo

El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de ética del Instituto Científico San Raffaele, Milán, Italia.

1. material selección

1. Elección del material de partida
   Nota: En la mayoría de los casos de CLL el recuento de células de tumor es alto al diagnóstico (> 80-90%). Así, la célula clasificación o enriquecimiento de las células leucémicas generalmente no es necesario.
   1. Si se utiliza sangre periférica (PB), el material más común de elección para el análisis de secuencia del gene de IG, utilice un volumen de sangre entre 10-20 mL.
   2. Como alternativa, en casos con una baja carga de células CLL, utilizar célula clasificación de muestras PB o material de otros tejidos como la médula ósea (MO) o los ganglios linfáticos (LN).
2. Tiempo de muestreo
   1. Tiempo de muestreo no es crucial, dado que el estado de IG SHM es estable extraordinarias; dicho esto, evitar toma de muestras en determinados períodos, como inmediatamente después o durante la terapia, ya que el bajo número de células de CLL puede complicar el análisis y conducir a resultados poco confiables.
3. Almacenamiento y recogida de material
   Nota: Recolección y almacenamiento de material de partida depende fuertemente de la elección de material.
   1. Para las muestras PB o BM, utilice EDTA o CPT (citrato-tris-pyridossalphosphate) tubos de para evitar la inhibición del proceso de amplificación de PCR; como alternativa, utilice tubos de heparina.
   2. Para las muestras de LN, colección las opciones son o suspensiones celulares, las biopsias de tejido fresco congelado o, en raras ocasiones tejidos formalina-fijos parafina-encajado (FFPE).

2. separación de gradiente de densidad

Nota: Si el PB o BM es la materia prima de la opción, que es el escenario más frecuente, se recomienda aislamiento de células mononucleares mediante separación de gradiente de densidad.

1. Añadir 200 μL de EDTA (EDTA de 0.5 M / pH 8.0) a un tubo estéril para recogida de 50 mL. Añadir 20 mL de PB y 15 mL de RPMI. Mezclar mediante pipeteo (2 - 3 veces es suficiente).
2. Añadir 15 mL de medio de gradiente de densidad a un nuevo tubo de recogida de 50 mL.
   Nota: en caso de que el volumen de PB es inferior a 20 mL, los volúmenes de RPMI (paso anterior) y el gradiente de densidad deben modificarse en consecuencia.
3. Lentamente la capa en la solución del paso 2.1 para que no interrumpa el gradiente. Centrifugue a 800 x g durante 20 minutos con el freno de la centrifugadora apagado.
4. Recoger el anillo de células mononucleares que se ha formado entre la capa superior de plasma plaqueta y la capa media gradiente de densidad usando una pipeta Pasteur estéril y transferir a un tubo de recogida estéril de 15 mL.
5. Añadir RPMI a un volumen final de 12 mL y mezclar. Centrifugue a 750 x g durante 8 minutos. Deseche el sobrenadante.
6. Resuspender el pellet celular con 10 mL de RPMI y repita el paso 2.5.
7. Disolver el precipitado de células en 1 mL de PBS (DPBS, sin calcio, sin magnesio). Realizar un conteo usando una placa de Neubauer mezclando 20 μl de muestra y 80 μl de 1:10 solución de Türk.
8. Si procesamiento aguas abajo de la muestra no está programado para el mismo día, Centrifugue la muestra a 750 x g durante 8 minutos. Deseche el sobrenadante y guardar el precipitado de células en-80^o C.

3. extracción

1. Decidir sobre un sustrato para el análisis de la situación SHM de genes de IG. DNA genómico (gDNA) es la opción más popular ya que no hay necesidad para un paso de transcripción reversa; por otra parte, el uso de RNA o DNA (cDNA) complementarios asegura que, al menos a nivel transcripcional, el cambio de IG clonotypic productiva y funcional es el objetivo "favorecido".
2. Utilice uno de los numerosos kits disponibles en el mercado adecuados para la extracción de RNA gDNA o total y la síntesis de cDNA (véase Tabla de materiales).
3. Evaluar la integridad del ADN o RNA utilizando sistemas de cuantificación de ácidos nucleicos sensibles. Si usando el FFPE material para el análisis, evaluar la calidad y cantidad del gDNA/cDNA extraído por amplificación por PCR de un gen conocido servicio de limpieza, por ejemplo el retinóico ácido receptor alfa (RARa), beta-actina, etc..

4. amplificación y secuenciación del gen IGHV-IGHD-IGHJ los cambios

1. Selección de la cartilla de PCR IGH
   1. Preferiblemente, realizar PCR multiplex con IGHV subgrupo específico 5' cartillas y IGHJ gene específico 3' primers^25,26. Si los resultados son subóptimos, preparar distintas mezclas PCR usando las cartillas de subgrupos específicos IGHV sola.
   2. Utilice 5' primers que hibridan a cualquiera la región líder ubicada inmediatamente aguas arriba del cambio de IG o dentro de la región de la codificación (por ejemplo, marco 1, FR1) del gen IGHV.
      1. Cartillas de líder de uso que permiten la amplificación de todo el reorganizan la secuencia del gen IGHV-IGHD-IGHJ, que a su vez permitirán la estimación precisa de los niveles SHM. Por lo tanto, cartillas IGHV líder recomienda ERIC en sus directrices actualizadas para IG gen secuencia análisis²⁷.
      2. En casos donde fallan cartillas de líder para amplificar el cambio de IG clonotypic, utilizar primers FR1 IGHV. Sin embargo, cartillas de marco no amplifican el cambio de gene clonotypic todo IG, que puede conducir a la incorrecta determinación del nivel de SHM. En este caso, estado claramente en el informe clínico que el uso de primers FR1 IGHV sobrestiman la verdadera identidad por ciento al gene del germline más cercano.
   3. Para el extremo 3', uso consenso cartillas dirigidas a los genes IGHJ, multiplex juegos de cartillas IGHJ gene-específicas o primers específicos de isotipo, dependiendo del sustrato. Secuencias de la cartilla se proporcionan en la tabla 1, mientras que la figura 1 muestra los distintos lugares para el recocido de la cartilla.
2. Amplificación por PCR de los cambios del gen IGHV-IGHD-IGHJ
   1. Preparar la mezcla de cartilla con cantidades equimolares de cada subgrupo primer(s) para amplificación imparcial.
      1. Por ejemplo, cuando usando las cartillas de líder, dos cartillas diferentes se utilizan para amplificar los cambios pertenecientes al subgrupo IGHV1. Así, utilizan una cantidad de estos 2 iniciadores (IGHV1L y IGHV1bL) que es la mitad en comparación con IGHV4L, que es el primer único para los cambios del subgrupo IGHV4.
      2. Aplicar el enfoque opuesto en el caso de los iniciadores IGHJ1-2 y IGHJ4-5. Como estos iniciadores objetivo dos subgrupos diferentes de gene IGHJ, doblar la cantidad en comparación con los cebadores IGHJ3 y IGHJ6.
      3. Utilice la tabla 1 para determinar las cantidades exactas primer cuando prepare mezclas cartilla correspondiente.
   2. Reactivos de PCR de mezcla como se indica en la tabla 2. Después de la combinación de todos los reactivos PCR en un tubo PCR, Añadir 0,5 μl de Taq polimerasa y 100 ng de gDNA o 2 μl de cDNA (cDNA se preparara con 1 μg de ARN).
      Nota: Una enzima Taq con actividad de corrección no es esencial, ya que la tasa de error de amplificación es extremadamente baja y por lo tanto no afectará el nivel de SHM.
   3. Ejecutar el protocolo PCR termal detallado en la tabla 3.
3. Evaluación de clonalidad
   Nota: El siguiente paso crítico consiste en evaluar el patrón del clonality del producto PCR. Al evaluar la clonalidad en pacientes CLL, el hallazgo más frecuente es una sola, monoclonal peak/banda.
   1. Usar métodos con alta sensibilidad, como el análisis del fragmento o del heterodúplex, para evaluación de clonalidad^28,29.
   2. Análisis del fragmento
      1. Realizar PCR multiplex utilizando 5'-labeled IGHV líder o iniciadores PCR específicos de FR1 subgrupo; Esto producirá productos de la PCR que pueden ser separados por electroforesis capilar, lo que permite la evaluación del clonality de la PCR de IGH productos basado en su complementariedad IGHV determina la región 3 longitudes (CDR3).
      2. Utilizar cebadores, reactivos y condiciones térmicas idénticas a las anteriormente mencionadas (ver tablas 1-3). Personalizado 5´-etiquetado cebadores fluorescencia están etiquetados oligos con una selección de tintes en el extremo 5'. Ejemplos de colorantes reportero 6-FAM, hexagonal, NED o TET. Así, 2 reacciones separadas deben basado en el uso de tintes diferentes 3 por reacción.
   3. Evaluar el tamaño de los productos PCR en gel de poliacrilamida 6% (6%) (este porcentaje resulta en resolución óptima), con 1 x TBE como un buffer de corriente. A 80 V durante 45 minutos.
      Nota: Se recomienda que los productos PCR pueden migrar en el gel de tiempo suficiente para que muestras monoclonales se pueden separar del fondo policlonal y el marcador del tamaño de ADN puede separarse adecuadamente. Factores como el tamaño y el grosor del gel pueden afectar la migración no solo ajuste (voltaje y tiempo) puede garantizar un resultado óptimo que dicho ajuste la tensión a 80 V durante 45 minutos es un buen punto de partida ya que minimiza el riesgo de la muestra migran también 'correr' y rápidamente apagado el gel.
   4. Busque los productos PCR de aproximadamente 500 pares de bases cuando usando las cartillas líder IGHV y 350 pares de bases al utilizar las mezclas de la cartilla de IGHV FR1.
      Nota: En raras ocasiones, casos CLL se han encontrado para llevar productos doble, monoclonales y en casos aún más raros, los casos pueden exhibir un patrón del oligoclonal. Un agente intercalante como el bromuro de etidio (EtBr) o menos peligrosas y más sensibles disponibles comercialmente manchas de ADN puede utilizarse para la visualización de ADN en geles de acrilamida con excitación UV o luz azul.
4. Purificación del producto PCR
   Nota: Productos de la PCR son purificados para eliminar cualquier fondo policlonal origina de las células B normales dentro de la muestra CLL como primer dímeros que pueden llevar a la secuencia suboptimal. Utilice cualquier método que elimina sin incorporar dNTPs y cebadores para PCR limpiar, como un tratamiento enzimático, por ejemplo, Sap (fosfatasa alcalina camarón) / Exo (exonucleasa I), o basado en la columna de purificación.
   1. El volumen total del producto PCR en un gel de agarosa de bajo punto de fusión de 3% de la carga.
   2. Permita que los productos PCR correr en el gel hasta que separe del fondo.
   3. Suprimir las bandas PCR, agudas y prominentes, purificar y responsables. Si se detectan dos cambios, ambas bandas se deben suprimir y ordenados por separado.
   4. Para realizar Sap/Exo de limpiar, siga las instrucciones del fabricante con respecto a los volúmenes específicos a utilizar; sin embargo una reacción típica puede contener 1 μl de Sap, 0. 5 μl tampón Exo e incubación de 5 x 2 μl por reacción de polimerización en cadena de 5-10 μl. Mezclar por Vortex suavemente cada muestra e Incube en un bloque PCR a 37 ° C durante 30 minutos. Inactivar las enzimas por calentamiento a 85 ° C durante 15 minutos.
   5. Coloque una pequeña cantidad de los productos PCR en un gel de agarosa al 3% para evaluar la pureza del producto.

5. Sanger secuenciación

Nota: Secuencia varias estrategias existen, sin embargo, sin importar el enfoque exacto, directo de la secuencia de ambos filamentos es obligatoria para un resultado confiable.

1. Protocolos de secuenciación general
   1. Si la amplificación se ha realizado usando las cartillas individuales, proceder con secuenciación utilizando el apropiado IGHV y IGHJ o cartillas específicas para la región constante. Este enfoque también puede ser adoptado si multiplexado fluorescencia cartillas etiquetados han sido utilizados y el producto PCR se evaluó mediante el análisis del fragmento (iniciadores de secuencia no deben ser marcados).
   2. Si han utilizado imprimaciones multiplexados y clonalidad se evaluó en un gel, utilice una cartilla aguas abajo en el primer paso de la secuencia por ejemplo, un consenso primer IGHJ con la secuencia es 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'. Alternativamente, puede utilizarse una cartilla CH si cDNA se utilizó como sustrato. A continuación, utilice subgrupos específicos IGHV líder o primers FR1 para el segundo paso de la secuencia.
2. Protocolo de secuencia de ejemplo
   Nota: Existen varios protocolos de secuenciación y un protocolo de ejemplo se detalla a continuación.
   1. Diluir 33 ng del producto PCR en un volumen total de 11.5 μl utilizando, por ejemplo, agua estéril. Desnaturalizar el producto PCR por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos. Colocar inmediatamente en hielo durante 10 minutos para evitar la formación de estructuras secundarias.
   2. Añadir 8 μl de la master mix a cada tubo con 0,5 μl (correspondiente a 5 pmol) de la cartilla.
   3. Como control, preparar un tubo que contenga 8 μl de la mezcla principal, plantilla de control de pUC18 de 0,5 μl 2 μl (-) 47 secuenciación la cartilla y 9,5 μl de agua estéril. El volumen total final en cada tubo debe ser de 20 μl.
   4. Utilice las condiciones térmicas de ciclismo para la reacción de secuenciación tal como se detalla en la tabla 4.
   5. Preparar la solución de parada mediante la mezcla de 2 μl de acetato de sodio 3M (pH 5,2), 2 μl EDTA 100 Mm (pH 8.0) y 1 μl de glucógeno (concentración 20 mg/mL), luego añadir 5 μl de cada muestra. Transferir el producto a un nuevo tubo de microcentrífuga.
   6. Añadir 60 μL de etanol al 100% (-20 ° C) y mezclar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm durante 15 minutos (4 ° C). Deseche el sobrenadante.
   7. Añada 100 μl de etanol al 70% (-20 ° C) y mezclar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos (4 ° C). Deseche el sobrenadante. Repetir una vez.
   8. Secar el pellet por 90 minutos a temperatura ambiente. Agregar 40 μl de sodio dodecil sulfato en solución (SDS) para cada muestra.
   9. Transferir la muestra a una placa de secuenciación, cubrir con la tira de tapones o sellos de cinta, carga a la máquina y realizar Sanger secuenciación. La placa de la secuencia es generalmente un 96 pocillos, fondo v, placa PCR de falda completo compatible con el secuenciador. Las placas pueden ser con código de barras dependiendo de si la secuencia es a realizar en casa, en una empresa comercial o en una secuencia académica centro/plataforma.
3. Después de la secuencia, 'unir' la 2 Lee generada a partir de los pasos individuales de la secuencia para formar un completo IGHV gen cambio es decir, la secuencia de consenso.

6. Análisis de la secuencia

Nota: Los siguientes apartados se centran en la salida obtenida de la herramienta IMGT/V-QUEST³⁰ cuando analizando cambia secuencias de IG y IMGT/JunctionAnalysis³¹, los cuales son particularmente relevantes para la investigación y reportes clínicos estudios. IMGT/V-QUEST es una herramienta de alineación que compara usuario secuencias de IG con el directorio de referencia IMGT establece³⁰. La salida de herramienta incluye varias secciones dentro de los cuales el usuario puede definir ciertos parámetros.

1. Especificar la especie, por ejemplo, Homo sapiens (humano) y tipo de receptor o locus (por ejemplo, IGH, IGK o IGL).
2. Pegar las secuencias a analizar, en formato FASTA y encabezados, en el área de texto (en lotes de hasta 50 secuencias por ejecutar). Por otra parte, se proporciona una opción para entrar en la ruta a un archivo local que contiene las secuencias FASTA.
3. Elija una de las siguientes opciones de 3 visualización para los resultados:
   1. Vista detallada: elija esta opción para obtener los resultados para cada secuencia individualmente.
   2. Ver síntesis: Seleccione esta opción para compilar una tabla de Resumen ordenada por nombre de gene y alelo IGHV o por orden de entrada de secuencia. Esta opción también proporciona un alineamiento de secuencias, en cualquier lote presentado, se asignan al mismo gen IGHV y alelo.
   3. Archivo de Excel: Seleccione esta opción para proporcionar todos los archivos de salida como hojas de cálculo incorporadas en un solo archivo. Todas las opciones de visualización tienen una gran selección de parámetros básicos y avanzados para elegir, sin embargo solamente los factores más pertinentes para el análisis de la secuencia de IG de CLL se discuten más abajo en la sección 'Resultados de representante'.

7. detención/AssignSubsets herramienta

1. Para investigar la estereotipia BcR IG dentro de CLL (más detalles a continuación en la sección 'Resultados del representante'), presentar secuencias FASTA IGHV-IGHD-IGHJ a la herramienta de detención/AssignSubsets³². La herramienta informa de que la asignación a CLL principales estereotipos de subconjuntos. La herramienta de asignación de subgrupo junto con instrucciones detalladas están disponibles en el sitio web de detención/AssignSubset³² y también en la Página Web de ERIC en la pestaña de servicios.

Resultados

Ejemplos a continuación ilustran resultados de siguiente de análisis de la secuencia de IG gen los pasos detallados anteriormente. Aunque la extracción de DNA y RNA son procedimientos de rutina para la mayoría de los laboratorios clínicos y de investigación, un primer paso crítico consiste en comprobar la calidad o cantidad del gDNA o RNA utilizando un espectrofotómetro u otra técnica adecuada con alta sensibilidad. El siguiente paso crucial consiste en amplificación por PCR de clonotypic cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ. Como se mencionó anteriormente, sólo el uso de cebadores IGHV líder permite la amplificación de toda la longitud de la secuencia del gen IGHV cambiada, permitiendo así la verdadera carga SHM que deberán determinarse; por lo tanto, cartillas IGHV líder son la elección de primer recomendada (figura 2). En raras ocasiones donde cartillas de líder IGHV no pueden amplificar el cambio de IG clonotypic, primers FR1 IGHV pueden utilizarse. Como se evidencia en la figura 3, se puede observar varios productos PCR/bandas, sobre todo cuando gDNA es el material de partida; estas bandas se deben suprimir y ordenados por separado. Si líder IGHV y primers FR1 de IGHV no dan resultados, se debe repetir el análisis usando una nueva muestra del paciente (cuando sea posible). El último punto de comprobación antes de la secuencia es determinar la clonalidad de la muestra usando análisis del fragmento (figura 4).

Secuencias obtenidas deben analizarse utilizando la herramienta IMGT/V-QUEST³⁰. Parámetros seleccionados por el usuario incluyen especies, tipo de receptor o locus, búsqueda de inserción y opción de borrado, etc. y aparecen junto con el número de secuencias analizadas. Se muestra cada secuencia FASTA y el dominio de V por IMGT/V-QUEST es remarcado en verde. Además, si la secuencia de entrada estaba en la orientación opuesta (antisentido), el programa automáticamente proporciona la secuencia inversa complementaria y dice por encima de la secuencia FASTA.

El resultado tabla resumen se proporciona directamente debajo de la secuencia FASTA, en la parte superior de la 'vista detallada' página de resultados y contiene información importante para los informes clínicos de análisis de secuencia del gene de IG en la LLC. Cada fila de esta tabla se explica a continuación.

Resumen resultado. La primera fila de la tabla de resultados indica la funcionalidad de la secuencia de entrada: una secuencia de IG cambiado puede ser productivo o improductivo (figura 5A y 5B). Un cambio de gene de IG es improductivo si paras de codones están presentes dentro de la V-D-J-región (VH) o la V-J-región (VL) o si el cambio es hacia fuera-de-marco debido a inserciones/deleciones. Una tercera salida se proporciona cuando no se puede determinar la funcionalidad, es decir, si la ensambladura IGHV-IGHD-IGHJ no pudieron ser identificada; en este caso, el Resumen de resultado diría 'No encontró cambio' o 'No encontrado cruce'. Es importante tener en cuenta que sólo productiva y, por lo tanto, deben analizarse aún más los cambios funcionales. Si el único amplificado cambio de IG no es funcional (improductivos o 'no se encontró cambio'), se debe repetir el proceso de amplificación de PCR. Si el resultado sigue siendo negativo, debe obtenerse una nueva muestra del paciente.

V-gen y alelo. La 'V-gen y alelo' fila indica la más cercana germline IGHV gen y alelo con su puntuación de alineamiento y de la identidad por ciento. Si varios genes y alelos dan la misma puntuación alta, todas se enumeran. La identidad por ciento entre la secuencia presentada y la más cercana gen IGHV y alelo es de particular importancia ya que determina el estado SHM. Este valor se calcula desde el primer nucleótido de la V región en el extremo 3' de la región V excepto el CDR3. Si se utilizan primers FR1 IGHV, la secuencia correspondiente a la de la cartilla siempre debe ser removida para asegurar tan exacto un resultado posible. Cabe señalar que un porcentaje de identidad baja (< 85%) puede resultar de una inserción o supresión (discutido más abajo) y, si fuese este el caso aparecerá una nota de 'Alerta' en la fila de 'Resumen de resultado' para alertar al usuario.

J-gen y alelo. Como se describió para el V-gen y alelo arriba, la fila 'J-gen y alelo' indica la más cercana germline IGHJ gen y alelo con su puntuación de alineamiento y de la identidad por ciento. Sin embargo, como el gen IGHJ es bastante corto y su extremo 5' han sido cortado debido a la actividad de exonucleasa, alternativas también son buscadas por la herramienta, basada en el mayor número de nucleótidos idénticos consecutivos.

D-gen y alelo por IMGT/JunctionAnalysis. Había gen y alelo por IMGT/JunctionAnalysis indica la más cercana del germline IGHD gen y alelo con el marco de lectura de D-región identificado por la herramienta en la secuencia del usuario. IMGT/JunctionAnalysis³¹ proporciona un análisis detallado y preciso de la Unión y se ha integrado en la interfaz de la herramienta IMGT/V-QUEST. Esta herramienta gestiona todos los aspectos de dificultad vinculada a IGHD gen y alelo identificación , es decir, (i) la longitud corta de la región D; (ii) el uso de 2 o incluso 3 lectura marcos; (iii) recorte de exonucleasa en ambos extremos del gene; y, (iv) la presencia de mutaciones.

Longitudes FR-IMGT, CDR-IMGT longitudes y conexiones AA. Esta fila proporciona la longitud de la FRs IGHV y CDRs se muestra entre corchetes y separados por puntos y la Unión de aminoácidos (AA). La secuencia de AA de la ensambladura ilustra (i) un cambio o fuera-de-marco (hacia fuera-de-marco posiciones se indican mediante el signo '#'), (ii) la presencia o ausencia de codones de parada (un codón de parada se muestra con un asterisco ' *') y (iii) la presencia o ausencia de la anclajes de VH CDR3-IMGT: C (2 º-CYS 104) y W (J-TRP 118).

Hypermutations somáticas predominante consiste en cambios de nucleótido único, sin embargo, pequeñas inserciones y deleciones de la región V se observan, aunque con mucho menor frecuencia³³. Cuando usando los parámetros IMGT/V-búsqueda por defecto, inserciones y eliminaciones no son automáticamente detectados; sin embargo, las indicaciones fuertes que los puede llevar una secuencia de tales alteraciones, es decir, una identidad por ciento baja o IGHV CDR1-IMGT y CDR2-IMGT longitudes entre la secuencia presentada usuario más gene del germline y alelo, son detectados por el herramienta y una alerta de advertencia aparece debajo de la tabla de Resumen de resultados (figura 5).

IMGT proporciona una opción denominada 'Buscar inserciones y canceladuras' en la sección 'Parámetros' ubicada debajo de la sección de 'Mostrar resultados'. En los casos donde aparecen las advertencias pertinentes, es aconsejable utilizar esta funcionalidad. Cuando se detectan las inserciones y eliminaciones, información comprensiva del hallazgo es proporcionados en la sección de 'Resultado Resumen' incluyendo (i) donde la inserción o supresión es situado , es decir, VH FR-IMGT o CDR-IMGT; (ii) el número de nucleótidos insertados o borrados; (iii) la secuencia (solamente para inserciones); (iv) si se ha producido un mutágeno ' frameshift '; (v) el codón de la V región desde el que se inicia la inserción o supresión; y (vi) la posición del nucleótido afectado en la presentada (figura 5). Para inserciones, la herramienta quita la insertion(s) de la secuencia de usuario presentado y luego volver a analiza la secuencia utilizando los parámetros estándar de IMGT/V-QUEST. Si se detectan deleciones, la herramienta agrega lagunas, representados por puntos, para reemplazar a los eliminados nucleótidos antes de repetir el análisis.

En cuanto a cada prueba diagnóstico o pronóstico realizado en los laboratorios clínicos, normas estrictas y un alto nivel de reproducibilidad son de suma importancia. La salida IMGT/V-QUEST proporciona gran parte de la información necesaria para informar los resultados de análisis de secuencia del gene de IG en la CLL, es decir, (i) el IGHV, IGHD y IGHJ genes y alelos utilizados; (ii) la funcionalidad de la clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen cambio es decir, si el cambio es productivo o improductivo; y (iii) la identidad por ciento de los cambiados IGHV gen y alelo en comparación con su más cercano del germline IGHV gen y alelo. Para información completa sobre los informes clínicos de los genes de IG en la CLL, la interpretación de problemáticas o técnicamente difíciles casos y recomendaciones para la determinación precisa y robusta de la situación SHM de gen IGHV en CLL, se dirige al lector a recientemente actualizado ERIC directrices e informes^27,34.

Finalmente, debido a nuestro creciente conocimiento sobre estereotipia BcR IG en la LLC, un requisito adicional recomendado para la presentación clínica de los cambios de gene de IG en la LLC se refiere a la asignación de casos a subconjuntos principales estereotipados. Ahora se recomienda indicar en el informe clínico si el cambio de gene de IGHV productivo analizado puede ser asignado a uno de los principales subconjuntos estereotipados, es decir, subconjuntos #1, #2, #4 o #8^12,27. Asignación a subconjuntos principales de CLL estereotipado debe realizarse con el uso de la herramienta (figura 6) de detención/AssignSubsets³².

5' primers FR1 IGHV	Secuencia de primer		Cantidad de 60 μL de mezcla de primer
IGHV1	CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG		10
IGHV2	CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG		10
IGHV3	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG		10
IGHV4	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG		10
IGHV5	GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC		10
IGHV6	CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG		10
5' cartillas IGHV líder
IGHV1L	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG		5
IGHV1bL	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)		5
IGHV2aL	CA DE AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (AIRE ACONDICIONADO)		5
IGHV2bL	AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC		5
IGHV3aL	AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC		5
IGHV3bL	AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (AIRE ACOND. / T) GC		5
IGHV4L	AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT		10
IGHV5L	AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC		10
IGHV6L	AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC		10
3' cartillas IGHJ
IGHJ1-2	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC		20
IGHJ3	TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC		10
IGHJ4-5	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC		20
IGHJ6	TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC		10

Tabla 1. Secuencias de la cartilla y cantidades para la amplificación por PCR de clonotypic cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ.

Reactivo de	Volumen (μL)
RB x buffer 10	5
MgCl2 (50 mM)	3
dNTPs (10 mΜ)	2
Mezcla de líder/FR1 primer IGHV (10 μM)	3
Primer IGHJ de la mezcla (10 μM)	3
H2O	31.5
Volumen total	47.5

Tabla 2. Reactivos para la amplificación por PCR de clonotypic cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ.

Temperatura	Duración	Número del ciclo	Descripción
94 ° C	5 minutos	1	activación de la polimerasa
94 ° C	1 minuto	39	desnaturalización
59 ° C	1 minuto		de recocido
72 ° C	1.5 minutos		extensión
72 ° C	10 minutos	1	extensión final
18 ° C	∞	1	preservación

Tabla 3. Condiciones térmicas de ciclismo para la amplificación por PCR de clonotypic cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ.

Temperatura	Duración	Número del ciclo	Descripción
94 ° C	5 minutos	1	activación de la polimerasa
96 ° C	20 segundos	30	desnaturalización
50 ° C	20 segundos		de recocido
60 ° C	4 minutos		extensión
4 ° C	∞	1	preservación

Tabla 4. Condiciones térmicas de ciclismo para la reacción de secuenciación de genes de IG.

Figura 1. Representación esquemática de un reordenamiento del gen IGHV-IGHD-IGHJ con varios primer recocido sitios indicadas. 5' cartillas IGHV recuecen a la secuencia de líder que se encuentra aguas arriba de la secuencia de codificación de IGHV. 5' cartillas de marco (FR) de IGHV recuecen al comienzo de la región FR1, que se encuentra dentro del gen IGHV cambiado, mientras que los iniciadores 3' IGHJ recuecen para el final cambiado IGHJ del gene de la. UTR: región no traducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Amplificación por PCR de la cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ en 7 muestras de pacientes usando las cartillas de líder IGHV 5'. El octavo carril representa un control positivo, mientras que el control negativo para la PCR fue cargado en el noveno carril. El producto PCR esperado es aproximadamente 500 pares de bases en tamaño al usar primers IGHV líder. El asterisco en la última columna del gel indica la 100 escalera de DNA de bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Amplificación por PCR de la reordenamiento del gen IGHV-IGHD-IGHJ en 13 muestras de pacientes utilizando primers FR1 IGHV. El carril XIV contiene el control positivo mientras que el control negativo fue cargado en el carril de XV. Evidenciada en el carril 2, para que el ADN era el material de partida, se observan varias bandas de la polimerización en cadena, que debe ser suprimida y ordenados por separado. Muestras en carriles 5, 7 y 13 rindieron resultados policlonales (evidenciados por el frotis en el gel) y, por lo tanto, debe repetirse el paso de la polimerización en cadena. Si falla una segunda PCR amplificar el IG cambiado los genes de los análisis deben realizarse en una nueva muestra (si es posible) o mediante una cartilla diferente establecer. El producto PCR esperado es aproximadamente 350 pares de bases en tamaño al usar mezclas de IGHV FR1 primer. El asterisco en la última columna del gel indica la 100 escalera de DNA de bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Evaluación del clonality usando análisis genescan. En análisis genescan, productos de polimerización en cadena monoclonales dan lugar a un pico dominante de productos fluorescentes de idéntico tamaño (panel superior), mientras que los productos PCR policlonales como resultado en una distribución normal más de tamaños del producto (panel inferior). Los rastros rojos son picos en una escala de ADN marcada con fluorescencia que se carga en la misma inyección capilar como la muestra se analizan. Los fragmentos de tamaño estándar son sometidos a la misma fuerza electroforética que la muestra y por lo tanto están expuestos a las mismas condiciones de inyección. El espaciamiento uniforme de los fragmentos de tamaño estándar confirma llamada de tamaño exacto. Las huellas azules representan el monoclonal (panel superior) o policlonales naturaleza (panel inferior) de las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Ejemplos de las tablas Resumen de resultado suministrados por IMGT/V-QUEST. (A) Tabla Resumen de resultados para un cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ productiva (no parada codon(s) y una ensambladura de secuencia en el marco). V-gen y alelo y J-gen y alelo identificado en la secuencia del usuario por IMGT/V-búsqueda en este caso son IGHV4 - 34 * 01 y IGHJ6 * 02 (sobre la base de la más alta evaluación alineación de puntuación). La identidad por ciento es 99,65% debido a una mutación somática. D-gen y alelo identificado por IMGT/JunctionAnalysis es el IGHD3 - 3 * 01 en cuadro 1 de la lectura. Las longitudes de las regiones de 4 marco (FRs) así como las 3 regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se indican entre corchetes. También dispone de la secuencia de aminoácidos (AA) de la ensambladura de IGHV-D-J. En este ejemplo la Unión formada por 22 AAs. (B) Tabla Resumen de resultados para una secuencia de cambio del gen IGHV-IGHD-IGHJ que es improductiva debido a una ensambladura del hacia fuera-de-marco. Una X de la longitud de IMGT CDR3 indica que para esta secuencia de la longitud no se pudo determinar. Los signos de '#' observados en la secuencia de Unión AA indican un mutágeno ' frameshift '. (C) resultado Resumen ADVERTENCIA de baja identidad de V región (60.94%) y que indica que debe utilizarse la opción 'inserciones y canceladuras' en la sección 'Parámetros avanzados'. (D) Tabla Resumen de resultados para el caso de identidad por ciento baja del germline ilustrado en (C) después de repetir el análisis de la secuencia usando la opción 'Buscar inserciones y canceladuras'. El porcentaje de identidad correcta se muestra en los soportes y se calcula teniendo en cuenta la inserción como un solo evento mutacional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Tabla de informe de asignación de subgrupo generado por la herramienta de detención/AssignSubsets. Las secuencias FASTA IG de 10 pacientes CLL (A1-A10) se presentaron a la herramienta de detención/AssignSubsets. A4 caso fue asignado al subconjunto CLL estereotipado #2 (pacientes dentro de este grupo son conocidos por tener un mal pronóstico independientemente de la carga SHM) con alta confianza. Siete de las otros casos/secuencias no fueron asignados a un importante subconjunto estereotipado y por lo tanto, clasificado como no asignado. Dos de las secuencias presentadas (A7 y A8) no se podían utilizar para la asignación de subgrupo y en lugar de otro fueron clasificados como saltan/insalubre debido a problemas con la secuencia, es decir, debido a una ensambladura del hacia fuera-de-marco o la presencia de codones de parada. Una explicación detallada de los encabezados de tabla y la herramienta está disponible en el sitio web de detención/AssignSubsets³². Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El estudio de genes de IG en la LLC ha sido vital no sólo para proporcionar una mejor comprensión en la Patobiología de la enfermedad sino también para mejorar la estratificación de riesgo del paciente. Por lo tanto es de suma importancia que el procedimiento de múltiples paso de análisis de secuencia de genes de IG y posterior interpretación de los datos de la secuencia se realizaron de manera estandarizada. La disponibilidad de material adecuado y suficiente de paciente y el momento de muestreo no deben impactar en la capacidad para realizar análisis mutacional del gene de IG ya que la prueba puede realizarse en PB y en cualquier muestra con un alto conteo de células de tumor CLL. La separación de células mononucleares de la sangre usando métodos de gradiente de separación se realiza de manera rutinaria en los laboratorios de diagnóstico, y como siempre, debe tenerse cuidado al agregar la solución de sangre/RPMI al tubo que contiene el gradiente; esta tarea debe realizarse de forma lenta y suave para evitar alterar el gradiente y prevenir la pérdida de células.

Tras la separación de células, se extraen los ácidos nucleicos. Tanto gDNA y cDNA de SHM análisis del reordenamiento de IGH clonotypic, sin embargo, hay ventajas y desventajas para el uso de cualquier material. El flujo de trabajo de laboratorio procede más rápido cuando se utiliza gDNA puesto que no hay reversa de la transcripción debe realizarse antes de la amplificación por PCR. Dicho esto, usando gDNA como sustrato para la PCR puede dar lugar a la amplificación de reordenamientos productivos e improductivos que, a su vez, puede llevar al trabajo de laboratorio práctica adicional, es decir, purificación o gel la supresión de varios productos de PCR y la secuencia individual de todos los cambios. Al comparar los enfoques gDNA y cDNA, para este último un paso de transcripción reversa debe realizarse antes de proceder con la amplificación por PCR. Sin embargo, en este caso, para la mayoría de los casos, sólo los cambios productivos de IG serán amplificados y posteriormente secuenciados. Por lo tanto, sólo un único producto PCR purificado y secuenciado, interpretación de resultados es más sencillo.

La eficiencia de amplificación depende en gran medida la calidad del gDNA/cDNA, que deben evaluarse usando un método de cuantificación sensible y los cebadores utilizados. Los cebadores utilizados son críticos para el procedimiento analítico completo porque la determinación exacta del nivel SHM puede lograrse sólo por amplificación de la secuencia completa del gen IGHV cambiado. Un cambio integral solamente puede evaluarse si se utilizan cartillas de líder IGHV 5', lo que justifica las recomendaciones recientes de ERIC para el uso de cartillas de líder²⁷. El uso de cebadores alternativos, conduciendo a la amplificación de reordenamientos de gen IGHV-IGHD-IGHJ incompletas, no es apropiado para el análisis mutacional del gen IGHV y por lo tanto se aconseja contra. La única excepción se refiere a los casos en que varias ocasiones producen resultados negativos cuando se utilizan cebadores IGHV líder y análisis de material nuevo paciente es o no posible o también hace no dan resultados. Si uso de otra muestra del paciente o material (gDNA/cDNA) y varias cartillas establece todavía falla para producir un producto PCR, posibles razones podrían ser que la carga de la célula tumoral es muy baja o que la linfocitosis no es debido a un clon CLL (en cuyo caso el immunophenotype será re-evaluado). Cebadores utilizados para el análisis siempre deberían indicarse en el informe clínico.

Como CLL resulta de la acumulación de las células de B monoclonales con el mismo cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ, para la gran mayoría del clonality casos evaluación revelará un único pico monoclonal, es decir, una sola copia. En raras ocasiones, doble cambios o incluso patrones de oligoclonal pueden observarse³⁵. En tales casos, electroforesis en gel no es la técnica preferida para la evaluación de clonalidad y deben aplicarse métodos más sensibles como el análisis del fragmento. Una vez se haya confirmado el clonality, el paso final antes de la secuencia se relaciona con la purificación del producto PCR para garantizar la obtención de secuencias de alta calidad. Por último, la herramienta IMGT/V-QUEST es el recurso recomendado para análisis de la secuencia de IG por ERIC. Como las bases de datos IMGT se actualizan constantemente y reportan resultados de una manera bien anotada y constante, esta herramienta garantiza análisis estandarizado y facilita el análisis comparativo entre diferentes instalaciones clínicas o académicas.

Como análisis inmunogenético en CLL tiene pronóstico y, en particular, implicaciones predictivas, análisis del cambio de gene de IGHV-IGHD-IGHJ incluyendo la asignación a CLL principal estereotiparon subconjuntos, ya no sólo es deseable, pero de gran importancia. Esto es particularmente evidente en esta era de nuevas terapias y el potencial que tiene análisis del gene de IG para guiar tratamiento decisiones^{5,21,22,23,36,37 ,38}, como oficialmente indicado por la reciente actualización de las directrices patrocinados por el NCI del taller internacional sobre CLL²⁴. Que dicho, rigurosos estándares están garantizados, sobre todo como determinación del estado de la clonotypic SHM había reordenado gen IGHV en pacientes CLL no es una cuestión trivial y consiste en un proceso de múltiples paso. Lo importante, ciertas medidas experimentales, en particular la elección de los primers, rendimiento superior resultados específicos de opción o enfoques se adhieren a, otros aspectos técnicos son susceptibles a un cierto grado de flexibilidad, como la selección de materiales o la método para evaluar la clonalidad, debido a que llevan a diferencias sutiles, si los hubiera, con respecto a los resultados finales.

En la última década, ERIC se ha esforzado por promover la estandarización y armonización de los diversos métodos pertinentes a pronóstico y diagnóstico CLL. Esto se refleja en las recomendaciones publicadas y directrices para análisis inmunogenético^27,34, numerosos talleres educativos organizados y eventos, el establecimiento de una red de IG, así como un foro en línea expertos a discutir y proporcionar orientación sobre la interpretación de secuencia de genes de IG en la LLC. El objetivo general de ERIC a través de estas acciones es promover una óptima gestión clínica y atención al paciente. A pesar de intensos esfuerzos, esta tarea está lejos de ser completa y de hecho se ha vuelto más compleja debido al desarrollo de la nueva secuenciación de alto rendimiento dirigido a perfiles inmune. Sin embargo, aunque persisten retos, esfuerzos intensos para la estandardización robusto del análisis del gene de IG en la LLC siguen y son actualmente el foco de las actividades en curso dentro de ERIC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de extracción de sangre de plástico BD Vacutainer con K2EDTA: Tapón de tubo	ThermoFisher scientific	02-689-4 almacenamiento de	material
BD Vacutainer CPT Tubo de preparación de células mononucleares - Heparina de sodio	Becton Dickinson	362753	almacenamiento de material
BD Vacutainer Tubos de extracción de sangre con heparina FAQ	Daigger Scientific	366480	almacenamiento de material
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575038	procesamiento
de células Tubos de centrífuga 15 mL CS500	Procesamiento de células 352096 Corning
Tubos de centrífuga PP 50 mL CS500	Corning	352070	procesamiento celular
RPMI Medio 1640 (1X) líquido	Invitrogen	21875-091	procesamiento celular
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL	STEMCELL Technologies	17-1440-02	procesamiento celular
Pipetas serológicas 5 mL	Sarstedt	861.253.001	procesamiento celular
Pipetas serológicas 10 mL	Sarstedt	861.254.001	procesamiento celular
Pipetas serológicas 25 mL	Sarstedt	861.685.001	procesamiento celular
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) (1X)	Invitrogen	14190250	procesamiento celular
placa de Neubauer	Marienfeld-Superior	640010	procesamiento celular
solución Tuerk	Sigma-Aldrich	93770	procesamiento celular
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K1820-01 extracción de	ADN
QIAamp RNA Blood Mini Kit	Qiagen	52304	extracción de ARN
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Extracción de ADN/ARN
5X tampón de primera cadena	Invitrogen	P/N Y02321	síntesis de ADNc
Random Primers, 20 y micro; g	Promega	C1181	síntesis de ADNc
RNaseOUT& comercio; Inhibidor de la ribonucleasa recombinante	Invitrogen	10777019	síntesis de ADNc
DTT	Invitrogen	N/P Y00147	ADNc
SuperScript II transcriptasa inversa	Invitrogen	18064-014 síntesis de	ADNc
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	síntesis de ADNc, PCR
Tampón de PCR	Invitrogen	O00065	PCR
MgCl2 (cloruro de magnesio) (25 mM)	ThermoFisher scientific	AB0359	PCR
Taq ADN polimerasa, recombinante	Invitrogen	10342-020	PCR
Applied Biosystems 5′ Imprimaciones etiquetadas	ThermoFisher	scientific-PCR	/Clonality assessment
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent	Technologies	5067-4626	PCR Cuantificación de productos
Tampón UltraPure TBE, 10X	ThermoFisher Scientific	15581044	electroforesis Bromuro
etidio ultrapuro, 10 mg/ml	Gel de 15585011 científico ThermoFisher		electroforesis
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher scientific	S33102	electroforesis en gel
10X BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	16500100	gel Electroforesis
DNA Ladder 1000 bp/1 kb escalera BLUE listo para usar	Geneon	305-105	electroforesis en gel
UltraPure Agarose	ThermoFisher scientific		16500500 gel electroforesis
Agarosa a baja temperatura de gelificación	Sigma-Aldrich	A9414-250G	electroforesis en gel
Novex TBE Gels, 10%, 10 pocillos	ThermoFisher scientific	EC6275BOX	electroforesis en gel
ExoSAP-IT PCR Reactivo de limpieza de productos	ThermoFisher scientific	78201.1.mL	PCR Limpieza de productos
QIAquick Gel Kit de extracción (50)	Qiagen	28704	Limpieza de productos PCR
GenomeLab DTCS Kit de inicio rápido	Beckman Coulter	608120	Secuenciación Sanger
Solución de acetato de sodio (3 M), pH 5,2	ThermoFisher scientific	R1181	Secuenciación Sanger
Glucógeno, grado de biología molecular	ThermoFisher scientific	R0561	Secuenciación Sanger
Etanol absoluto	EMD Millipore	1024282500	Secuenciación de Sanger
Tubo SafeSeal 1,5 mL	Sarstedt	72.706	uso general
Vaso Multiply-Pro 0,2 mL, PP	Sarstedt	72.737.002	uso general
Equipo de centrífuga
Equipo	máquina
Bioanalyzer	Equipo	Agilent Technologies