Summary
Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.
Abstract
5-metilsitozin tarafından (5mC) aracılı epigenetik transkripsiyon yönetmelik ökaryotik gelişiminde önemli bir rol oynamıştır. Demethylation bu epigenetik izlerini timin-DNA glycosylase bağımlı baz eksizyon tamiri tarafından takip sıralı oksidasyon on-on translocation dioxygenases (TET1-3), tarafından sağlanır. TET2 gen genetik mutasyonlar nedeniyle veya diğer epigenetik mekanizmalar tarafından inactivation çeşitli kanserler, özellikle hematopoetik maligniteler olan hastalarda kötü prognoz ile ilişkilidir. Burada, enzimatik etkin etiketsiz insan TET2 dioxygenase ba * exchange Kromatografi kullanarak verimli tek adım arınma açıklayın. Biz daha fazla ayrı ve dört normal DNA baz (A, T, G ve C), (5-metil, 5-hydroxymethyl, 5-formyl ve 5-karboksil) dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra ölçmek bir sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yaklaşım sağlar. Bu tahlil etkinlik vahşi türü ve mutant TET2 dioxygenases değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
C5 sitozin üsleri KSY dinucleotides içinde (5mCpG) baskın metilasyonu sitedeki memeli genleri1konumudur. Buna ek olarak, son çalışmalar bir dizi sigara CpG siteler kapsamlı C5 sitozin metilasyonu (5mC) ortaya (5mCpH, nerede H = A, C veya T)2,3. 5mC değişiklik endojen retrotransposons ve gen Rehberleri3,4,5, transkripsiyon bir susturucu olarak hizmet vermektedir. DNA metilasyonu 5mC, aynı zamanda X kromozomu inactivation, gen sürecinden, nükleer yeniden programlama ve doku özel gen ifade5,6,7önemli rol oynar. C5 konumundaki sitozin metilasyonu DNA methyltransferases tarafından yürütülen ve önemli gelişimsel kusurlar8bu enzimler mutasyonların neden. 5mC işaretleri kaldırılması TET1-3 5mC oxidases9,10tarafından başlatılan. Bu TET-aile dioxygenases 5mC değiştirmek içine 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) ve 5-carboxylcytosine (5caC) tarafından sıralı oksidasyon adımları11,12,13. Son olarak, timin-DNA glycosylase 5 fC veya değiştirilmemiş sitozin baz eksizyon tamir yol11kullanarak için 5caC yerini alır.
İnsan TET2 gen myelodisplastik sendrom (MDS)14,15,16, MDS miyoproliferatif neoplazmlar () de dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik maligniteler sık mutasyona uğramış bir gen olarak tespit edildi MDS-MPN) ve MDS ve MDS-MPN16kaynaklanan akut miyeloid lösemi (AML). Vahşi türü (wt) olanlar karşılaştırıldığında TET2 mutasyonları ile kemik iliği DNA 5hmC değişiklik düzeyde hastalarda alt-TET214. Grup sayısı normal hematopoiesis ve myeloid dönüştürme17,18,19,20rolünü aydınlatmak için TET2-nakavt fare modelleri geliştirdi. Bu fareler TET2 gen mutasyonları ile başlangıçta normal ve uygun, ama onlar kendi erken ölümüne neden olan yaşlı gibi çeşitli hematopoetik maligniteler ortaya. Bu çalışmalar normal hematopoetik ayrımında wt TET2 oynadığı önemli roller gösterdi. Bu fare modelleri, heterozigoz hematopoetik kök hücre (TET2+ / HSCs) ve homozigoz TET2- / - HSCs hematopoetik soy kullanıma her iki TET2+/- içinde homozigoz wt-TET2 HSCs rekabet avantajı vardı ve TET2- / - HSCs çeşitli hematopoetik maligniteler17,18. Bu çalışmalar dioxygenase HSCs gelişimi değiştirir ve hematopoetik maligniteler sonuç TET2 bu haploinsufficiency göstermektedir.
Benzer şekilde TET2 gen mutasyonları ile fareler, çoğu lösemi hasta haploinsufficiency TET2 dioxygenase faaliyet gösterecektir. Bu çoğunlukla Heterozigoz somatik mutasyon TET2 gen vücut çoğu missense mutasyon süre boyunca dağınık çerçeve-shift ve anlamsız mutasyon dahil dioxygenase etki alanı12' kümelenmiş. Bugüne kadar küçük karakterizasyonu wt mutant TET2, özellikle TET2 dioxygenase ve onun tahlil21üretimi ile zorluklar nedeniyle literatürde bildirilmektedir. Burada, yerel TET2 dioxygenase İyon Kromatografi kullanarak basit bir tek adım arıtma raporu. Ayrıca, nicel bir LC-MS/MS tahlil en iyi duruma getirilmiş ve yerli TET2 dioxygenase enzim aktivitesini ölçmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klonlama ve etiketsiz insan TET2 Dioxygenase arıtma
- İnsan TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) yukarıda açıklanan22siteye özgü rekombinasyon teknikle pDEST14 hedef vektör içine kopyalayın.
Not: Önceki çalışmalarda C-terminal TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) etki alanı en az catalytically etkin etki alanı21,23olduğunu göstermiştir. PDONR221 vektör kullanarak etiketsiz TET2 dioxygenase etki alanı hızlı için Parlatıcı Dalgarno ve Kozak diziler PCR (Tablo 1) sırasında ileri astar dahil edilmiştir. - Etiketsiz insan TET2 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) 100 µL kimyasal olarak yetkili E. coli için dioxygenase içeren rekombinant pDEST14 ifade vektör 1 µL bakteriyel dönüşümü için ekleyin BL21 1.7 mL tüp hücrelerde (DE3). Isı şok 30 42 ° C'de ardından en az 15 dakika boyunca karışımı buz tutmak bir su banyosu içinde s.
- Hemen sonra ısı şok, hücreler için en az 2 dk buzda tutmak. Bunu, catabolite baskı (S.O.C medya) ile süper en iyi suyu 250 µL hücrelere ekleme. Bir shaker 37 ° C'de 1 h için bakteri hücreleri kuluçkaya.
- Kuluçka sonra tüp 9000 x g 1 dk. atma % 70 süpernatant için de pipetting tarafından centrifuging tarafından hücreleri aşağı spin ve sol Pelet medya üzerinden geçiyoruz.
- Hücre süspansiyon 100 µg/mL ampisilin içeren bir tabakta Luria suyu (LB) agar yayıldı. 16 h 37 ° C'de plaka kuluçkaya
- Bir izole koloni seçin ve 10 mL LB-ampisilin medya bir 50 mL tüp içine aşılamak. Bir shaker 37 ° C'de tüp gece için kuluçkaya. Bunu, 100 mL LB-ampisilin medya aşılamak için kültür 50 mL tüp 100 µL kullanın. Bir shaker 180 RPM olarak 37 ° C'de şişeye kuluçkaya ve birincil kültür olarak kullanabilirsiniz. Ertesi gün, birincil kültür her 6 mL 15 şişeler, her içeren 600 mL LB-ampisilin medya aşılamak için kullanın. Şimdi, bir shaker 180 RPM olarak 37 ° C'de 15 şişeler kuluçkaya.
Not: dönüştürülmüş klonlar doğrulamak için izole plazmid DNA ile DNA sıralama veya kısıtlama sindirim gerçekleştirin. - Bakteriyel kültür yoğunluğunu kontrol etmek için bir spektrofotometre kullanarak onun OD600 ölçmek. Kültür bir yoğunluk 0,8 OD600ulaştıktan sonra TET2 protein ifadesi ile 1 M (600 ml 0.5 mM son konsantrasyonu) IPTG her şişesi içinde 300 µL teşvik ve kültür için 16 h 17 ° C'de büyütmeyi
- 16 h sonra santrifüj şişeler için bakteri kültürü aktarmak. TET2 enzim 5,250 x g 45 dk. kullanım için de ifade bakteri kültürü TET2 arıtma bakteriyel Pelet santrifüj kapasitesi.
Not: buz üzerinde veya 4 ° C'de tüm geri kalan protein saflaştırma adımları gerçekleştirin - Bakteriyel Pelet 100 mL 50 mM MES resuspend (2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit) tampon, pH 6 ve 5 × 30 s güç 20 ile 60 s soğutma aralıkları için solüsyon içeren temizleyicide.
- Lysate 45 dakika süreyle 5,250 x g de çözünen TET2 enzim içeren süpernatant toplamak ve 0.45-µm geçmek spin bir FPLC sistemde yüklemeden önce filtre uygular.
Not: Bu deneylerde TET2 enzim çok kararlı, ama bir proteaz inhibitörü kokteyl içeren 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl florür (PMSF) ve 0,5 mM 1,10 -ogerekirse - pH lysate için hücreye eklenebilir TET2 enzim bozulma önlemek. Bunlar aşağıdaki katyon değişim kromatografi ile girişime neden olabilir gibi EDTA veya EGTA inhibitörü kokteyl kullanmaktan kaçının. - Paket 30 mL güçlü katyon değişim reçine FPLC sütun. Yıkama arabelleği (50 mM MES tampon, pH 6) 0.3 mL/dk FPLC sistemini kullanarak sürekli akış hızında 10 yatak birimlerle sütun equilibrate.
- Açıklanan yük üstüne belgili tanımlık önceden dengelenmiş sütun ve yıkama ∼10 yatak birimleri aracılığıyla akış açık hale gelinceye kadar yıkama arabelleği ile lysate.
- TET2 elute 0-100 kullanarak yıkama arabellek üzerinden % gradyan elüsyon arabellekte (50 mM MES tampon, pH 6, 1 M NaCl) 15 yatak birimleri'holding % 100 elüsyon arabellek İki Yataklı birimler için de izledi.
Not: cep lysate önce ve sonra sütun elüsyon kesirler ile birlikte yükleme (100 µL her) örnekleri toplamak ve % 10 SDS-sayfa çözme çözümleyebilirsiniz. - TET2 protein içeren kesirleri havuz, Kuru dondurmak, enzim palet 10 mL su ve-80 ° C'de store dağıtılması
2. 5mC oksidasyon TET2 Dioxygenase tarafından
- Tüm demethylation reaksiyonlar ile 3 µg substrate (25-mer çift iplikçikli DNA, Tablo 2) nüsha gerçekleştirin.
- Saf TET2 enzim 100 µg 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM FeSO4, 2 mM 2OG içeren toplam reaksiyon arabellek 50 µL içinde eklemek (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate) ve 2 mM askorbat ve 1 h2137 ° C'de kuluçkaya.
- 500 mM EDTA ile 5 µL katalize TET2 oksidasyon reaksiyonları gidermek.
- TET2 reaksiyonlar Şoklama sonra örnekleri TET2 reaksiyon karışımı oligo arıtma sütunları kullanarak DNA ayırarak LC-MS/MS analiz için hazırlayın.
- 100 µL oligo bağlama arabellek yüzeyi tepki 55 µL için ekleyin.
- Bunu, 400 µL % 100 etanol karışıma ekleyin. Bu karışımı bir oligo bağlama sütunu boyunca geçmek.
- 750 µL yıkama arabelleği ile ilişkili DNA yıkama ve 20 µL suda elute.
- DNaz 2 ünite ile izole DNA sindirmek ben ve S1 nükleaz 12 h için 37 ° C'de 60 adet bireysel nükleozit monophosphates üretmek için.
- Sindirim, 2 adet buzağı bağırsak alkalen fosfataz (CIAP) örnekleri eklemek ve ek 12 h 37 ° C'de nükleozit-monophosphates nükleozit elde etmek için fosfat grupları kaldırmak için kuluçkaya.
- Tüm nükleozit, aşağıda açıklanan LC-MS/MS yöntemiyle özellikle değiştirilmiş cytosines ölçmek.
3. nicel tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme
- Tüm değiştirilmiş sitozin nükleozitler [5-metil-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2 '-deoxycytidine (5fdC) ve 5-carboxy-2 '-deoxycytidine (5cadC)] 100 µM stok çözeltisi hazırlamak ve normal DNA (adenin, temelleri timin, sitozin ve guanin) LC-MS/MS yöntem geliştirilmesi için HPLC sınıf suda.
- Hisse senedi çözümler, tek tek beslerken tarafından nükleozit bağımlı MS/MS parametrelerini optimize, EMS 10 µL/min akış hızında kütle spektrometre Tarama kipi. Parametreler optimize etmek: her DNA nükleozit kullanarak otomatik nicel optimizasyonu için potansiyel (DP), giriş potansiyel (EP), çarpışma hücre giriş potansiyel (CEP), çarpışma enerji (CE) ve çarpışma hücre çıkış potansiyel (CXP) Declustering yazılım özelliği.
- Kaynak bağımlı MS/MS parametreleri enjekte ederek 10 µL % 25 çözücü B 0.3 mL/dk çözücü A 10 mM amonyum asetat (pH 4.0) ve solvent B 10 mM amonyum asetat (pH 4.0) ile % 20 Asetonitril olduğu yerde bir akış hızında bir degrade kullanarak hisse senedi çözüm tarafından en iyi duruma getirme. Parametreler optimize: perde gaz (CUR): 10-50, sıcaklık: 0-600 ° C, gaz akışı 1 (GS1): 0-50, gaz akışı 2 (GS2): 0-50, Collisionally aktive ayrılma (CAD): düşük-orta-yüksek, iyon sprey voltaj (IS): 4000-5500 manuel kullanarak her DNA nükleozit için FIA (akış enjeksiyon Analizi) modunda yazılım nicel en iyi duruma getirme özelliği.
- Bütün sekiz DNA nükleozitler ayırmak için sıvı kromatografi aşağıdaki degradenin kullanarak gerçekleştirmek: %0 çözücü B (0-2 dk), 0-%20 çözücü B (2-5 dk), 20-%60 çözücü B (5-9 dk), 60-%0 çözücü B (9-10 dk) ve solvent A 0.3 akış hızında 5 min için ile equilibrate mL/dk C18 sütun (partikül büyüklüğü: 5 mikron, gözenek boyutu: 120 Å).
- (Adım 3.4), yukarıda sözü edilen sıvı kromatografi gradyan ile birleştiğinde optimum MS/MS parametrelerini (Adım 3.2 ve 3.3) kullanarak yanıt doğrusallık, sınırı algılama (LOD olarak) ve miktar (LLOQ) kullanarak alt limiti belirler bir iki kat seri seyreltme tüm sekiz nükleozitler içeren bir 100 µM standart karışımı. Bütün sekiz DNA nükleozitler için standart eğriler çizmek.
- Algılamak ve tüm nükleozit, özellikle değiştirilmiş cytosines, LC-MS/MS yöntemi ve standart eğrileri kullanarak Adım 2.4'te üretilen ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TET-aile dioxygenases tarafından DNA ' 5mC dinamik modifikasyonu epigenetik transkripsiyon yönetmeliğinde önemli rol oynar. TET2 dioxygenase sık sık çeşitli hematopoetik maligniteler12' mutasyona uğramış. Normal geliştirme ve hastalık TET2 enzimi rolünü araştırmak için biz-klonlanmış herhangi bir benzeşme etiketi olmadan en az catalytically etkin etki alanı pDEST14 vektör22. Etiketsiz TET2 dioxygenase bakteriyel SDS SAYFALIK analizde toplam çözünür protein ∼5% üstlenmiştir E. coli BL21 (DE3) hücreleri. TET2 katalitik domain en yerli E. coli proteinler24,25,26', bir ba * kullanan bir etkili arınma süreci karşılaştırıldığında nispeten yüksek isoelectric (∼7.49), haklı bu yana Exchange Kromatografi geliştirilmiştir. Bu arıtma vermiştir > % 90 saf TET2 enzim tek bir adımda (Şekil 1).
Ayrı ve farklı deoxycytidines türevleri ve diğer dört doğal DNA baz TET2 enzimatik reaksiyon aşağıdaki ölçmek için hassas bir LC-MS/MS tabanlı tahlil optimize edildi. Sıvı Kromatografi ters faz C18 sütunlar kullanılır. Seri dilutions tüm nükleozitler (Şekil 2) içeren bir karışımı kullanarak standart eğrileri çizildi. Sıvı kromatografi, deneysel yordamda açıklandığı için kullanılan geçişin tüm sekiz nükleozitler (Şekil 3) çözmeniz mümkün. (Tr) kez LC saklama tüm sekiz nükleozitler için Tablo 3' te açıklanmıştır. Biz daha kendi declustering potansiyel (DP), giriş potansiyel (EP), çarpışma hücre girişi potansiyel (CEP), çarpışma enerji (CE), sınırı belirlenerek her üst iyon nükleozit (Q1), en yoğun ürün iyon (Q3) MS tespiti optimize algılama (LOD olarak) ve alt sınır olan miktar (LLOQ) (Tablo 3). Son olarak, bir LC-MS/MS yöntemi bu geliştirilmiştir ayrı ve dört normal DNA baz (A, T, G ve C), (5-metil, 5-hydroxymethyl, 5-formyl ve 5-karboksil) dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra ölçmek (Şekil 3).
Etiketsiz TET2 dioxygenase etkinliği her DNA dizisi (Tablo 2) CpG Island'da bir 5mC içeren bir 25-mer dsDNA kullanarak tespit edilmiştir. TET2 sonra Enzimatik reaksiyonları, DNA oligonucleotides saflaştırılmış ve nükleozitler dönüştürülür. O zaman bu nükleozitler LC-MS/MS tahlil için tabi tutuldu. Tepkileri TET2 enzim (negatif kontrol) olmadan tek dA, dT, dG, dC ve 5mdC doruklarına tespit edildi. Ancak, TET2 dioxygenase bulunan, pozitif kontrol tepki olarak d5hmC ve d5fC karşılık gelen iki yeni zirveleri gözlendi. Biz büyük olasılıkla onun zavallı algılama düzeyleri (Şekil 2) nedeniyle d5caC nükleozit oluşumu tespit etmek mümkün değildi. Bu sonuçlar bu yordamda saf etiketsiz TET2 dioxygenase catalytically etkin ve wt-TET2 enzim ve onun klinik mutantlar karakterize etmek için kullanılan göstermektedir.
Şekil 1. Saf TET2 dioxygenase E. coli BL21 üzerinden SDS-sayfa Analizi (DE3) hücreleri. Lane A marker süre lane SP sepharose iyon değiştirme reçine kullanarak TET2 protein saf B gösterir gösterir. Toplam etiketsiz TET2 dioxygenase ∼54 kDa okla gösterilen boyutudur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Standart eğriler çizmek için dört doğal DNA nükleozitler ve sonra onların miktar için kullanılan farklı sitozin türevleri yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Sıvı Kromatografi (alt) ve MS/MS (üstte) ayırmak ve dört doğal DNA nükleozitler ve farklı sitozin türevleri karakterize etmek için kullanılan yöntem.
| Astar adı | Astar sıra | |||
| TET2 ileri astar | 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTGTTCTCAATAATTTTATAG-3' | |||
| TET2 Ters astar | 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCATACTTTTCACAC-3' | |||
Tablo 1: DNA oligonükleotid astar etiketsiz insan TET2 dioxygenase katalitik etki alanının PCR güçlendirme için kullanılan sırası.
| Astar adı | Astar sıra |
| Anlamlı iplik | 5'-AGCCCGCGCCG/IME-dC/GCCGGTCGAGCGG-3' |
| Antianlamlı iplik | 5'-CCGCTCGACCGGCG/IME-dC/GGCGCGGGCT-3' |
Tablo 2: TET2 substrat vitro oksidasyon reaksiyonları için kullanılan anlam ve anti-anlamda 25-mer dsDNA oligonükleotid dizisi.
| Nükleozitler | Q1 | Q3 | tr (dk) | DP (V) | EP (V) | CEP (V) | CE (V) | LOD (pmol) | LLOQ | R2 | |
| 2'-deoxyadenosine | 252.2 | 136.1 | 12.07 | 41 | 9 | 14 | 17 | 0,06 | 0.198 | 0.997 | |
| 2'-deoxythymidine | 243.2 | 117.1 | 10.95 | 16 | 8 | 14 | 15 | 1.8 | 5.94 | 0.999 | |
| 2'-deoxyguanosine | 268.2 | 152.1 | 10,6 | 21 | 7 | 14 | 37 | 7,8 | 25.74 | 0.999 | |
| 2'-deoxycytidine | 228,1 | 112.1 | 6,29 | 21 | 7 | 14 | 15 | 0,1 | 0,33 | 0.998 | |
| 5-metil-2'-deoxycytidine | 242.2 | 126.1 | 9,85 | 31 | 6.5 | 24 | 13 | 0.03 | 0,1 | 0.998 | |
| 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine | 258.2 | 142.1 | 7.15 | 16 | 6 | 14 | 13 | 0,6 | 1,98 | 0.993 | |
| 5-formyl-2'-deoxycytidine | 256.2 | 140.1 | 10.92 | 11 | 6 | 14 | 15 | 0,2 | 0.66 | 0.998 | |
| 5-carboxy-2'-deoxycytidine | 272.2 | 156.1 | 4.1 | 6 | 7 | 94 | 23 | 3.9 | 12.87 | 0.993 | |
Tablo 3: En iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS parametreleri dört doğal DNA nükleozitler ve farklı sitozin türevleri pozitif iyon modu altında. Her üst iyon nükleozit için (Q1), en yoğun ürün iyon (Q3) tespit edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TET2 gen mutasyonlar çeşitli hematopoetik maligniteler olan hastalarda en sık saptanan genetik değişiklikler vardır. Mutasyonların saçma, çerçeve-shift ve missense mutasyonlar içeren farklı TET2, bugüne kadar yüzlerce hastalar12tespit edilmiştir. TET2 mutasyonlar hastalarda kemik iliği wt-TET214olanlarla karşılaştırıldığında genomik 5hmC seviyesinin düşük gösterir. Mutant TET2 çakma deneyler Bu mutasyonlar 5hmC düzeyleri,14-transfected hücreleri üzerine etkisi recapitulated. TET2-nakavt fare modelleri sonuçlarından TET2 enzim düzeyi ters hematopoetik maligniteler17,18,19,20ilerleme ile korelasyon gösterdi. Sürekli olarak, Zhang ve ark. gösterdi son zamanlarda o aşağı düzenleme TET2, ifade düzeyleri cytogenetically normal akut myeloid lösemi27' deki potansiyel bir prognostik ve akıllı biyomarker olduğunu.
TET2 normal hematopoiesis ve myeloid dönüşüm temel bir rol oynar kanıt büyüyen rağmen wt - ve mutant TET2 biyokimyasal karakterizasyonu kalır etkin TET2 üretimle ilişkili zorluklar nedeniyle temel aşamaları ve onun tahlil. En çalışmaları da zaman alan kullanılarak rekombinant TET2 baculovirus sistem böcek hücreleri14veya bir glutatyon benzeşme etiketi21kaldırılmasını gerektiren S-transferaz benzeşme etiketinde bakteri hücreleri olarak vermiştir.
Bu deneysel bir işlem içinde bir siteye özgü rekombinasyon teknik ve E. colihedef vektör (pDEST14) kullanarak verimli ifadesini kullanarak etiketsiz insan TET2 dioxygenase katalitik etki alanını klonlama nitelendirdi. Etiketsiz TET2 isoelectric noktası nispeten yüksek olduğundan (∼7.49) en yerli E. coli proteinler ile karşılaştırıldığında bir ba * exchange Kromatografi verimli kullanan bir etkili arınma süreci geliştirdiğimiz > % 90'ı saf etiketsiz TET2 tek bir adımda bir enzim.
Ayrıca, ek zorluklar wt - ve mutant TET2 dioxygenase etkinliği miktar içinde mevcut. Bu deneyler için en çalışmaları antikor tabanlı deneyleri gibi nokta lekeleri14,28dayanıyordu, enzim bağlı immunosorbent deneyi (ELISA)29, vb bu deneyleri genellikle tek bir antikor, kullandığı için Örneğin, 5hmC veya 5fC or5caC, substrat DNA'sı, 5mC değişiklik algılanması için onlar tam bir resim TET izoformlarının tarafından taşınan katalitik tepki vermeyin. Bu nedenlerden dolayı LC-MS/MS tabanlı tahlil farklı sitozin değişiklikleri ölçmek için tek tahlil olarak ortaya çıkmıştır. Bu bağlamda, biz dört normal DNA baz (A, T, G ve C), dört değiştirilmiş sitozin baz yanı sıra (5mC, 5hmC, 5 fC ve 5caC) ayrı bir roman sıvı kromatografi yöntemi geliştirdik.
Katalize TET2 reaksiyonlar üzerinden sekiz nükleozitler ölçmek için biz-birleştiğinde bizim gelişmiş sıvı kromatografi yöntemi ile tandem kütle spektrometresi. Bu hassas LC-MS/MS tahlil sonra rekombinant etiketsiz insan TET2 enzim etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. Burada açıklanan yaklaşım wt - ve mutant TET2 dioxygenase faaliyetleri değerlendirilmesi büyük ölçüde artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için mali hiçbir ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Bu araştırma ABD Savunma Bakanlığı bir fikir Ödülü (W81XWH-13-1-0174), aplastik anemi ve MDS Vakfı Hibe şeklinde tarafından finanse edildi ve UMRB grant mm yazarlara teşekkür Mohit Jaiswal ve Subhradeep Bhar ilk TET2 pDEST14 vektörde klonlama için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
