Summary
In Vivo Mikrodialyse ermöglichte Ansammlung von Molekülen im Gehirn interstitielle Flüssigkeit (ISF) von wach, frei Verhalten Tieren vorhanden. Um relativ große Moleküle in ISF zu analysieren, der aktuelle Artikel konzentriert sich speziell auf der Mikrodialyse-Protokoll mit Sonden mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten.
Abstract
In Vivo Mikrodialyse ist eine leistungsstarke Technik, ISF von wach, frei Verhalten Tieren basiert auf einem Prinzip der Dialyse zu sammeln. Während Mikrodialyse eine etablierte Methode, die relativ kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter misst ist, wurde es vor kurzem zur Dynamik von größeren Molekülen in ISF mit Sonden mit hohem Molekulargewicht abgeschnitten bewerten Membranen. Bei Verwendung solcher Sonden, muss Mikrodialyse in einem Push-Pull-Modus zu Druck im Inneren der Sonden angesammelt ausgeführt werden. Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle einschließlich stereotaktischen Chirurgie und Mikrodialyse Linien einrichten, um Proteine von ISF zu sammeln. Während Mikrodialyse können Medikamente systemisch oder durch direkte Infusion in ISF verabreicht werden. Umgekehrte Mikrodialyse ist eine Technik, um direkt Verbindungen in ISF einfließen. Aufnahme von Medikamenten in der Mikrodialyse Perfusion Puffer ermöglicht es ihnen, durch die Sonden in ISF diffundieren, während gleichzeitig die ISF zu sammeln. Durch die Messung von Tau-Protein als Beispiel, zeigt der Autor, wie die Ebenen auf anregende neuronaler Aktivität durch umgekehrte Mikrodialyse Picrotoxin verändert werden. Vorteile und Grenzen der Mikrodialyse werden zusammen mit dem erweiterten Programm beschrieben, durch die Kombination von anderen in-Vivo -Methoden.
Introduction
ISF umfasst 15-20 % der gesamten Hirnvolumen und bietet eine Mikroumgebung für Signaltransduktion, substrattransport und Abfälle Clearance1von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Möglichkeit des Sammelns ISF von lebenden Tieren größere Auswirkungen für verschiedene biologische Prozesse sowie Krankheitsmechanismus bieten. In Vivo Mikrodialyse ist eine der wenigen Methoden, die Probe und extrazelluläre Moleküle von ISF von Wachen, frei beweglichen Tieren zu quantifizieren und dient damit als ein nützliches Werkzeug in der neurowissenschaftlichen Forschung Feld2,3. Bei dieser Methode werden Mikrodialyse Sonden mit halbdurchlässigen Membranen im Gehirn und mit Perfusion Puffer auf die relativ langsame Fließgeschwindigkeit durchströmt (0,1-5 µL/min). Während dieser Perfusion extrazelluläre Moleküle im ISF passiv in die Sonde nach dem Konzentrationsgefälle diffundieren und sammeln Sie wie ein Dialysat. Obwohl dieser Artikel konzentriert sich auf die Methode zum Beispiel ISF im Gehirn, können das Prinzip und die Methode auf andere Organe durch entsprechende Modifikation bei Bedarf angewendet werden.
Mikrodialyse arbeitete zuerst in den frühen 1960er Jahren, und seit dann es ausgiebig verwendet wurde, um kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter im Gehirn zu sammeln. Aktuelle kommerzielle Verfügbarkeit der Mikrodialyse Sonden mit hochmolekularen Gewicht Membranen (100 kDa-3 MDa) abgeschnitten hat jedoch seine Anwendung auf relativ größere Proteine in ISF sowie4,5,6 erweitert. ,7. Die Studien mit diesen Sonden führte zu der Feststellung, dass Proteine wie Tau oder α-Synuclein, die lange werden exklusive zytoplasmatischen sind auch physiologisch in ISF4,5,8.
Eines der Probleme mit Mikrodialyse Sonden mit großen Cut-off-Membranen (in der Regel mehr als 1.000 kDa) ist, dass sie anfälliger für Ultrafiltration Flüssigkeitsverlust durch den inneren Druck in den Sonden angesammelt. Mikrodialyse Sonden verwendet hier haben eine einzigartige Struktur, um dieses Problem zu vermeiden. Der Druck wird nicht durch diese Struktur aufgebaut werden, so sollten Mikrodialyse mit diesen Sonden betrieben werden, in eine "Push-Pull"-Modus über eine Spritzenpumpe zum durchspülen von Sonden (= Push) und eine Walze/Peristaltikpumpe, das Dialysat kommen aus der Sonde Steckdose zu sammeln (= ziehen) 9 (obwohl es sowohl Push-als auch Pumpen, durch Druck abbrechen Luftlöcher vorhanden in den Sonden braucht der technisch nur Antrieb erfolgt durch die Pull-Pumpe). Dieser Artikel beginnt mit der stereotaktischen Operation ein Leitfaden Kanüle Implantation und beschreibt, wie Mikrodialyse Zeilen einrichten, um ISF durch Mikrodialyse Sonden mit 1.000 kDa Cutoff Membranen zu sammeln.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Use Committee der Graduate School of Medicine an der University of Tokyo.
1. präoperative Verfahren
- Wischen Sie vor Beginn der Operation alles mit 70 % Ethanol, sterile Bedingungen beizubehalten. Thermischen Unterstützung mit einem Heizkissen wird empfohlen.
- Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Chloral Hydrate (400 mg/kg). Anesthetization durch Ausführen einer Zehe Klemme zu bestätigen. Meloxicam SR auf Induktion und Buprenorphin bei Wiederherstellung Gebot wird für mindestens 24 Stunden empfohlen.
- Rasieren Sie die Haare mit einem chirurgischen Clipper. Befestigen Sie eine Maus in der Maus und der neonatalen Ratte Adapter mit Ohr-Bars und eine Nase Klammer.
Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Maus-Kopf ist zu diesem Zeitpunkt gesichert und bewegt sich nicht Side-by-Side. - Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
(2) stereotaktischen Chirurgie für Guide Kanüle Implantation
- Legen Sie die Maus und neonatalen Ratte-Adapter auf dem stereotaktischen Gerät. Machen Sie einen Schnitt sagittal auf der Haut über den Schädel mit einem Skalpell. Blut und das Bindegewebe auf den Schädel mit einem feuchten Wattestäbchen abwischen.
- Bestimmen Sie die Koordinate für die Region des Gehirns mit Gehirn-Atlas. Messungen, vergewissern Sie sich vor dieser Mittellinie ist gerade, so dass die Bohrkrone A / P verschoben und bleiben auf der Mittellinie Naht die ganze Zeit.
Hinweis: Dieser Artikel verwendet die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/V:-1,20 mm, 12 Grad) hinteren Hippocampus ausrichten. - Ebene Schädel A-P
- Legen Sie eine Bohrmaschine auf einen Manipulator stereotaktischen Rahmen. Senken Sie den Bohrer zu, bis er sanft Lambda berührt und notieren Sie ihre ventralen Koordinate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Bregma.
Hinweis: Wenn der Schädel abgeglichen wird, ist die vertikale Messung der Bregma gleich der Lambda. Wenn nicht, passen Sie die Höhe der Nase Klemme entsprechend an. Nachdem der Schädel nivelliert wird, zeichnen Sie die vorderen/hinteren, seitlichen Koordinate des Bregma.
- Legen Sie eine Bohrmaschine auf einen Manipulator stereotaktischen Rahmen. Senken Sie den Bohrer zu, bis er sanft Lambda berührt und notieren Sie ihre ventralen Koordinate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Bregma.
- Ebene Schädel links-rechts
- Verschieben Sie den Bohrer aus Bregma in die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), den Bohrer an den Schädel zu senken und die vertikale Koordinate aufzeichnen. Dann wiederholen Sie diesen Vorgang für die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
Hinweis: Wenn der Schädel abgeglichen wird, entsprechen diese vertikale Messungen von zwei äquidistanten Punkten von der Mittellinie. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Höhe der Ohr-Bars.
- Verschieben Sie den Bohrer aus Bregma in die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), den Bohrer an den Schädel zu senken und die vertikale Koordinate aufzeichnen. Dann wiederholen Sie diesen Vorgang für die Koordinate (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm).
- Bohren Sie vorsichtig an den Ziel-Koordinaten Grat (A / P:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm), eine Führer-Kanüle zu implantieren. Wenn der Durchmesser eines Bohrlochs nicht groß genug für eine Anleitung Kanüle Implantation ist, Bohren Sie ein weiteres Loch, das mit dem ersten überlappt. Bohren Sie ein weiteres Loch am rechten (kontralateralen Seite) Parietal Knochen und einsetzen Sie eine Knochenschraube, die hilft, um dental Zement in 1.10 (siehe Abbildung 1 b) zu sichern.
- Geschnitten Sie ein rundes Verriegelungs Stück von der Rückseite des Deckels eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen durch eine Rasierklinge und machen Sie eine '' Krone ''. Diese Krone wird verwendet, um dental Zement Ausbreitung auf der Haut zu verhindern. Legen Sie es auf den Schädel, so dass der Grat Löcher in Schritt 2.5 innerhalb des Kreises (siehe Abbildung 1 bleiben).
- Einrichten einer stereotaktischen Versammlung indem ein Leitfaden Kanüle auf den kürzeren Arm einer stereotaktischen Adapter und befestigen Sie es mit einer Hutmutter. Den längeren Arm des stereotaktischen Adapters auf die Elektrode Klammer gesetzt. Legen Sie es auf dem Manipulator des stereotaktischen Apparats (siehe Abbildung 1A).
- D-V Stereotax Montage auf den Greifarm durch 12 Grad (siehe Abbildung 1 b) drehen. Wechseln Sie die Führer-Kanüle an des Bohrlochs in 1.6 gemacht Setzen Sie die Guide-Kanüle langsam ins Gehirn von 1,2 mm Tieferlegung.
Hinweis: Der Winkel der Sonde ist spezifisch für den Hippocampus; andere Regionen können überhaupt keine Winkel oder andere Winkel erforderlich. Einen Gehirn-Atlas für genaue Koordinaten zu konsultieren. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels, denn wenn nicht der Zement nicht haften und Zement GAP verdrängt werden kann - Fügen Sie den dental Zement innerhalb der Krone voll decken das Metallteil der Führer-Kanüle und Knochenschraube genug um sie zu sichern. Gelten Sie zusätzliche dental Zement ist ein Teil des Schädels ausgesetzt.
- Warten Sie, bis dental Zement vollständig getrocknet ist (~ 12-20 min). Die Elektrode Klemme entfernen Sie den stereotaktischen Adapter. Entfernen Sie die Überwurfmutter und Ersetzen des stereotaktischen Adapters mit einer Dummy-Sonde und die Hutmutter befestigen.
- Lassen Sie die Maustaste aus dem stereotaktischen Gerät und Haus der Maus allein in einen einzelnen Käfig.
Hinweis: Die Maus sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Überprüfen Sie die Maus täglich bis zum Tag der Mikrodialyse. Die Maus erhält NSAIDs wie Carprofen, wenn es Schmerzen zu haben scheint. 2 Wochen zu warten ist für Schlaf-Wach-Studien notwendig, damit die Maus an die neue Umgebung10 gewöhnt, aber andere Arten von Studien kürzere Erholungszeiten (z. B. 1-2 Tage erfordern).
(3) Mikrodialyse Setup
- Qualitäts-Check der Sonden: Füllung eine Einweg-1ml-Spritze mit destilliertem Waterand schließen Sie es an die Steckdose (kürzere Port) einer Sonde mit einem Byton Rohr. Decken Sie die Lüftungsschlitze mit den Fingern, und drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig, um Wasser, um die Sonde einflößen. Prüfen Sie, ob Wasser von der Sonde Einlass erscheint und gibt es keine Leckage auf der Oberfläche einer Mikrodialyse-Membran.
- Aktivierung der Sonden: die Membranen der Sonde in Ethanol (70-100 %) für zwei Sekunden Tauchen. Dann die Infusion destillierten Wassers in die Sonde wieder mit einer Spritze wieder.
- Vorbereitung der Perfusion Puffer: um Haftung der Zielmoleküle für die Schläuche zu vermeiden, fügen Sie BSA durch Verdünnung 30 % BSA Lösung auf 4 % mit künstlichen CSF (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM Nahco33 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), entspricht die Elektrolytkonzentration im CSF, unmittelbar vor dem Gebrauch. Filtern des Perfusion Puffers durch eine Spritze Filtereinheit mit 0,1 µm Porengröße.
Hinweis: 4 % BSA verbessert die Erholung zum Aufkleben Proteine aber kann schränken Lieferung von Verbindungen, vor allem für Verbindungen, die hohe BSA-Bindung aufweisen. Dies ist ein Vorteil der Verwendung niedriger Konzentration von BSA (z. B. 0,15 %) in bestimmten Instanzen-3. Beachten Sie, dass die BSA kann sehr leicht zusammenfassen, wenn Wirbel oder rühren Platte bewegt. Diese Aggregate können Sonden oder Membranporen verstopfen. Seien Sie vorsichtig bei der Vorbereitung einer BSA-Lösung um diese Aggregation zu begrenzen - Bereiten Sie zwei getrennte Leitungen für Einlass und Auslass (siehe Abbildung 1) und verbinden Sie beide Linien mit einer Verbindung Nadel. Füllen Sie eine Einweg-3 mL Spritze mit Perfusion Puffer gefüllt und verbinden Sie es mit dem Einlass-Ende des Schlauches mit einer stumpfen Ende Nadel. Füllen Sie das gesamte Rohr mit Perfusion Puffer durch die Spritzenpumpe läuft.
- Stoppen Sie die Spritzenpumpe und ersetzen Sie die Anschluss-Nadel zwischen Einlass und Auslass-Linie mit einem aktivierten Mikrodialyse-Sonde aus Schritt 3.3 (siehe Abbildung 1). Diese Ersetzung vorgelegt die Überwurfmutter an der Sonde.
- Die Tuchwelle in den Auslass-Schlauch auf der Walze-Pumpe zu montieren. Starten Sie die Spritzenpumpe mit 10 µL/min und dann die Walze Pumpe etwas langsamer Durchfluss (9.5-9,8 µL/min). Achten Sie darauf, alle Luftblasen in den gesamten Schlauch entfernen, die die Erholung beeinflussen können, wenn sie die Sonde in Kraft.
- Die Maus von Schritt 1.12 auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.2 zu betäuben. Legen Sie das Maus-Halsband um den Hals. Entfernen Sie die Überwurfmutter und Dummy-Sonde und langsam eine Mikrodialyse-Sonde von 3.4 durch die Führer-Kanüle und befestigen Sie die Hutmutter.
- Statt der Maus in den Käfig zu einem frei beweglichen System und die Maus mit dem Halsband Leine verbunden. Spritzenpumpe und Walze Pumpe mit der angegebenen Volumenstrom in 3.5 für mindestens 1 h Schritt läuft weiter.
Hinweis: Um ISF Sammlung von Tieren, wach zu erreichen, verwendet dieser Artikel eine frei bewegliches System, wo ein Tier Bewegung Schläuche verdrehen halten der Käfig selbst entspricht. Alternativ können auch flüssige Wirbel von verschiedenen Firmen verwendet werden. - Stop die Walze Pumpen zuerst und dann die Spritzenpumpe. Legen Sie die gewünschte Durchflussgeschwindigkeit. Führen Sie die Spritze Pumpe 20 % schneller als die Roller-Pumpe.
Hinweis: zum Beispiel, wenn Sie mit 1 µL/min laufen, betreiben die Spritzenpumpe bei 1,2 µL/min. optimale Durchflussmenge sollte für jedes Molekül empirisch ermittelt werden. - ISF Proben: Legen Sie das freie Ende des Auslass-Schlauch auf den gekühlten Fraktionssammler.
Hinweis: Geeignete Probenvolumen variiert je nach Assays für die Analyse verwendet. - Nach Abschluss des Experiments Entfernen der Sonde. (Zu betäuben die Maus je nach Bedarf.) Behandeln Sie Maus Erholung genauso wie in Schritt 2.11. Analysieren Sie die gesammelten ISF durch Methoden wie HPLC oder ELISA.
- Um das gesamte Rohr nach Mikrodialyse waschen, verbinden Sie Einlass und Auslass Schläuche wieder, indem Sie die Sonde mit der Verbindung Nadel und verdünnte Bleichmittel in das gesamte Rohr laufen und dann mit Wasser spülen. Trocknen Sie und bewahren Sie es für eine wiederholte Verwendung.
Hinweis: Andere Schläuche sind akzeptabel, jedoch BSA in Perfusion Puffer kann die Schläuche mit kleinem Durchmesser verstopfen, so gelten diese Schläuche als Einweg. Die Schläuche können abgenutzt oder verstopft nach mehreren Verwendungen, so stellen Sie sicher, dass der Durchfluss konsequent vor jeder Inbetriebnahme ist.
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Representative Results
Um zu stimulieren oder hemmen neuronalen Aktivität in umgekehrter Mikrodialyse11,12,13, Picrotoxin, GABA-A -Rezeptor-Antagonisten oder Tetrodotoxin, Na+ -Kanal-Blocker verwendet wurden. Es hat sich gezeigt, dass Tau Freigabe durch Erhöhung der neuronalen Aktivität13,14angeregt wird. Einklang mit diesen frühere Beobachtungen, wenn 50 µM Picrotoxin (PTX), per reverse Mikrodialyse verabreicht wurde (siehe Diskussion für mehr Details) wach C57B6/J Mäusen erhöht ISF endogenen Tau, die Ebenen gemessen mittels ELISA im Vergleich zum Fahrzeug Kontrolle (DMSO)) ( Abbildung 2).
Abbildung 1: Operation Setup und den Bau der Mikrodialyse Schaltungen. (A) einer stereotaktischen Versammlung für eine Führer-Implantation mit einer Hutmutter, einer stereotaktischen Adapter und ein Leitfaden Kanüle eingerichtet. (B) stereotaktischen Operation, eine Führer-Kanüle zu implantieren. Die Führer-Kanüle wird im Gehirn bei 12 Grad in Bezug auf vertikale eingefügt. (C) Bau ein Zulauf-Schlauch und einem Auslass-Schlauch. Saugleitung besteht aus 70 cm FEP Schläuche (JF-70) und die Ablaufleitung besteht aus JF-70 und der Tuchwelle und 1/2 der FEP-Schläuche. Die Verbindung-Nadeln werden für jede Verbindung verwendet. (D) sobald das gesamte Rohr mit Perfusion Puffer gefüllt ist, stoppen Sie die Pumpe und ersetzen Sie die Nadel Verbindung zwischen Einlass und Auslass-Linie mit einem aktivierten Mikrodialyse-Sonde zu. Achten Sie darauf, verbinden das Ende der Zulauf Schlauch an der Ansaugöffnung einer Sonde (längere Port) und schließen das Ventil Schlauch mit Auslassöffnung einer Sonde (kürzere Port). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Daten zeigen ISF Tau Änderungen auf Picrotoxin umkehren Mikrodialyse. Picrotoxin (PTX, 50 µM) oder DMSO in der Hippocampus von C57B6/J Mäusen über reverse Mikrodialyse geliefert wurden. Picrotoxin schnell höhere ISF endogenen Tau aus der basalen Ebenen (d. h. die durchschnittliche Tau-Konzentrationen während 3 h vor der PTX Verabreichung) im Vergleich zu DMSO Behandlung. Daten werden als Mean±SEM, n = 3 für DMSO, n = 4 für PTX. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Mikrodialyse mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten hat von einem Push-Pull-Modus betrieben werden, so ist es wichtig, dass die Durchflussmenge genau und konstant sind. Die Ungenauigkeit in der Durchflussmengen kann die Ursache der Luftblase Generation und Inkonsistenz in der probenkonzentration sein. Wenn der Fluss inkonsistent ist, prüfen Sie alle Anschlüsse auf Dichtheit. Wenn das Problem weiterhin besteht, kann es mit neuen Sonden und Schläuche Neustart erforderlich.
Microdilaysis Sonden werden kontinuierlich durch die Perfusion Puffer durchblutet. Daher gibt es nicht genügend Zeit für extrazelluläre Moleküle, eine vollständige Gleichgewicht in der Perfusion Puffer zu erreichen. Infolgedessen ist die Konzentration in das Dialysat viel niedriger als die tatsächliche Konzentration im ISF. Um die wahre Konzentration von Molekülen in ISF abschätzen zu können, ist eine NULL-Flow-Methode häufig gebrauchte3,5,15. Diese Methode misst die Konzentration durch die Veränderung der Durchflussmenge. Gibt es eine inverse Beziehung zwischen der Konzentration und der Durchflussmenge. Daher kann die Konzentration der Zielmoleküle durch Extrapolation der exponentiellen Kurve zurück zu den theoretischen NULL Flow, der steht für die perfekte Erholung der Moleküle bestimmt werden. Aber die Erholung kann durch verschiedene Faktoren wie Interaktion mit Membranen oder Hydrophobie von Molekülen oder Interaktion mit anderen Proteinen beeinflusst werden und man sollte denken Sie daran, die Konzentration auf die theoretische NULL der nicht unbedingt entspricht der tatsächlichen Konzentration in ISF.
Eine Sonde Einfügung bewirkt, dass akute lokale Verletzung im Gehirn. Aus diesem Grund sind die ersten mehrere Brüche in der Regel von der weiteren Analyse ausgeschlossen. In der Tat sind die Ebenen der ISF-Tau-Protein im Hippocampus nicht stabil in der ersten 9-15 Stunde wahrscheinlich, weil die akute Verletzung unspezifische Veröffentlichung von Tau in ISF (unveröffentlichte Beobachtungen des Autors verursacht). Wiederherstellung nach einer Verletzung Sonde Einfügung variiert von Ziel zu Ziel. Pilotstudien sollte durchgeführt werden, um festzustellen, wann jedes Ziel erreicht eine Steady State zu bestimmen, wenn Proben analysiert werden sollte. Dies bestimmt den "Startpunkt" für die Mikrodialyse Probenahme. Ein Endpunkt für die Probenahme ist, wenn das Ziel nicht mehr im Steady-State (in der Regel 3-5 Tage nach Mikrodialyse Implantation Sonde; nicht Führer Implantation). Start- und Endzeiten für jedes Ziel sollte jedes Labor für jedes Ziel empirisch bestimmt werden.
Mikrodialyse eignet sich besonders in Kombination mit medikamentösen Behandlung. Drogen können systemisch verabreicht oder direkt in ISF infundiert. Umgekehrte Mikrodialyse ist eine Methode, die kleine Verbindungen über Sonden direkt durchdringt. Dialyse erfolgt bidirektional. Aufnahme von Medikamenten in der Perfusion Puffer ermöglicht daher seine Verbreitung, obwohl Mikrodialyse des umgebenden Gewebes Sonden. Diese Methode ermöglicht die lokale Verwaltung der kleine zusammengesetzte und gleichzeitige Sammlung von ISF. Umgekehrte Mikrodialyse ist weniger invasiv im Vergleich zu einer Druck-Injektion durch Kanüle und konstanteren Konzentration der Drogen im Zielgebiet zu erhalten.
Vor dem Start reverse Mikrodialyse, sollte das Innenvolumen der gesamte Schlauch berücksichtigt werden, um den Zeitpunkt der Behandlung und Entnahme von Proben zu berechnen. Beispielsweise ist das Innenvolumen des gesamten Schläuche, die in diesem Artikel verwendeten 91,5 µL (siehe die Tabelle der Materialien für Innenvolumen von jeder Schlauch). Daher, wenn der Volumenstrom 1,0 µL/min ist, dauert es 91,5 min für die Perfusion Puffer mit Drogen um die Fraktionssammler zu erreichen. Auf der anderen Seite, wenn Medikamente systemisch geliefert werden, sollte das innere Volumen des Outlet-Schläuche (56,5 µL in diesem Fall) gelten.
In Vivo Mikrodialyse-Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Techniken. Während Gehirn Homogenates wahrscheinlich von extrazellulären und intrazellulären Proteinen bestehen, sammelt beispielsweise Mikrodialyse speziell extrazellulären Proteine von ISF. Zweitens kann eine einzelne Mikrodialyse-Sonde ISF zu unterschiedlichen Zeitpunkten vom gleichen Tier sammeln. Zielkonzentration in jeder Probe kann zu einer Baseline % normalisiert werden. Dies normalisiert absoluten Konzentration zwischen Tieren, so dass relative Unterschiede verglichen werden können. Dies erhöht die Kraft einer Studie und in der Regel Tier reduziert für ein Experiment benötigt, beim Vergleich der relativen Unterschiede in Protein-Ebene nach Drug Administration/Manipulation. Auf der anderen Seite ist die größte Beschränkung der Mikrodialyse die Beschränkung der Größe des Zielmoleküls.
Mikrodialyse können mit anderen in-Vivo -Techniken kombiniert werden. Zum Beispiel kann regulierbarer Transgene Mäuse Mikrodialyse bei in-Vivo -Umsatz von Ziel Protein16schätzen. Die Kombination mit, EEG Messung diente zur Messung der elektrischen Aktivität während reverse Mikrodialyse11. Und Manipulation der optogenetik aktiviert neuronaler Aktivität im Gehirn während gleichzeitig ISF17zu sammeln.
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Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von '' Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Gehirn Protein Altern und Demenz Control)(15H01552) aus MEXT und Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (16K 20969). Der Autor dankt Dr. David M. Holtzman und Dr. John R. Cirrito für die technische Beratung bei der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K.
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
