Artículo de método

In Situ Medición y correlación de la densidad celular y emisión de luz de bacterias bioluminiscentes

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DOI:

10.3791/57881

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28 de junio de 2018

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1Institute of Biochemistry, Graz University of Technology

En este artículo

Resumen

Bacterias bioluminiscentes regulan la producción de luz a través de una variedad de mecanismos, como la detección de quórum. Este novedoso método permite la investigación en situ de bioluminiscencia y la correlación de emisión de luz a la densidad celular. Un artificial bioluminiscente Escherichia coli el sistema permite la caracterización de los operones de lux , Lux proteínas y su interacción.

Resumen

Hay un número considerable de especies bacterianas capaces de emitir luz. Todos ellos comparten el mismo racimo del gene, es decir, el operón lux . A pesar de esta similitud, estas bacterias presentan variaciones extremas en características como el comportamiento del crecimiento, intensidad de emisión de luz o regulación de la bioluminiscencia. El método presentado aquí es un ensayo desarrollado recientemente que combina grabación de crecimiento celular y la intensidad de emisión de luz bioluminiscente en el tiempo utilizando un lector de placas. El crecimiento resultante y las características de la emisión de luz pueden vincularse con importantes características de la cepa bacteriana respectiva, tales como quórum sensing Reglamento. El cultivo de una amplia gama de bacterias bioluminiscentes requiere un medio específico (por ejemplo, medio de agua de mar artificial) y define las temperaturas. Fácil de manejar, no bioluminiscente estándar-investigación bacteria Escherichia coli (e. coli), por el contrario, se puede cultivar económicamente en grandes cantidades en escala de laboratorio. Explotación de e. coli mediante la introducción de un plásmido que contiene el todo lux operon puede simplificar las condiciones experimentales y además abre muchas posibilidades para futuras aplicaciones. La expresión de los genes lux utilizando una cepa de e. coli expresión fue alcanzada por la construcción de un plásmido de expresión a través de clonación de Gibson y la inserción de cuatro fragmentos que contienen siete genes lux y tres genes de la costilla de el operón lux-costilla en un vector de pET28a. Expresión génica de e. coli en lux puede ser inducida y controlada vía la adición de Isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) dando por resultado bioluminiscente de e. coli las células. Las ventajas de este sistema son evitar el quórum sensing Reglamento restricciones y composiciones complejas medio junto con las condiciones de crecimiento no estándar, tales como define las temperaturas. Este sistema permite el análisis de los genes lux y su interacción, mediante la exclusión del gen respectivo desde el operón lux , o incluso adición de nuevos genes, intercambiando el luxAB los genes de una cepa bacteriana por otro, o Análisis complejos de la proteína, tales como luxCDE.

Introducción

La emisión de luz por organismos vivos (bioluminiscencia) es un proceso fascinante encontrado en bacterias, hongos, insectos, nematodos, peces y calamares1. Emisión de luz bioluminiscente surge de una reacción quimioluminiscente en el que la energía química (parcialmente) se transforma en energía de la luz ("luz fría"). En bacterias bioluminiscentes, la luciferasa de heterodiméricos enzima cataliza el monooxygenation de cadena larga, Aldehídos alifáticos, como el tetradecanal, a los ácidos correspondientes acompañados de emisión de luz con un máximo de 490 nm2, 3.

Diagrama de reacción bioquímica; síntesis de luz a través de luciferasa LuxAB; n = 4,6,8,10; FMNH2+O2.
Figura 1 : Esquema general de la reacción de luciferase bacteriana. La luciferasa bacteriana (LuxAB) cataliza la monooxygenation de cadena larga aldehídos (CH3(CH2)nCHO) utilizando reducción fosfato de lactoflavina (FMNH2) y oxígeno molecular (O2), rindiendo los productos cadena larga ácidos (CH3(CH2)nCOOH), fosfato de lactoflavina (FMN), agua (H2O) y la emisión de luz centrada a 490 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La energía liberada durante esta oxidación produce un estado excitado FMN-4a-hidróxido, que sirve como el luciferin4de emisión de luz. Las proteínas implicadas en bioluminescence bacteriano, es decir, LuxCDABEG, son codificadas por el operón lux y se conservan altamente en varias cepas bacterianas2,5. Los genes luxA y luxB codifican para la luciferasa heterodiméricos; productos del gen de luxC, de luxDy de luxE son componentes de una reductasa de ácidos grasos complejo; y luxG codifica para una reductasa de flavin6. Un número de bioluminiscente Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) portan el gen adicional luxF . Se informó de que LuxF es una proteína homodiméricas que se une el flavin inusual derivado 6-(3'-(R)-MIRISTILO)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Se han identificado genes adicionales que son responsables de la síntesis de riboflavina (por ejemplo, ribEBH) y además genes reguladores se han divulgado, que juegan un papel en la regulación de detección de quórum de bioluminiscencia, especialmente para Vibrio Fischeri y Vibrio Ricque6,13. A pesar de la orden de genes altamente conservados, bacterias bioluminiscentes demuestran altas variaciones en características como el comportamiento del crecimiento, intensidad de emisión de luz, o reglamento de bioluminiscencia2,5,14 .

Varios modificación cepas o plásmidos que contienen partes o todo lux operones son conocidos, explotando la bioluminiscencia como sistemas de reportero. Diversas aplicaciones como la determinación de actividad de promotor, monitoreo de contaminación bacteriana en el ambiente o muestras de la comida, bioluminiscencia resonancia energética de transferencia (BRET), en vivo la proyección de imagen de las infecciones en los organismos eucariotas, Pirosecuenciación y así sucesivamente fueron establecidos15,16,17. Curiosamente, los tres más usados reportero bioluminiscente sistemas derivan de la luciérnaga de América del norte (Photinus pyralis), el patógeno entérico de nematodos (luminescens de Photorhabdus) y el pensamiento del mar (Renilla lugares). Ninguno de estos sistemas tiene un origen bacteriano, pero el uso de lux genes y operones de origen bacteriano está cobrando más interés para la investigación aplicada16. La aplicación menos abundante de las proteínas de la bioluminiscencia de fuentes bacterianas principalmente debido a la menor estabilidad y longevidad de las bacterias derivados proteínas luminiscentes que pueden estar relacionadas con su hábitat marino. Bacterias bioluminiscentes de hábitats marinos no son cultivables en condiciones estándar de laboratorio. Estas bacterias requieren medios de cultivo específicos y condiciones, como la artificial agua medio y bajo crecimiento/incubación las temperaturas del mar (por ejemplo, 28 ° C).

Para simplificar la comparación de características de operón lux o solo lux genes de una variedad de diferentes cepas de bacterias bioluminiscentes, un método para estandarizar el análisis y la expresión del operón de lux es un requisito previo. Así, surgió la idea de integrar el operón entero lux-costilla en el estándar de investigación bacteria Escherichia coli (e. coli). Para ello, Asamblea de Gibson demostró para ser una herramienta útil para integrar múltiples fragmentos lineales, superpuestas en vector de una expresión sin la necesidad de sitios de restricción específicos. Este método también es conveniente cuando son demasiado grandes insertos de DNA (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG ribEBH; ~ 9 kb operon tamaño) para ser amplificados por PCR. Un operón lux se puede dividir en múltiples fragmentos superpuestos, a continuación, se montar en el plásmido de una expresión y finalmente la secuencia verificado producto de montaje puede ser transformada directamente en un apropiado e. coli sistema de alto rendimiento expresión de la proteína18,19,20. Además de la fácil de manejar la expresión génica de e. coli en lux , un método sencillo que combina la grabación de crecimiento celular y la emisión de luz bioluminiscente seguía siendo para establecerse. El método aquí descrito permite la medición en situ y correlación de la densidad celular y emisión de luz de bacterias bioluminiscentes.

El análisis de los genes lux y lux operon orden y regulación de varias bacterias bioluminiscentes, por un lado, un artificial bioluminiscente de e. coli sistema que contiene el operón entero lux-costilla de P. mandapamensis 27561 y, por otro lado, un ensayo de placa nuevo lector combina la grabación en situ de densidad celular y una emisión de luz, ayuda a obtener más información sobre los distintos sistemas bacterianos lux . Esta caracterización fundamental y comparación de luciferasas y enzimas relacionadas pueden conducir a alternativas a los sistemas ya establecidos reportero con actividad y estabilidad mejorada.

Protocolo

1. diseño, elaboración y expresión de la lux Operon en Escherichia coli

Nota: Ver Tabla de materiales para obtener información sobre kits comerciales utilizados en esta sección.

  1. Para la transferencia de la lux operón en e. coli elegir un vector animal doméstico estándar con sitios de restricción apropiado y el gen de resistencia a los antibióticos de interés (por ejemplo, pET28a; Brochothrix, XhoI, kanamicina).
  2. Diseño de los fragmentos y superposición de cartillas para el montaje de Gibson basado en la secuencia de ADN de Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
  3. Establecer una reacción estándar de PCR con los cebadores diseñados y el ADN genómico aislado de Photobacterium mandapamensis 27561 como plantilla (ver Material suplementario para bases y condiciones).
    Nota: Aislamiento de ADN genómico de la cepa bacteriana respectiva mejora la eficacia de la polimerización en cadena.
  4. Purificar el producto PCR mediante purificación spin-columna.
  5. Realizar una digestión de la restricción del vector pET28a aislada con Brochothrix y XhoI a 37 ° C por 45 min.
  6. Purificar el vector linearizado y los fragmentos PCR a través de agarosa gel electroforesis y purificación posterior spin-columna.
  7. Determinar la concentración de ADN de cada fragmento y del vector linearizado y calcular las cantidades óptimas para el montaje según el protocolo20,21.
    Nota: Eficacia de la Asamblea depende de tamaño del fragmento y el número y tiene que ser ajustado de acuerdo protocolo20,21 del fabricante.
  8. Después de combinar todos los fragmentos y el tampón en un tubo PCR, incubar la mezcla de montaje en una máquina PCR a 50 ° C durante 1 hora.
  9. Transformar el producto vector ensamblado según protocolos estándar de transformación de transformación bacteriana plásmido de e. coli en un apropiado e. coli sistema de replicación de plásmidos de alto rendimiento (p. ej., Escherichia coli TOP10 o XL-1).
  10. Seleccionar las colonias de la placa de transformación y rayado de placas nuevas para el aislamiento de ADN.
  11. Aislar DNA de plásmido según protocolos estándar.
  12. Para verificar el correcto ensamblaje del plásmido incluyendo todos los fragmentos, en primer lugar realizar una colonia PCR según protocolos estándar utilizando primers específicos para cada fragmento montado.
  13. Además la Colonia PCR y electroforesis del gel de agarosa posterior, preparar todos los vectores de montaje aisladas para secuenciación de ADN verificar el correcto ensamblaje y las secuencias de ADN correcto.
  14. Transformar el plásmido verificado según protocolos estándar de transformación de transformación bacteriana plásmido de e. coli en un apropiado e. coli sistema para producción de proteínas de alto rendimiento (e.g.,E. coli BL21).
    Nota: Seguir directamente con el protocolo de la expresión a continuación. Para almacenamiento más prolongado, se recomienda la preparación de un stock de glicerol.

2. expresión de las cepas modificado e. coli

  1. Preparar un cultivo de noche (ONC) para la expresión por la inoculación de un volumen adecuado de medio LB (p. ej., 100 mL) con el caldo previamente preparado glicerol de las células de e. coli BL21 transformadas con el plásmido montado o directamente desde un placa de transformación. Añada 100 μl de kanamicina (50 mg/mL; gen de resistencia a los antibióticos de la pET28a) e incubar la ONC a 37 ° C y 120 rpm en un agitador incubador durante la noche.
  2. Inocular el cultivo principal expresión (por ejemplo, 800 mL de medio LB) con 8 mL de la ONC y añadir 800 μl de kanamicina (50 mg/mL).
  3. Incubar el cultivo principal a 37 ° C y 120 rpm en un agitador incubador hasta que la densidad celular alcanza un OD600 de 0.6 - 0.8 (aproximadamente 2,5 h).
  4. Reducir la temperatura de incubación a 28 ° C.
  5. Inducen la expresión de proteínas añadiendo IPTG a una concentración final de 0,1 mM.
    Nota: Pruebas empíricas demostraron que la reducción de la temperatura a 28 ° C dio la más alta intensidad de luz.
  6. Observar las células hasta que comiencen a brillar (aproximadamente 1 hora).
    Nota: Dependiendo de la finalidad de la expresión, las células se cultivan hasta el día siguiente y luego se cosechan, o las células pueden mantenerse agitación mientras están brillando (máximo 48 h). Recolección de las células y la purificación de cualquier proteínas puede realizarse según procedimientos estándar.

3. expresión de cepas de bacterias bioluminiscentes

Nota: Cepas de bacterias bioluminiscentes requieren medio del agua de mar medio artificial de crecimiento específico para crecimiento y producción de luz.

  1. Preparar el medio de agua de mar artificial, compuesto de dos componentes medio preparados por separado.
    Nota: La preparación del medio de agua de mar artificial fue adaptada del protocolo original22. Las siguientes cantidades son para medio líquido 1 L o 1 L agar medio.
    1. Por medio del agua de mar artificial, pesan en las sales siguientes: 28,13 g NaCl, 0,77 g de KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3y 3.50 g MgSO4 · 7H2O.
    2. Añadir 1 L de agua destilada y disolver todos los componentes.
    3. De medio LB, peso de los siguientes ingredientes: Extracto de levadura 10 g, peptona 10 g y para las placas de agar, un agar 20 g adicionales.
    4. Añadir 250 mL de agua y disolver componentes.
    5. Autoclave ambos preparados los medios de comunicación por separado a 121 ° C por 20 min.
    6. Para las placas de agar, combinar 250 mL de medio LB con 750 mL de medio de agua de mar artificial directamente después de la esterilización en autoclave y preparar las placas.
    7. Medio líquido, combinan 250 mL de medio LB con 750 mL de medio de agua de mar artificial directamente después de la esterilización en autoclave, o cuando se enfría.
      Nota: El medio de agua de mar artificial puede obtener turbio por precipitación de sales.
  2. Las cepas de bacterias bioluminiscentes en placas de agar medio de agua de mar artificial de la raya e incubar durante la noche entre 24 y 30 ° C.
    Nota: Almacenamiento de largo plazo de cepas bacterianas normalmente se logra a través de acciones de glicerol de la cultura bacteriana de congelación. Las cepas se deben siempre rayadas en placas de agar para asegurar las condiciones partidas uniforme para todas las cepas, antes de uso para cultivos líquidos, debido a una fase de retraso en el crecimiento después de descongelar.
  3. Preparar un ONC al inocular el medio de agua de mar artificial de 100 mL con una sola Colonia de la placa. Incubar durante una noche la ONC a 24-30 ° C y 120 rpm en un agitador incubador.
  4. Inocular 800 mL de medio de agua de mar artificial con 8 mL de ONC.
  5. Incube las células bacterianas a 24-30 ° C y 120 rpm en un agitador incubador.
    Nota: El perfil de intensidad de luz de bacterias bioluminiscentes varía fuertemente con la temperatura. Dependiendo de los mecanismos de regulación de la producción ligera de la cepa bacteriana respectiva, emisión de luz puede comenzar después de aproximadamente 1-6 h.
  6. Observar la cultura de célula bacteriana hasta que comiencen a brillar (aproximadamente 1-6 h).
    Nota: Dependiendo de la finalidad de la expresión, las células se cultivan hasta el día siguiente y luego se cosechan, o las células pueden mantenerse agitación mientras están brillando. Recolección de las células y la purificación de cualquier proteínas puede realizarse según procedimientos estándar.

4. en Vivo ensayo actividad de cepas de bacterias bioluminiscentes y modificado e. coli cepas

Nota: Almacenamiento de largo plazo de cepas suele ser acieved por congelar las acciones del glicerol de la cultura bacteriana. Las cepas se deben siempre rayadas en placas de agar para asegurar las condiciones partidas uniforme para todas las cepas, antes de uso para cultivos líquidos, debido a una fase de retraso en el crecimiento después de descongelar.

  1. Estría la cepa bacteriana bioluminiscente deseada o modificado e. coli cepa en una placa de agar e incubar a 28 ° C durante la noche.
    Nota: La temperatura de incubación puede variar de una cepa a cepa y tiene que ser evaluadas empíricamente. Para poder comparar cepas de bacterias bioluminiscentes y modificado cepas de e. coli , las condiciones de crecimiento tienen que ser idénticos.
  2. Inocular 3 mL de medio con la cepa respectiva con una sola Colonia de una placa de agar e incubar las células en 28 ° C y 180 rpm en un agitador incubador para aproximadamente 1-2 h.
  3. Medir la densidad celular de un 1:10 dilución del cultivo líquido a 650 nm. Calcule la proporción y volumen para la cultura de 1 mL con una650 de OD de 0,05.
    Nota: El análisis de lector de la placa posterior va a determinar la densidad celular a 650 nm para evitar interferencias por la emisión de luz de las cepas.
  4. Tomar con pipeta el volumen calculado de la cultura y medio en una placa de pared negro de 24 pocillos con fondo de cristal. Para la modificado e. coli cepa, añadir 1 μl de kanamicina (resistencia a los antibióticos del pET28a vector) y 1 μl de IPTG (inducción de la expresión génica) a las muestras. Coloque una tapa sobre la placa para evitar la evaporación durante las mediciones.
    Nota: Para asegurarse de que el vector de pET28a que contiene el operón entero lux no se pierda la cultura de e. coli , kanamicina debe agregarse a cada muestra de e. coli en los pocillos de la placa y para asegurar que la producción ligera de la e. coli las células se pueden medir, la expresión del gene debe ser inducida por IPTG. Para evitar interferencia la interferencia y medición de pared negro bien placas con fondo de cristal y tapa transparente mostraron mejores resultados. Sin embargo, puede observarse la diafonía y bien puestos tienen que ser elegido cuidadosamente.
  5. Iniciar la medición en un lector de placas.
    Nota: El protocolo de lector de la placa se basa en una secuencia de comandos especialmente desarrollado para este ensayo (véase el Material suplementario) que combina dos mediciones de absorbancia y bioluminiscencia. Puntos de datos son recogidos cada 10 minutos con agitación permanente entre las mediciones y una temperatura constante de 28 ° C.

Resultados

La orden del gene del operon lux - luxCDABFEG - se conserva altamente en varias cepas2,5,14. Para el diseño del plásmido, fue tomada la información de la secuencia de la cepa bacteriana bioluminiscente Photobacterium mandapamensis 27561 y su orden de gen se mantuvo la misma, y, además, codifica secuencias entre genes individuales eran consideradas. Una descripción esquemática de la estrategia de clonación aplicada de Gibson se muestra en la figura 2. Se generaron cuatro fragmentos en total, luxCDAB, luxF, luxEG y ribEBH, con 20-40 pares superposición de secuencias. Después de seguir todos los pasos de la Asamblea de Gibson20, secuencia de la DNA confirmó el correcto ensamblaje del plásmido, incluyendo todos los fragmentos. El mapa del vector de la pET28a de productos de montaje final que contiene el operón lux-costilla es representado en la figura 3. Una ventaja importante de este vector de pET28a modificado es la utilización de estandarizado de las condiciones de crecimiento de e. coli y controlado por inducción con IPTG.

Para medir la emisión de luz de bacterias bioluminiscentes y la densidad celular respectivo, se desarrolló un método de lector basado en placa. El método para el lector de placas se generó combinar scripts sola medición de densidad intensidad y de la célula. Esta escritura de la novela permitió la medición de OD650 e intensidad de luz cada 10 minutos para un usuario definido marco de tiempo, que ha de ajustarse a la época de la generación de las bacterias que se utilizan para el análisis respectivo (por ejemplo, 10 h). Se realizó la medición de la densidad óptica a 650 nm para evitar interferencias con la emisión de luz. Como prueba de concepto y para asegurar la salud y el comportamiento correcto crecimiento de las células de e. coli , se realizaron medidas de referencia. En la figura 4 la comparación de células de e. coli BL21, las células de e. coli BL21 que contienen un vector vacío pET28a y e. coli BL21 células que contienen el vector de pET28a con el operón lux-costilla inserto se presentan. Para la cepa de este último, IPTG no fue agregado para analizar la emisión de luz debido a la filtración del promotor T7. Todas las mediciones de referencia tres muestran una curva de crecimiento sigmoidal con tres fases de crecimiento (fase exponencial y estacionaria de lag,). Sólo las e. coli BL21 las células que contienen el vector de pET28a con el comienzo de inserto de operón lux-costilla para emitir luz, pero en contraste con las mediciones donde la expresión es inducida por la adición de IPTG y luz se emite después de 30 minutos, las células no inducidas sólo empieza a brillar después de aproximadamente 5 h y muestran una mucho menor emisión de luz (aprox. 4 veces) en comparación con el sistema inducido.

Figura 5 ofrece una comparación de las curvas de crecimiento y de intensidades de luz del operón lux expresada en e. coli y la cepa bacteriana bioluminiscente mandapamensis p. 27561, en medio LB o en medio del agua de mar artificial, utilizando la novela estableció en situ método. Para comparar estas bacterias, las mediciones se realizaron a una temperatura de incubación de 28 º C. Esta temperatura disminuye la tasa de crecimiento de la modificado e. coli cepa en medio LB y medio de agua de mar artificial, pero para temperaturas más bajas de cepas de bacterias bioluminiscentes es cruciales. Esta dependencia de la temperatura es visible en la figura 5A, mandapamensis p. 27561 muestra una densidad celular mayor que e. coli. Además, mientras que para las cepas de e. coli , medio LB permite la generación de mayores densidades de células de cepas naturales de bacterias bioluminiscentes, medio de agua de mar artificial es preferida y esencial para la bioluminiscencia. Las densidades de célula grabada se correlacionan con las correspondientes intensidades de luz, como se muestra en la figura 5B. Notable, la bioluminiscente de e. coli las células similares de alcance máximos de emisión de luz en tanto medio de agua de mar artificial como medio LB, aunque las intensidades más altas se registraron en diferentes puntos temporales. En contraste con esta observación, mandapamensis p. 27561 es viable con tasas de crecimiento muy reducido en medio LB, pero las células bacterianas no emiten la luz en todos (figura 5B). En medio del agua de mar artificial, mandapamensis p. 27561 muestra un máximo de emisión de luz alrededor de 1 x 104 cuentas por segundo, que es casi un factor de 200 menor que e. coli. Figura 5 C representa unidades relativas de luz donde la bioluminiscencia está normalizado por el OD. Estos resultados confirman que no sólo fue la inserción de un plásmido que contiene el operón lux en e. coli exitoso y funcional, pero también que este modificado e. coli cepa es una alternativa válida con mayor emisión de luz rendimientos y sin la limitación de bioluminescence bacteriano de bacterias de la marina, como un complejo mar temperaturas medias y baja.

Además, una medida a largo plazo de la expresión de genes de e. coli en lux-costilla más de 24 h fue realizada para analizar la longevidad de la emisión de luz (figura 6). Emisión de luz duró 19,5 h, observó mucho más tiempo que las cepas bacterianas (p. ej., p. mandapamensis 27561) donde una disminución gradual que resulta muy baja emisión de luz después de 10 h.

Para ilustrar las limitaciones de lo análisis desarrollado, la figura 7 muestra los resultados de la medición de tres cepas de bacterias bioluminiscentes, es decir, Photobacterium mandapamensis S1 y Photobacterium mandapamensis TH1 Vibrio Ricque 14126. Para la primera variedad (S1), el método funciona muy bien y muestra una intensidad máxima de la bioluminiscencia de casi 2 x 106. Para las otras dos cepas (TH1 y 14126), no se puede determinar la máxima intensidad de luz porque la intensidad de la luz generada por tanto excedió el límite de detección de la configuración del instrumento utilizado. El valor de ganancia definido para el método desarrollado (guión) para estas dos cepas fue fijado demasiado alto. Sin embargo, el inicio de la actividad de bioluminiscencia puede compararse con los demás. P. mandapamensis TH1 y mandapamensis p. S1 empiezan brillando después de aproximadamente 1 h y un valor de650 de OD de 0.1 - 0.2, respectivamente. En cambio, V. Ricque 14126 comienza a emitir luz después de aproximadamente 5,5 h a un precio de650 de OD de 1.0. El observado inicio de la emisión de luz es acompañado por un aumento exponencial en OD como bioluminiscencia. Se conoce que subyace a la bioluminiscencia de V. Ricque 14126 quórum sensing regulación y por lo tanto, un específico celular densidad permitiendo la activación de la operón lux , que se puede observar claramente en la figura 713. Este resultado demuestra que con esta novela en situ análisis de lector de la placa es posible comparar fácilmente bacterias bioluminiscentes y también más o menos definir un mecanismo de regulación de estas cepas mediante la determinación de si un quórum sensing Reglamento pueden ser observado o no.

La figura 8 muestra un ejemplo de una cultura de expresión de e. coli BL21 células albergar el plásmido pET28a ensamblado que contiene el operón lux después de la inducción con IPTG. Después de aproximadamente una hora después de la inducción, las células de e. coli empezar brillando con un color azul verdoso. Figura 8 A muestra la expresión de e. coli cultura fotografiado en la luz y la figura 8B da la misma cultura en la oscuridad. Figura 8 C representa una placa de agar del medio de agua de mar artificial con mandapamensis p. S1 que brilla en la oscuridad en la misma característica de color azul verdoso de bioluminescence bacteriano.

Diagrama de flujo de trabajo de Gibson Assembly: diseño de cebadores, concentración de ADN, transformación de plásmidos, secuenciación.
Figura 2 : Representación esquemática de la Gibson aplicada estrategia de clonación. Paso (I): se diseñan primers traslapado (flechas color; ca. traslape de 20-40 pares). Cebadores superpuestos contienen secuencias recocidas, que consiste en la respectiva región 5' y 3' de un fragmento y la respectiva región 3' y 5' del segmento adyacente. Paso (II): Se generan los fragmentos diseñados para montaje mediante reacciones de polimerización en cadena estándar. Paso (III): El vector objetivo es linealizado por digestión de restricción (por ejemplo, Brochothrix, XhoI). Paso (IV): Las concentraciones de ADN de todos los fragmentos y el vector lineal deben ser determinado ajustar la concentración adecuada para el montaje de Gibson (según protocolo del fabricante). Paso (V): Todos los fragmentos y el vector linearizado con concentraciones de ADN optimizados se combinan con la mezcla principal de Asamblea Gibson (T5 exonucleasa, la polimerasa de DNA y ligase de la DNA) y se incubó a 50 ° C por 1 h. paso (VI): se transforma el producto de la Asamblea según protocolos estándar en un apropiado e. coli cepa para la replicación del plásmido de alto rendimiento (p. ej., Escherichia coli TOP10 o XL-1). Paso (VII): Para verificar el correcto ensamblaje del plásmido, secuenciación del ADN del plásmido montado deberá llevarse a cabo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

mapa de plásmidos de operón lux, vector pET28a, expresión génica, promotor lac, diagrama de ADN circular
Figura 3 : Mapa del vector de pET28a que contiene el operón lux-costilla . El operón lux-costilla de mandapamensis p. 27561 se inserta en el sitio de clonación múltiple de pET28a en el orden original del gene (luxCDABFEG-ribEBH). Sitios de restricción utilizados para la clonación son Brochothrix y XhoI. Fragmentos que se utilizan para el montaje de Gibson del operon son luxCDAB en naranja, luxF verde, luxEG en azul y ribEBH de lavanda; genes dentro de un fragmento se muestran como una caja separada. Noncoding secuencias entre cada uno gene del operon se incluyen en la estrategia de clonación aplicada. El tamaño final del plásmido de pET28a que contiene el operón entero lux-costilla es 14.625 de pares de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Curva de crecimiento BL21 y gráfico de bioluminiscencia; DO y bioluminiscencia a lo largo del tiempo; expresión genética.
Figura 4 : Comparación de curvas de crecimiento y de intensidades de luz de las cepas de referencia. La do a 650 nm y la intensidad de la bioluminiscencia en cuentas por segundo fueron medidos cada 10 minutos durante 10 h a 28 ° C. Todas las medidas son valores promedios de tres réplicas biológicas con cuatro repeticiones técnicas. Barras de error representan desviaciones estándar. E. coli BL21 células (cuadrados grises), las células de e. coli BL21 que contienen un vacío pET28a vector (círculos grises), y e. coli BL21 células que contienen el vector de pET28a con el inserto de operón lux-costilla (diamante negro) se analizaron a asegurar el comportamiento del crecimiento correcto de nuestras células de e. coli . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Gráficos de crecimiento bacteriano y bioluminiscencia; E. coli vs. P. mandapamensis en LB y medios de agua de mar.
Figura 5 : Comparación de las curvas de crecimiento y de intensidades de luz del operón lux expresan en e. coli (cuadrados) y p. mandapamensis 27561 (círculos) en medio LB (símbolos abiertos) o en medio del agua de mar artificial (símbolos rellenos). Todas las medidas son valores promedios de tres réplicas biológicas con cuatro repeticiones técnicas. Barras de error representan desviaciones estándar. Todos los experimentos se realizaron a una temperatura de incubación de 28 º C. (A) medidas de densidad (OD) de óptica a 650 nm se realizaron cada 10 minutos para 10 h. expresión de e. coli lux operon (panel izquierdo) es en comparación con p. mandapamensis 27561 (panel derecho) en medio de agua de mar artificial y medio LB. Densidades celulares se determinan a 650 nm para evitar interferencias de bioluminiscencia. (B) medición de la intensidad de la luz (bioluminiscencia [cuentas/s]) fue realizada cada 10 minutos para 10 h. expresión de e. coli lux operon (panel izquierdo) es en comparación con p. mandapamensis 27561 (panel derecho) en LB mar medio y artificial medio del agua. (C) luz relativa intensidades (RLU/OD) del operón lux expresada en e. coli (panel izquierdo) y p. mandapamensis 27561 (panel derecho) están determinados por la normalización de bioluminiscencia para la densidad celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dinámica de crecimiento, bioluminiscencia, gráfico RLU/OD; resultados experimentales a lo largo del tiempo en minutos.
Figura 6 : Comparación de las curvas de crecimiento y de intensidades de luz de e. coli basan de expresión del gen lux para 24 h. La do a 650 nm y la intensidad de la bioluminiscencia en cuentas por segundo fueron medidos cada 10 minutos durante 24 h a 28 ° C. Todas las medidas son valores promedios de tres réplicas biológicas con cuatro repeticiones técnicas. Barras de error representan desviaciones estándar. Además, se representan las intensidades de luz relativas (RLU/OD) donde bioluminiscencia es normalizado por la densidad celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla de crecimiento bacteriano y luminiscencia; densidad óptica, bioluminiscencia, RLU/OD vs. análisis de tiempo.
Figura 7 : Comparación de bacterias bioluminiscentes para evaluar potenciales quórum sensing Reglamento. Emisión de luz y densidad celular se miden cada 10 minutos durante 10 h y representan valores promedios de tres réplicas biológicas con cuatro repeticiones técnicas. Barras de error representan desviaciones estándar. Mediciones de Photobacterium mandapamensis TH1 (negro plazas), Vibrio Ricque 14126 (círculos grises) y Photobacterium mandapamensis S1 (diamantes grises) se compararon entre sí; (A) representa la densidad óptica (OD) a 650 nm, (B) la luz de intensidad (bioluminiscencia [cuentas/s]) y (C) intensidades relativas de luz (RLU/OD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados de brillo de fermentación; Cultivo bioluminiscente en matraz, estructura química de emisión verde.
Figura 8 : Bioluminiscencia en medios líquidos y en placas de agar. (A) matraz de 5 L con medio LB de 2 L inoculado con e. coli BL21 las células con el plásmido de operón lux pET28a fotografiado en luz. (B) la misma cultura como en (A) fotografiada en la oscuridad. Imágenes A y B se realizaron aproximadamente 2 h después de la inducción de la expresión. Placa de agar medio de agua (C) mar Artificial con cultura veteada de S1 p. mandapamensis en la oscuridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La construcción de un plásmido de expresión que contienen cuatro fragmentos de componer el operón entero lux-costilla de mandapamensis p. 27561 se logró a través de clonación de Gibson. Esta expresión de genes de e. coli en lux permite a e. coli las células emiten luz. Evitar el quórum sensing Reglamento y condiciones de crecimiento no estándar es ventajas substanciales de este sistema.

Las ventajas de utilizar la estrategia de clonación de Gibson son el fácil montaje de múltiples fragmentos de ADN lineales, alta flexibilidad y sin necesidad de restricción específicos sitios18,19,20. Este método permite cambiar fácilmente de un operón lux , excluyendo genes individuales o grupos de genes, introducción de nuevos genes o intercambio de genes de una cepa con el otro. Un requisito previo para la aplicación de este método es la disponibilidad de la secuencia del gen respectivo lux operon. Sólo para un pequeño número de bacterias bioluminiscentes es la secuencia completa del ADN del respectivo lux operon conocido y disponible. Muchas de estas secuencias están fragmentados porque se generaron utilizando secuenciación de escopeta. En el caso de los investigados mandapamensis p. 27561 la secuencia completa del ADN de la operón lux es conocido y están disponibles en la base de datos NCBI gene (GenBank: DQ988878.2).

Un paso crítico en el protocolo de la Asamblea de Gibson es el cálculo de la concentración de ADN de los fragmentos individuales. En el protocolo de montaje del fabricante se recomienda utilizar 0,2 - 0,5 pmols y un volumen total de 20 μl para 4-6 fragmentos20,21. En nuestro caso, donde luxCDABFEG-ribEBH se compone de 4 fragmentos, las concentraciones y volúmenes totales fueron 0.1 pmol y 45 μl, respectivamente, dependiendo de la producción de productos de la PCR. Por un lado, la concentración tuvo que ser reducido y por otro lado, el volumen tuvo que incrementarse. Sin embargo, la Asamblea funcionaba muy bien y secuencia de la DNA confirmó la correcta inserción en el primer intento. Este hallazgo confirmó Asamblea de Gibson como un método robusto y adecuado para nuestras investigaciones, que pueden ser fácilmente modificados18,19,20.

La flamante placa lector es un fácil método de manejar. Permite un análisis primario simple de nuevo o (ONU-) cepas de bacterias bioluminiscentes y da ya un primer indicio sobre el mecanismo regulador de la producción de luz (p. ej., retraso en la luminiscencia en las densidades bajas de la célula). Además, las condiciones de crecimiento en combinación con la producción de luz pueden evaluarse fácilmente cambiando simplemente un medio o la temperatura.

Se realizaron las mediciones con el lector de la placa a 28 º C. La razón de esta configuración inusual es la sensibilidad de temperatura de cepas de bacterias bioluminiscentes, donde las temperaturas sobre 30 ° C a menos o incluso ningún crecimiento o emisión de luz. Tenga en cuenta que el lector es capaz de mantener una temperatura definida en el tiempo con la limitación de no activa sistema de enfriamiento. Por lo tanto, la temperatura debe ser inferior a la temperatura de la medida.

Como una prueba de concepto, la comparación de la estructura de e. coli con la cepa bioluminiscente p. mandapamensis (figura 5) en la una mano y las medidas de referencia (figura 4) por otro lado se realizaron y confirmar la fiabilidad de este sistema recién creado. Además, la medición a largo plazo asegura la longevidad de la emisión de luz (figura 6). Pero uno tiene que considerar que los valores de OD no son fiables por encima de cierta densidad óptica, dependiendo de las características del dispositivo de medición utilizado (aproximadamente 15 h en el presente caso) donde se necesitaría una dilución apropiada para una medición en el rango lineal del detector. Estas altas variaciones en los valores de OD hacen estas mediciones de tiempo no es fiable. Por lo tanto, medidas más cortas como 10 h se recomiendan la configuración experimental divulgado aquí.

Limitaciones del ensayo de lector de placa establecido pueden verse en la figura 7. La dificultad es encontrar un ajuste apropiado de la medida. La valor de ganancia ajusta la sensibilidad del tubo Foto multiplicador (PMT). La ganancia es la amplificación de la señal en el PMT, lo que significa que un mayor factor de ganancia aumentará la señal. Si la ganancia se establece demasiado baja, la relación señal a ruido se hace más grande e intensidades de luz de bacterias bioluminiscentes brillantes "bajas" no se puede medir cualquier (señales más cercano a cero, datos no mostrados). El reto en un ensayo bioluminiscente es para ajustar la ganancia para los resultados de medición para todas las cepas bacterianas dentro de la gama del instrumento. Además, la gama de medición de luminiscencia depende el tiempo de intervalo de medición (por ejemplo, máximo de 2.000.000 para 1 s).

El aumento fue fijado a 2800, que fue empíricamente probado y seleccionado para el lector de placa específico utilizado para el establecimiento de este método. El ajuste de ganancia utilizado permite la grabación de máxima luz emitida por el bioluminiscente sistema de e. coli , p. mandapamensis 27561 y p. mandapamensis S1 sin exceso, pero para las cepas de p. mandapamensis TH1 y V. Ricque 14126 la ganancia era demasiado alta. Por lo tanto, estas cepas de este último excedan el límite de detección y no se puede medir la intensidad de la luz real máxima. Esta limitación técnica puede evitar la comparación de bacterias bioluminiscentes, que muestran variaciones alta emisión de luz máxima, aunque las condiciones de crecimiento y las densidades de célula podrían ser comparables.

Posicionamiento de las cepas bacterianas analizadas dentro de las placas bien usadas tiene que ser evaluadas empíricamente. Aunque se utilizaban placas bien negro con fondo de vidrio, observó interferencia entre las muestras. La intensidad de luz de cepas específicas es tan alta, que todos los pozos vecinos muestran falsas emisiones de luz positivas (por ejemplo, en blanco). Por lo tanto, es importante medir dos cepas diferentes, ya sea por separado o con una cierta separación espacial entre sí.

Ya hay muchos modificación cepas de e. coli se sabe que contienen partes de la operón lux y están principalmente orientados a la aplicación de15,16,17. Los métodos descritos aquí, tienen como objetivo la investigación fundamental, por ejemplo la posibilidad de analizar por separado cada gen lux . Aunque la investigación de bioluminescence tiene una larga historia, todavía hay muchas preguntas abiertas. Por excluyendo la introducción de genes del operón lux , intercambiando los genes luxAB con genes de otra cepa o analizar proteína complejos, incrustado en el fácil de manejar sistema de e. coli y otro uso de la placa Análisis del lector, es posible obtener más información sobre procesos de regulación y las funciones de los genes lux .

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Queremos agradecer Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) por su apoyo en el establecimiento de la escritura de la uno mismo-escrita para el lector de la placa. Este trabajo fue apoyado por el austriaco "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) a h (P24189) y el programa de doctorado "DK Molecular enzimología" (W901) a PM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NEBuilder Kit de clonación de ensamblaje de ADN de alta fidelidadNew England Biolabs Inc.E2621Spara 10 rxn
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polimerasa Thermo ScientificF530S
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidadNew England Biolabs Inc.M0491S Kit de
ADN genómico GeneJetThermo ScientificK0721para 50 rxn
Enzimas de restricción y tampón (NcoI, XhoI)New England Biolabs Inc.R3193S/R0146S
Wizard SV Kit de limpieza de gel y PCR PromegaA9282250 rxn
 Nueva Inglaterra Biolabs Inc.#T1020Spara 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit Thermo ScientificK0503para 250 rxn
GoTaq G2 DNA PolymerasePromegaM7841
Sensoplate negro de 24 pocillos con fondo de vidrioGreiner Bio One662892
FLUOStar Omega lector de placas BMG Labtech
Software de análisis OPTIMA/MarsBMG Labtechversión 2.20
Microsoft Excel 2010Microsoft
Multitron Standard Incubator ShakerInfors AG
purificación de para kit de extracción de gel de ADN Monarca de

Referencias

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