Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

Resumen

Aquí detallamos un método para obtener imágenes de células vivas de exocitosis regulada. Este método utiliza FITC-los dextranos, que se acumulan en orgánulos relacionados con los lisosomas, como reportero. Este sencillo método permite también distinguir entre los diferentes modos de exocitosis regulada en las células que son difíciles de manipular genéticamente.

Resumen

Regulada de la exocitosis es un proceso que carga, que se almacena en gránulos secretores (SGs), se libera en respuesta a un gatillo secretora. Regulada de la exocitosis es fundamental para la comunicación intercelular y es un mecanismo clave para la secreción de neurotransmisores, hormonas, mediadores inflamatorios y otros compuestos, por una variedad de células. Se conocen al menos tres mecanismos distintos para exocitosis regulada: exocitosis completo, donde un solo SG completamente se fusiona con la membrana plasmática, exocitosis de beso-y-run, donde un solo SG transitoriamente se fusiona con la membrana plasmática, y exocitosis compuesto, donde SGs varios fusionan, antes o después de la fusión de la SG con la membrana plasmática. El tipo de exocitosis regulada por una célula es dictado a menudo por el tipo de gatillo secretora. Sin embargo, en muchas células, un solo gatillo secretora puede activar varios modos de exocitosis regulada simultáneamente. A pesar de su abundancia e importancia a través de especies y tipos de la célula, los mecanismos que determinan los diferentes modos de secreción son en gran parte sin resolver. Uno de los principales retos en la investigación de los diferentes modos de exocitosis regulada, es la dificultad de distinguir entre ellos, así como exploración de por separado. Aquí describimos el uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como reportero de exocitosis y celular directo imágenes, para diferenciar entre las diferentes vías de exocitosis regulada, centrándose en la exocitosis compuesto, basado en la robustez y duración de los eventos exocíticas.

Introducción

Regulada de la exocitosis es el mecanismo primario por el cual carga fácilmente hecho es liberado de una célula secretora en respuesta a un disparador específico. La carga está preformada y secuestrada en vesículas secretoras, en la que se almacena hasta un relés la señal para la liberación del contenido de la SGs. Diferentes tipos de señales pueden resultar en diferentes modos de exocitosis regulada, o diferentes modos de exocitosis regulada pueden ocurrir simultáneamente. Se conocen tres modos principales de exocitosis regulada: exocitosis completo, que consiste en la fusión completa de un solo gránulo secretor con la membrana plasmática; exocitosis de beso-y-funcio....

Protocolo

1. preparaciones

1. Preparación de medios de cultivo RBL
   1. Mezclar 500 mL de glucosa baja Dulbecco había modificado medio de águila (DMEM) con 56 mL de suero bovino fetal (FBS), 5,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de la solución de L-glutamina 200 mM. Esto da lugar a glucosa baja DMEM suplementado con 10% FBS, estreptomicina 100 μg/mL, 100 unidades/mL de penicilina, 12 nistatina unidades/mL y 2 mM L-glutamina.
   2. Filtro de los medios de comunicación mediante el uso de un filtro de alto vacío de 0,22 μm tamaño de poro y tienda a 4 ° C.
2. Mantenimiento de las células RBL.
   1. Crecer las células ....

Resultados

Figura 1a se representa esquemáticamente cómo FITC-los dextranos pueden actuar como reportero para regulada de la exocitosis y recapitular los diferentes modos de eventos exocíticas. En primer lugar, las células se incuban con FITC-los dextranos, que es internalizado por pinocitosis y ordenados para el SGs. Puesto que el SGs de MCs LROs, su bajo pH amortigua la fluorescencia del FITC, se muestra gránulos negros (A-C, I). Cuando las células se activan por un s.......

Discusión

Aquí describimos cómo traza la fluorescencia de FITC-los dextranos en SGs puede utilizarse para capturar específicamente compuesto exocitosis eventos. Esto se logró mediante el ajuste del microscopio para adquirir una imagen cada 15 segundos, asegurando que se registrarán sólo eventos de larga duración en el tiempo y por lo tanto excluyendo eventos cortos que corresponderían a la exocitosis completo o exocitosis de beso-y-funcione. Para establecer el método, nos demostró caída de las Rab5 isoformas que se expresan en las.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM baja glucosa	Inducciones biológicas	01-050-1A
Suero fetal bovino	Gibco	12657
Pen-estreptococo-nistatina	solución Inducciones biológicas	03-032-1B
L-glutamina 200 mM solución	Inductos biológicos	03-020-1A
FITC dextrano 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Tripsina/EDTA Solución B	Inductores biológicos	03-052-1A	Calentar en 37 ° C baño de agua antes
de usar Filtro de vacío superior de 0,22 y micro; m tamaño de poro	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA Unidad de
filtro de jeringa de acetato de celulosa, 0,22 y micro; m tamaño de poro	Sartorius	16534K
Cubreobjetos con cámara	Thermo scientific	155411
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos de Corning	Sigma-Aldrich CLS430167
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A4503
IgE monoclonal anti-DNP	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Evite la exposición directa a la luz
Tampón Hepes 1M, pH 7.4	Inducciones biológicas	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucosa	BDH Laboratorios	284515V
Cloruro de amonio	MERK	1145
PIPAS sal dipotásica	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Hidrato	de acetato de calcioSigma-Aldrich	114460-21-8
Acetato de magnesio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M5661
Glutamato de potasio (ácido L-glutámico, sal de potasio monohidratado)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporador	Microscopio confocal BTX	ECM830
, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	utilizado en la Figura 3. Equipado con un microscopio confocal de incubación de corriente con control electrónico de temperatura
, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	utilizado en la Figura 2. Equipado con un detector de GaAsP, un incubador de corriente de aire electrónico controlado por temperatura
Microscopio confocal, Leica	Leica	SP5	utilizado en la Figura 1. Equipadas con un detector Leica HyD y una incubadora de etapa superior (okolab),
las células			RBL-2H3 se clonaron en el laboratorio de Reuben P. Siraganian. Ver referencia 67